一種快速定量檢測心臟型脂肪酸結合蛋白的均相熒光免疫試劑組及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗領域，具體設及一種快速定量檢測屯、臟型脂肪酸結合蛋白的 均相巧光免疫試劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 急性屯、肌梗死（AMI)的發(fā)病率及死亡率均很高，現代治療學認為，AMI發(fā)病后能迅 速得到確診并進行再灌注治療，對于降低死亡率及改善預后十分重要。WK)推薦的Affl的診 斷條件為：臨床癥狀、屯、電圖異常和生化指標等。但大約1/3的Affl病人早期臨床癥狀不典 型，約50%的病人屯、電圖不能出現特征性ST段改變，所W在此期的診斷來說一個靈敏又有 特異性的屯、肌指標尤為重要。
[000引 屯、臟型脂肪酸結合蛋白（Heart fatty acid binding protein, H-FAB巧是一族 分子量為14-16kD的胞內蛋白質，至少有肝、小腸、屯、、腦、腎、骨骼肌、脂肪組織、回腸、表皮 9種類型，各型之間具有不同的免疫學差別。H-FABP是存在于屯、肌細胞胞漿內的可溶性蛋 白質，分子量15kD，占屯、肌內蛋白含量的（4 + 8)%，由132個氨基酸構成，呈酸性（pI5)，參 與細胞脂肪酸的攝取、轉運和代謝。屯、肌胞漿與血液中的比值為200000:1。在骨骼肌的濃 度不到屯、肌里的十分之一，在遠端腎小管、腦組織的特殊部位、乳腺、胎盤內含量更低。而肌 紅蛋白在骨骼肌的濃度是屯、肌里的兩倍。正常條件下血流中幾乎檢測不到H-FABP，極微量 的H-FABP可能與破壞的骨骼肌持續(xù)釋放H-FABP有關，在屯、肌細胞受損時，細胞膜完整性受 到破壞，H-FABP透過受損細胞膜進入外周血循環(huán)，使其血中H-FABP含量升高，1.化開始升 高、化達到高峰、2化降至正常。該一特性使得H-FABP成為檢測屯、肌損傷早期生化標志物。 因與其它FABP在免疫學上具有特異性，不會發(fā)生交叉反應，故對屯、肌損傷的診斷特異性較 強。另外，H-FABP通過腎臟代謝，W原形排出，所W腎功能不全時血里H-FABP的濃度會升 局。
[0004] 目前研究已證實H-FABP對微小屯、肌損傷敏感，檢測血漿H-FABP水平可作為反映 屯、肌不可逆損傷的生化標志物，與屯、肌損害的程度成正相關，此將為臨床法醫(yī)學對微小屯、 肌損傷及外傷性屯、肌梗死的判定及預后屯、功能的診斷提供一靈敏性客觀指標，在臨床法醫(yī) 檢案中有重要的應用價值。
[0005] 國外較常應用的有Rapicheck和CardioDetect兩種定性檢測試劑盒，10-15min內 得到結果。Latera^f low是一種準確度更高的定量檢測方法，2003年用于臨床，15min得到 結果。W上檢驗方法簡易快捷，節(jié)約時間和費用，不需要特殊檢測設備，值得臨床推廣。夾 屯、酶免法應用兩個來源不同的抗人H-FABP的抗體，分別做固相和液相結合抗體，臨床常用 有一步法和兩步法。優(yōu)點為檢測結果準確，與骨骼肌蛋白、肌紅蛋白、肌漿球蛋白、肌巧蛋白 無交叉反應、不需大型儀器，費用合理，缺點是用時較長，需時45-90min，不利于超早期AMI 的診斷及進一步處理。
[0006] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在時間分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技術的基礎上形成的一種新的巧光免 疫分析技術。TRFIA技術采用的巧光物質與傳統(tǒng)的巧光染料完全不同，采用的是銅系元素 館巧U)、得（Tb)等作為巧光材料，靈敏度非常高，穩(wěn)定性好，低溫條件可保存=年，因而成 為二十一世紀最熱口的免疫分析技術。
[0007] 均相巧光免疫檢測法是用同一抗原的兩個抗體分別標記化和巧光染料 Alexa647?；瘶擞浛贵w在游離狀態(tài)時，受到340nm光線激發(fā)，只發(fā)射平均波長為615nm 巧光，而在抗原、抗體復合物形成時，發(fā)生能量傳遞，激發(fā)巧光染料Alexa647發(fā)射出665nm 巧光。標記抗體直接與待測樣品進行抗原、抗體反應，如果能形成抗原、抗體復合物，則在 665nm出可測得巧光信號。該種方法省卻了酶聯免疫法反復解育和洗板等煩瑣操作步驟，幾 分鐘就能獲得結果，省時省力。并且，此法也相應地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境 等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復性都較好，能較真實地反映被測物質的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647該對巧光物質的最大發(fā)射光波長之間相差較大，未發(fā)生抗原抗體反應的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特異性物質產生的300?500nm巧光，不能激發(fā)Alexa647發(fā)射 巧光信號650nm激發(fā)光。因此非特異性巧光非常低。
[000引本發(fā)明采用均相巧光免疫快速檢測技術，利用巧光的高靈敏特點，同樣也避免了 膠體金或者巧光H-FABP干式免疫試紙中的硝酸纖維素膜本身孔隙不均一特性對檢測準確 度和重復性的不良影響。由于均相巧光免疫檢測中樣品與巧光標記抗體全過程都在液相中 全面接觸，反應充分，因此可大幅度提高檢測靈敏度和線性范圍，同時反應在液相進行也增 加了樣品的稀釋倍數，消除了樣品的基質效應影響，使定量結果有很好的可重復性，提高了 定量結果的精密度和準確度，可滿足臨床診斷大規(guī)模檢測的要求。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現有H-FABP檢測技術的不足，提供一種快速定量檢測 H-FABP的均相巧光免疫試劑組。本發(fā)明根據巧光免疫技術特點和H-FABP抗原抗體系統(tǒng)特 點，設計新的原材料，試劑和工藝流程，應用本發(fā)明提供的試劑組檢測H-FABP水平，具有簡 單，快速，靈敏和特異性好等特點，可同時定量檢測高值和低值樣品，并且性價比高，適用于 臨床快速檢測。
[0010] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種快速定量檢測屯、臟型脂肪酸結合蛋白的均 相巧光免疫試劑組，包括稀±元素馨合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體 (anti-FABP)、近紅外巧光化合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體和系列濃度 的屯、臟型脂肪酸結合蛋白校準品。
[0011] 優(yōu)選地，稀上元素馨合物為化馨合物。
[001引更優(yōu)選地，稀±元素馨合物為BHHCT-化或1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-對節(jié)基）-4-氯橫酷基苯與館（III)的配合物炬HHBCB-Eu3+)。
[0013] 優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物為Alexa系列近紅外巧光化合物、DyLi曲t系列近 紅外巧光化合物和CF系列近紅外巧光化合物中的至少一種。
[0014] 更優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 種。
[0015] 優(yōu)選地，所述系列濃度的屯、臟型脂肪酸結合蛋白校準品由校準品稀釋液稀釋屯、臟 型脂肪酸結合蛋白配制而成，所述校準品稀釋液為含0. 01-0. 5wt%陽G800、l-5wt% BSA、 5-20wt%甘油、0. 01-0. 05wt%表面活性劑的MOPS緩沖液。
[0016] 屯、臟型脂肪酸結合蛋白校準品可用塑料瓶密封包裝。
[0017] 本發(fā)明的第二個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的均相巧光免疫試劑組的制 備方法，包括W下步驟：
[0018] 1)稀±元素馨合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的制備：
[0019] 取0. 5-5mg/ml的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體溶液，加入0. 05-0. 5mol/ L的Na肥〇3溶液后，調抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配體化合物溶液，攬拌反應 0.6-2h，分離得到配體化合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體，加入終濃度為 0. 05-0. 5wt %的BSA和0. 01-lwt %的NaNs，調抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入化溶液， 使配體化合物與化等摩爾濃度，即得，其中，抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體溶液、 NaHC〇3溶液和配體化合物溶液的體積比為0.1-1 : 1 : 0.01-0.05;
[0020] 2)近紅外巧光化合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體的制備：
[0021] 將抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀釋至 0. 5-5mg/ml，加入近紅外巧光化合物溶解液，攬勻，室溫解育0. 5-化，分離得到近紅外巧光 化合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體；
[0022] 3)系列濃度的屯、臟型脂肪酸結合蛋白校準品的制備：
[0023] 將屯、臟型脂肪酸結合蛋白用校準品稀釋液稀釋配制成系列濃度，即得，
[0024] 其中，1)、2)和3)的順序可W任意顛倒。
[0025] 其中，稀±元素馨合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體用于免疫分析 時，用標記物稀釋液稀釋使用，2-8°C分裝保存。
[0026] 其中，近紅外巧光化合物標記的抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體用磯酸鹽緩 沖液稀釋，2-6 °C保存。
[0027] 其中，屯、臟型脂肪酸結合蛋白校準品2-6°C保存。
[002引優(yōu)選地，抗屯、臟型脂肪酸結合蛋白單克隆抗體在于配體化合物反應之前，先進行 透析處理。
[0029] 優(yōu)選地，步驟1)中配體化合物為BHHCT或BHHBCB。
[0030] 優(yōu)選地，步驟1)中分離得到配體化合物標記的anti-FABP通過離屯、和柱層析方式 進行。柱層析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脫。
[0031] 優(yōu)選地，步驟2)中，分離得到近紅外巧光化合物標記的anti-FABP通過柱層析的 方式進行。
[0032] 進一步優(yōu)選地，步驟2)中，柱層析采用G25凝膠柱。
[003引優(yōu)選地，步驟2)中，室溫解育時，每隔10-20min混勻一次。
[0034] 本發(fā)明的均相巧光免疫試劑的使用；先將稀±元素馨合物標記的anti-FABP溶液 加入反應微孔中，再加入近紅外巧光化合物標記的anti-FABP溶液，最后分別加入H-FABP 校準品和臨床檢測樣品，37°C反應20分鐘后，用均相巧光免疫分析儀檢測判讀結果。
[0035] 本發(fā)明提供的快速定量檢測屯、臟型脂肪酸結合蛋白的均相巧光免疫試劑組，其反 應原理為雙抗體夾屯、法的均相巧光免疫法。待測樣品與適當比例的稀±元素（例如化 3+) 和巧光標記抗體在液相均質介質中充分混和均勻，在此過程中樣品中的H-FABP既能專一 性地與稀±元素標記的抗H-FABP抗體充分結合，也能與巧光標記的H-FABP抗體充分反應， 形成"稀±元素-anti-FABP-FABP-anti-FABP-巧光化合物"免疫復合物，巧光強度可用 專