專(zhuān)利名稱(chēng)：肌生成抑制素結(jié)合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及與肌生成抑制素(myosatin)結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白例如抗體、編碼所述抗原結(jié)合蛋白的多核苷酸、包含所述抗原結(jié)合蛋白的藥物組合物和制備方法。本發(fā)明亦涉及所述抗原結(jié)合蛋白在治療或預(yù)防與降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中的任一種或組合有關(guān)的疾病的用途。
背景技術(shù)：
肌生成抑制素亦稱(chēng)為生長(zhǎng)和分化因子(⑶F-8)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β (TGF-β)超家族的成員，是肌肉質(zhì)量的負(fù)調(diào)節(jié)物。肌生成抑制素在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，人、雞、小鼠和大鼠序列在成熟C-末端結(jié)構(gòu)域?yàn)?00%相同。肌生成抑制素作為前體蛋白合成，所述前體蛋白含有信號(hào)序列、前肽結(jié)構(gòu)域和C-末端結(jié)構(gòu)域。分泌的肌生成抑制素的循環(huán)形式包括活性成熟C-末端結(jié)構(gòu)域和無(wú)活性形式，所述無(wú)活性形式包含在與前肽結(jié)構(gòu)域和/或其它抑制蛋白相關(guān)的潛在復(fù)合物中的成熟C-末端結(jié)構(gòu)域。有多種與降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能相關(guān)的不同疾病、病癥和病況。增加鍛煉和較好的營(yíng)養(yǎng)是用于治療所述疾病的目前療法的支柱。很遺憾，由于患者方面不能堅(jiān)持和順從，增加身體活動(dòng)的益處很少被認(rèn)識(shí)到。對(duì)于某些患者鍛煉亦可能困難、疼痛或辦不到。此外，可能存在與鍛煉有關(guān)的肌肉用力不足而不能對(duì)肌肉產(chǎn)生任何有益作用。營(yíng)養(yǎng)介入只有在隱含飲食缺陷且患者有恰當(dāng)?shù)氖秤麜r(shí)有效。由于這些限制，對(duì)于與肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中的任一種或組合降低相關(guān)的疾病的治療，基本上不能滿(mǎn)足獲得更廣泛利益的需求。業(yè)已闡述肌生成抑制素抗體(W02008/030706、WO 2007/047112、WO 2007/044411、WO 2006/116269、WO 2005/094446、WO 2004/037861、WO 03/027248 和 WO 94/21681)。Wagner 等(Ann Neurol. (2008)63(5) :561-71)亦闡述當(dāng)用所述抗-肌生成抑制素抗體之一時(shí)，未改善成年人肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、面肩肱型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和肢節(jié)型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥)中肌肉力量或功能的探索性終點(diǎn)。因此，仍然需要用于治療或預(yù)防與肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中的任一種或組合降低相關(guān)的疾病的更有效療法。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白。所述抗原結(jié)合蛋白可用于治療或預(yù)防與降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中的任一種或組合相關(guān)的疾病。本發(fā)明提供與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，其包含SEQ ID NO 3的 CDRH3 或變體 CDRH3。本發(fā)明亦提供與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，其包含SEQ ID NO 7 的可變結(jié)構(gòu)域序列的對(duì)應(yīng)CDRH3或其變體CDRH3。 本發(fā)明亦提供與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，其包括包含SEQ ID
NO 7的95-101位Kabat殘基的結(jié)合單位H3或變體H3。 本發(fā)明亦提供與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，其包含
⑴選自SEQ ID NO :7或SEQ ID NO 25的重鏈可變區(qū)；禾口 /或選自SEQ ID NO 8 或SEQ ID NO :21的輕鏈可變區(qū)；或具有75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)；或(ii) SEQ ID NO 26 重鏈；禾口 / 或選自 SEQ ID NO 27 或 SEQ ID NO 37 的輕鏈；或具75%或更高序列同一性的變體重鏈或輕鏈。本發(fā)明亦提供與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，其包含(i)選自SEQ ID NO 12、13或14中任一種的重鏈可變區(qū)；和/或選自SEQ ID NO: 15、16、17、18或M中任一種的輕鏈可變區(qū)；或具75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)；或(ii)選自SEQ ID NO :28、四、30、98或99中任一種的重鏈；和/或選自SEQ ID NO: 31、32、33、34或40中任一種的輕鏈；或具75%或更高序列同一性的變體重鏈或輕鏈。本發(fā)明亦提供編碼本文所定義的抗原結(jié)合蛋白的核酸分子。本發(fā)明亦提供包含本文所定義的核酸分子的表達(dá)載體。本發(fā)明亦提供包含本文所定義的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明亦提供用于制備本文所定義的抗原結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)如上所定義的宿主細(xì)胞和回收抗原結(jié)合蛋白的步驟。本發(fā)明亦提供包含本文所定義的抗原結(jié)合蛋白和藥用載體的藥物組合物。本發(fā)明亦提供治療罹患降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和/或肌肉功能的疾病的受試者的方法，所述方法包括給予本文所定義的抗原結(jié)合蛋白的步驟。本發(fā)明提供治療罹患以下疾病的受試者的方法少肌癥(sarcopenia)、惡病質(zhì)、 肌肉萎縮、廢用性肌肉萎縮、HIV、AIDS、癌癥、外科手術(shù)、燒傷、肌肉骨頭或神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷、 肥胖癥、糖尿病(包括II型糖尿病)、關(guān)節(jié)炎、慢性腎衰竭(CRF)、末期腎病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、選擇性關(guān)節(jié)修復(fù)(elective joint repair), 多發(fā)性硬化病(MQ、中風(fēng)、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(muscular dystrophy)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、脂肪酸肝病(fatty acid liver disease)、肝硬化、阿狄森病(Addison，s disease)、庫(kù)欣病(Cushing，s diease)、急性呼吸窘迫綜合征、類(lèi)固醇誘導(dǎo)的肌肉萎縮、肌炎或脊柱側(cè)凸，所述方法包括給予本文所述抗原結(jié)合蛋白的步驟。本發(fā)明提供在受試者中增加肌肉質(zhì)量、增加肌肉力量和/或改進(jìn)肌肉功能的方法，所述方法包括給予本文所定義的抗原結(jié)合蛋白的步驟。本發(fā)明提供本文所述抗原結(jié)合蛋白用于治療罹患降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中任一種或組合的疾病的受試者。本發(fā)明提供本文所述抗原結(jié)合蛋白在治療以下疾病中的用途少肌癥、惡病質(zhì)、肌肉萎縮、廢用性肌肉萎縮、HIV、AIDS、癌癥、外科手術(shù)、燒傷、肌肉骨頭或神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷、肥胖癥、糖尿病(包括II型糖尿病)、關(guān)節(jié)炎、慢性腎衰竭(CRF)、末期腎病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、選擇性關(guān)節(jié)修復(fù)、多發(fā)性硬化病(MQ、中風(fēng)、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、庫(kù)欣氏肌肉萎縮、肌炎或脊柱側(cè)凸。本發(fā)明提供本文所述抗原結(jié)合蛋白在受試者中增加肌肉質(zhì)量、增加肌肉力量和/ 或改進(jìn)綜合征、急性呼吸窘迫綜合征、類(lèi)固醇誘導(dǎo)的肌肉功能的方法中的用途。
本發(fā)明提供本文所述抗原結(jié)合蛋白在制備用于治療罹患降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中任一種或組合的疾病的受試者的藥物中的用途。本發(fā)明提供本文所述抗原結(jié)合蛋白在制備用于治療以下疾病的藥物中的用途少肌癥、惡病質(zhì)、肌肉萎縮、廢用性肌肉萎縮、HIV、AIDS、癌癥、外科手術(shù)、燒傷、肌肉骨頭或神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷、肥胖癥、糖尿病(包括II型糖尿病)、關(guān)節(jié)炎、慢性腎衰竭(CRF)、末期腎病 (ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、選擇性關(guān)節(jié)修復(fù)、多發(fā)性硬化病 (MS)、中風(fēng)、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、庫(kù)欣氏肌肉萎縮、肌炎或脊柱側(cè)凸。本發(fā)明提供本文所述抗原結(jié)合蛋白在制備用于在受試者中增加肌肉質(zhì)量、增加肌肉力量和/或改進(jìn)綜合征、急性呼吸窘迫綜合征、類(lèi)固醇誘導(dǎo)的肌肉功能的方法的藥物中的用途。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示純化的成熟肌生成抑制素的LC/MS分析預(yù)測(cè)的分子量(MW) 12406. 25Da, 觀察到的MW 24793. 98Da，這表明含9對(duì)二硫鍵的二聚體化分子與含9個(gè)半胱氨酸殘基的預(yù)測(cè)的肌生成抑制素單體匹配。圖2顯示含MOPS緩沖液的4-12% NuPAGE Bis-Tris凝膠。第1道用DTT還原的成熟肌生成抑制素。第2道不用DTT的非還原性成熟肌生成抑制素。第3道:Mark 12 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。圖3A顯示劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，其顯示了肌生成抑制素(R&D Systems和內(nèi)部(in house)肌生成抑制素種類(lèi))誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，這導(dǎo)致6小時(shí)后在A204細(xì)胞中以劑量依賴(lài)方式表達(dá)熒光素酶。圖3B顯示劑量反應(yīng)曲線(xiàn)，其顯示了內(nèi)部肌生成抑制素誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，這導(dǎo)致于不同測(cè)試時(shí)刻在A204細(xì)胞中以劑量依賴(lài)方式表達(dá)熒光素酶，其由在不同天數(shù)所獲得的數(shù)據(jù)來(lái)表示。圖4顯示通過(guò)ELISA測(cè)定的10B3與成熟肌生成抑制素、潛在復(fù)合物(latent complex)和從潛在復(fù)合物釋放的成熟肌生成抑制素的結(jié)合。圖5顯示10B3和10B3嵌合體對(duì)肌生成抑制素結(jié)合ActRIIb的抑制。圖6顯示10B3和10B3嵌合體抑制肌生成抑制素誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，這導(dǎo)致降低A204細(xì)胞中的熒光素酶表達(dá)。圖7顯示10B3在體內(nèi)對(duì)小鼠體重(A)和瘦肉質(zhì)量⑶的影響。圖8顯示10B3在體內(nèi)對(duì)小鼠腓腸肌(A)、四頭?、呛椭洪L(zhǎng)伸肌(EDL) (C)肌肉質(zhì)
量的影響。圖9顯示10B3對(duì)離體EDL肌肉收縮性的影響，其顯示強(qiáng)直性張力(A)和通過(guò)肌肉質(zhì)量校正的強(qiáng)直性張力(B)。圖IOA顯示通過(guò)ELISA測(cè)定的人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體(在CHOKl上清液中)和10B3C與肌生成抑制素結(jié)合。圖IOB源自圖10A，顯示含有H2和/或L2鏈及 10B3嵌合體的抗體。圖11顯示通過(guò)ELISA測(cè)定的純化的H0L0、H1L2和H2L2人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體和10B3C與肌生成抑制素結(jié)合。圖12顯示10B3、10B3C、H0L0和H2L2抑制肌生成抑制素-誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活，其導(dǎo)致在A204細(xì)胞中表達(dá)熒光素酶。圖 13 顯示通過(guò) ELISA 測(cè)定的純化的 H2L2-NMD、H2L2-N54Q, H2L2-C91S、 H2L2-N54D-C91S和H2L2-NMQ-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體、H2L2和 10B3C (HCLC)與肌生成抑制素結(jié)合。圖 14 顯示通過(guò) ELISA 測(cè)定的純化的 H2L2-NMQ、H2L2-C91S、H2L2_NMQ-C91S 人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體、H2L2、HOLO和10B3C (HCLC)與肌生成抑制素結(jié)合。圖15顯示H2L2-NMQ、H2L2-C91S、H2L2-NMQ-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體、H0L0、H2L2和10B3C對(duì)肌生成抑制素-誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的抑制，其導(dǎo)致在 A204細(xì)胞中表達(dá)熒光素酶。圖16顯示在用或不用碳酸氫銨處理抗體后H2L2人源化的抗-肌生成抑制素抗體與肌生成抑制素的結(jié)合，所述碳酸氫銨處理可誘導(dǎo)抗體脫酰胺。圖17顯示在用或不用碳酸氫銨處理抗體后H2L2-N54Q人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體與肌生成抑制素的結(jié)合，所述碳酸氫銨處理可誘導(dǎo)抗體脫酰胺。圖18顯示在用或不用碳酸氫銨處理抗體后H2L2-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體與肌生成抑制素的結(jié)合，所述碳酸氫銨處理可誘導(dǎo)抗體脫酰胺。圖19顯示在用或不用碳酸氫銨處理抗體后H2L2-NMQ-C91S人源化的抗-肌生成抑制素抗體變體與肌生成抑制素的結(jié)合，所述碳酸氫銨處理可誘導(dǎo)抗體脫酰胺。圖20顯示在用或不用碳酸氫銨處理抗體后HOLO人源化的抗-肌生成抑制素抗體與肌生成抑制素的結(jié)合，所述碳酸氫銨處理可誘導(dǎo)抗體脫酰胺。圖21顯示在肌生成抑制素捕獲ELISA中11種親和純化的⑶RH3變體的結(jié)合活性； H2L2-C91S、HOLO, HcLc (10B3嵌合體)和陰性對(duì)照單克隆抗體(用作對(duì)照抗體)。圖22顯示在肌生成抑制素結(jié)合ELISA中5種親和純化的⑶RH2變體的的結(jié)合活性；H2L2-C91S_F100G_Y、H2L2-C91S、HcLc (10B3嵌合體)和陰性對(duì)照單克隆抗體(用作對(duì)照抗體)。圖23顯示在第0天-第25天10B3和對(duì)照抗體治療對(duì)荷有C46腫瘤的小鼠體重的影響。圖M顯示10B3和對(duì)照抗體治療對(duì)荷有C46腫瘤的小鼠的總身體脂肪(A)、附睪脂肪墊⑶和瘦肉質(zhì)量(C)的影響。圖25顯示10B3和對(duì)照抗體治療對(duì)下肢肌肉力量的影響，其通過(guò)電刺激荷有C46 腫瘤的小鼠大腿中區(qū)的坐骨神經(jīng)時(shí)的收縮力來(lái)測(cè)量。圖沈顯示在假手術(shù)和割腱手術(shù)中10B3和對(duì)照抗體治療對(duì)小鼠脛骨前肌(TA)肌肉的影響。發(fā)明詳述本發(fā)明提供與肌生成抑制素例如同型二聚體成熟肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白?？乖Y(jié)合蛋白可結(jié)合并中和肌生成抑制素，例如人肌生成抑制素?？乖Y(jié)合蛋白可為抗體，例如單克隆抗體。肌生成抑制素和⑶F-8 二者都指以下任何一種肌生成抑制素的全長(zhǎng)未經(jīng)加工的前體形式；呈潛在及非潛在(活性)形式的成熟肌生成抑制素，其因翻譯后裂解C-末端結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)肌生成抑制素亦指保留與肌生成抑制素有關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的肌生成抑制素的任何片段和變體。肌生成抑制素的全長(zhǎng)未經(jīng)加工的前體形式包含前肽及形成成熟蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域，含或不含信號(hào)序列。亦已知肌生成抑制素前肽加C-末端結(jié)構(gòu)域?yàn)槎嗟鞍?。肌生成抑制素前體可作為單體或同型二聚體存在。成熟肌生成抑制素為從肌生成抑制素前體蛋白的C-末端裂解的蛋白，亦稱(chēng)為 C-末端結(jié)構(gòu)域。成熟的肌生成抑制素可作為單體、同型二聚體或以肌生成抑制素潛在復(fù)合物存在。成熟的肌生成抑制素可視條件而確立這些不同的形式組合之間的平衡。人、雞、小鼠和大鼠肌生成抑制素的成熟C-末端結(jié)構(gòu)域序列具有100%的同一性(參見(jiàn)例如SEQ ID NO :104)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白與SEQ ID NO :104中所示的同型二聚體成熟肌生成抑制素結(jié)合。肌生成抑制素前肽為從切割信號(hào)序列后的肌生成抑制素前體蛋白的N-末端結(jié)構(gòu)域切割的多肽。前肽亦稱(chēng)為潛在相關(guān)肽(latency-associated peptide, LAP) 0肌生成抑制素前肽能夠與成熟肌生成抑制素上的前肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域非共價(jià)結(jié)合。人前肽肌生成抑制素序列的實(shí)例提供在SEQ ID NO :108中。肌生成抑制素潛在復(fù)合物為在成熟肌生成抑制素與肌生成抑制素前肽或其它肌生成抑制素結(jié)合蛋白之間形成的蛋白復(fù)合物。例如，兩個(gè)肌生成抑制素前肽分子可與兩個(gè)成熟肌生成抑制素分子締合，形成無(wú)活性的四聚體潛在復(fù)合物。肌生成抑制素潛在復(fù)合物可包括代替肌所述生成抑制素前肽中的一個(gè)或兩個(gè)的其它肌生成抑制素結(jié)合蛋白，或除所述肌生成抑制素前肽中的一個(gè)或兩個(gè)之外還包括其它肌生成抑制素結(jié)合蛋白。其它肌生成抑制素結(jié)合蛋白實(shí)例包括促濾泡素抑制素(follistatin)、促濾泡素抑制素相關(guān)基因 (FLRG)和生長(zhǎng)及分化因子相關(guān)血清蛋白1 (GASP-I)。肌生成抑制素抗原結(jié)合蛋白可結(jié)合肌生成抑制素的前體形式、成熟形式、單體形式、二聚體形式、潛在形式和活性形式中的任一種或任意組合?？乖Y(jié)合蛋白可結(jié)合呈其單體和/或二聚體形式的成熟肌生成抑制素。當(dāng)肌生成抑制素為與前肽和/或促濾泡素抑制素的復(fù)合物時(shí)，抗原結(jié)合蛋白可與其結(jié)合或不與其結(jié)合?；蛘撸?dāng)肌生成抑制素為與促濾泡素抑制素相關(guān)基因(FLRG)和/或生長(zhǎng)和分化因子相關(guān)血清蛋白I(GASP-I)的復(fù)合物時(shí)，抗原結(jié)合蛋白可與其結(jié)合或不與其結(jié)合。例如，抗原結(jié)合蛋白與成熟二聚體肌生成抑制素結(jié)合。本文所用術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合蛋白"指能夠與肌生成抑制素結(jié)合的抗體、抗體片段和其它蛋白構(gòu)建體，例如結(jié)構(gòu)域。本文所用術(shù)語(yǔ)"抗體"以其最廣泛的意義指具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的分子，并包括單克隆抗體、重組抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體和異源綴合物抗體；單可變結(jié)構(gòu)域、結(jié)構(gòu)域抗體、抗原結(jié)合片段、免疫學(xué)有效片段、單鏈Fv、雙抗體、 Tandabs 等(對(duì)于可供選擇的〃抗體〃樣式的綜述，參見(jiàn)Holliger和Hudson，Nature Biotechnology，2005，第 23 卷，第 9 期，1126-1136)。短語(yǔ)"單可變結(jié)構(gòu)域"指抗原結(jié)合蛋白可變結(jié)構(gòu)域(例如VH、VHH、\)，其可特異性結(jié)合抗原或結(jié)合獨(dú)立于不同的可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域的表位。可認(rèn)為"結(jié)構(gòu)域抗體"或"dAb"與"單可變結(jié)構(gòu)域"相同，其能夠結(jié)合抗原。單可變結(jié)構(gòu)域可為人抗體可變結(jié)構(gòu)域，但亦包括來(lái)自其它物種的單抗體可變結(jié)構(gòu)域，例如嚙齒動(dòng)物(例如如WO 00/29004中所揭示)、絞口鯊(nurse shark)和駱駝科(Camelid) Vhh dAb。駱駝科源自包括駱駝、美洲駝(llama)、羊駝(alpaca)、單峰駱駝(dromedary)和原駝(guanaco)在內(nèi)的物種的免疫球蛋白單可變結(jié)構(gòu)域多肽，所述物種產(chǎn)生天然缺乏輕鏈的重鏈抗體。所述Vhh結(jié)構(gòu)域可按照本領(lǐng)域可獲得的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)人源化，認(rèn)為所述結(jié)構(gòu)域?yàn)椤?結(jié)構(gòu)域抗體"。本文所用Vh包括駱駝科Vra結(jié)構(gòu)域。本文所用術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"指具有獨(dú)立于蛋白質(zhì)的其余部分的四級(jí)結(jié)構(gòu)的折疊蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域通常負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的不相關(guān)聯(lián)的功能性質(zhì)，在很多情況下可將其加入、移走或轉(zhuǎn)移到其它蛋白質(zhì)，而不丟失蛋白質(zhì)和/或結(jié)構(gòu)域的其余部分的功能?！皢慰勺兘Y(jié)構(gòu)域"為包含抗體可變結(jié)構(gòu)域序列特性的折疊多肽結(jié)構(gòu)域。因此，其包括完全抗體可變結(jié)構(gòu)域和經(jīng)修飾的可變結(jié)構(gòu)域，例如，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)被以下序列取代不具有抗體可變結(jié)構(gòu)域特性的序列；或業(yè)已被截平或包含N-或C-末端延伸的抗體可變結(jié)構(gòu)域；以及保留至少全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合活性和特異性的可變結(jié)構(gòu)域的折疊片段。結(jié)構(gòu)域可結(jié)合抗原或結(jié)合獨(dú)立于不同的可變區(qū)或結(jié)構(gòu)域的表位?？山柚诜强贵w蛋白質(zhì)支架例如結(jié)構(gòu)域上安排一個(gè)或多個(gè)CDR來(lái)提供抗原結(jié)合片段。非抗體蛋白質(zhì)支架或結(jié)構(gòu)域?yàn)榻?jīng)過(guò)蛋白質(zhì)工程改造以獲得與不同于其天然配體的配體結(jié)合的蛋白質(zhì)支架或結(jié)構(gòu)域，例如作為選自以下的支架的衍生物的結(jié)構(gòu)域 CTLA-4(Evibody)；脂籠蛋白(lipocalin)；源自蛋白A的分子例如蛋白A的Z-結(jié)構(gòu)域 (Affibody, SpA)、A-結(jié)構(gòu)域(Avimer/Maxibody)；熱休克蛋白例如 GroEl 和 GroES ；轉(zhuǎn)鐵蛋白(穿膜抗體(transbody))；錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)；肽適體；C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(四連接素(Tetranectin))；人Y -晶體蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ結(jié)構(gòu)域；人蛋白酶抑制劑的蝎毒素kimitz型結(jié)構(gòu)域；和纖連蛋白(adnectin)；它們業(yè)已經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)工程改造以實(shí)現(xiàn)與不同于其天然配體的配體結(jié)合。CTLA-4 (細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4)為主要在⑶4+T細(xì)胞上表達(dá)的⑶觀-家族受體。其胞外結(jié)構(gòu)域具有可變結(jié)構(gòu)域樣Ig折疊。對(duì)應(yīng)于抗體CDR的環(huán)可被異源序列取代，以提供不同的結(jié)合特性。工程改造為具有不同的結(jié)合特異性的CTLA-4分子亦被稱(chēng)為 Evibodies。進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn) Journal of Immunological Methods 248(1-2)， 31-45(2001)。脂籠蛋白為運(yùn)輸小疏水分子(例如類(lèi)固醇、后膽色素、類(lèi)視黃醇和脂類(lèi))的細(xì)胞外蛋白質(zhì)家族。它們具有在規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonical structure)的開(kāi)放末端有多個(gè)環(huán)的剛性β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)，可將其工程改造以結(jié)合不同的靶標(biāo)抗原。Anticalin大小為160-180 個(gè)氨基酸，源自脂籠蛋白。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn)Biochim Biophys Acta 1482 337-350(2000)、US7250297B1和 US20070224633。Affibody是源自金黃色葡萄球菌蛋白A的支架，可將其進(jìn)行工程改造以結(jié)合抗原。結(jié)構(gòu)域由大約58個(gè)氨基酸的3個(gè)螺旋束組成。通過(guò)讓表面殘基隨機(jī)化產(chǎn)生文庫(kù)。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn) Protein Eng. Des. Sel. 17,455-462(2004)和 EP1641818A1。Avimer是源自A-結(jié)構(gòu)域支架家族的多結(jié)構(gòu)域蛋白。大約35個(gè)氨基酸的天然結(jié)構(gòu)域采取限定的二硫化物鍵合的結(jié)構(gòu)。通過(guò)A-結(jié)構(gòu)域家族展示的天然變異穿梭來(lái)產(chǎn)生多樣性。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn) Nature Biotechnology 23 (12)，1556-1561 (2005)和 Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917(2007 年 6 月)。
轉(zhuǎn)鐵蛋白為單體血清轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白?？赏ㄟ^(guò)在容許的表面環(huán)插入例如一個(gè)或多個(gè) CDR肽序列，將轉(zhuǎn)鐵蛋白進(jìn)行工程改造以結(jié)合不同的靶標(biāo)抗原。工程改造的轉(zhuǎn)鐵蛋白支架實(shí)例包括穿膜抗體。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn)J. Biol. Chem 274，24066-24073 (1999)。設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)源自介導(dǎo)完整膜蛋白與細(xì)胞骨架連接的蛋白質(zhì)家族的錨蛋白。單錨蛋白重復(fù)為由兩個(gè)α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角組成的33個(gè)殘基模體?？赏ㄟ^(guò)以下方法對(duì)其進(jìn)行工程改造以結(jié)合不同的靶標(biāo)抗原使每一個(gè)重復(fù)的第一個(gè)α-螺旋和轉(zhuǎn)角處的殘基隨機(jī)化；或插入肽序列，例如一個(gè)或多個(gè)CDR。可通過(guò)增加模塊數(shù)量來(lái)增加其結(jié)合界面(親和力成熟的方法)。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn)J. Mol. Biol. 332， 489-503 (2003)、PNAS 100(4)，1700-1705 (2003)和 J. Mol. Biol. 369，1015-1028 (2007)和 US20040132028A1。纖連蛋白為可進(jìn)行工程改造以結(jié)合抗原的支架。Adnectin由人纖連蛋白III型 (FN3)的15個(gè)重復(fù)單位的第10個(gè)結(jié)構(gòu)域的天然氨基酸序列骨架組成?？蓪?duì)β-夾層的一端的三個(gè)環(huán)進(jìn)行工程改造以使Adnectin特異性識(shí)別目的治療靶標(biāo)。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn) Protein Eng. Des. Sel. 18,435-444(2005)、US20080139791、W02005056764 和 US6818418B1。肽適體是由恒定支架蛋白組成的組合型的識(shí)別分子，其通常為含有在活性位點(diǎn)插入的限定的可變肽環(huán)的硫氧還蛋白(TrxA)。關(guān)于進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn)Expert Opin. Biol. Ther. 5，783-797(2005)。微抗體源自天然存在的25-50個(gè)氨基酸長(zhǎng)的微蛋白，其含有3-4半胱氨酸橋；微蛋白質(zhì)實(shí)例包括KalataBl和芋螺毒素和打結(jié)素(knottin)。微蛋白具有可工程改造以包括至多25個(gè)氨基酸而不影響所述微蛋白的總折疊的環(huán)。關(guān)于工程改造的打結(jié)素結(jié)構(gòu)域的進(jìn)一步的詳細(xì)資料參見(jiàn)W02008098796。其它結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括一直用作工程改造不同靶標(biāo)抗原結(jié)合特性的支架的蛋白質(zhì)， 所述蛋白質(zhì)包括人Y-晶體蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制劑的knuitz型結(jié)構(gòu)域、Ras結(jié)合蛋白AF-6的PDZ-結(jié)構(gòu)域、蝎毒素(卡律蝎毒素)、C-型血凝素結(jié)構(gòu)域(四連接素)，它們?cè)?Handbook of Therapeutic Antibodies Q007，由 Stefan Dubel 編輯)和 Protein Science 15 :14-27 Q006)的第7章非抗體支架中綜述。本發(fā)明結(jié)合結(jié)構(gòu)域可源自任何這些備選蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和移植到所述結(jié)構(gòu)域上的本發(fā)明⑶R的任何組合。抗原結(jié)合片段或免疫學(xué)有效片段可包含部分重鏈或輕鏈可變序列。片段為至少5、 6、8或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)。或者，片段為至少15、至少20、至少50、至少75或至少100個(gè)氨基酸長(zhǎng)。本說(shuō)明書(shū)通篇所用與抗原結(jié)合蛋白有關(guān)的術(shù)語(yǔ)"特異性結(jié)合"，意即抗原結(jié)合蛋白與肌生成抑制素結(jié)合，且不結(jié)合或不顯著結(jié)合其它(例如不相關(guān))蛋白。然而，該術(shù)語(yǔ)不排除所述抗原結(jié)合蛋白亦可與親緣關(guān)系相近的分子(例如生長(zhǎng)和分化因子-11)交叉反應(yīng)這一事實(shí)。本文所述抗原結(jié)合蛋白可按為結(jié)合親緣關(guān)系相近的分子例如GDF-Il的親和力的至少2、5、10、50、100或1000倍來(lái)結(jié)合肌生成抑制素?？乖Y(jié)合蛋白-肌生成抑制素相互作用的結(jié)合親和力或平衡解離常數(shù)(Kd)可為 IOOnM或更小、IOnM或更小、2nM或更小或InM或更小?；蛘?，Kd可為5_10nM之間；或1_2ηΜ 之間。Kd可為1ρΜ-500ρΜ之間；或500pM-lnM之間。
通過(guò)結(jié)合速率常數(shù)(ka)和解離速率常數(shù)(kd) (KD = kd/ka)來(lái)測(cè)定抗原結(jié)合蛋白的結(jié)合親和力?？赏ㄟ^(guò)BIAcore ，例如通過(guò)用由伯胺偶聯(lián)偶聯(lián)在CM5芯片上的肌生成抑制素來(lái)進(jìn)行抗原捕獲并將抗體捕獲到該表面，來(lái)測(cè)量結(jié)合親和力。可將實(shí)施例2. 3中闡述的 BIAcore 方法用于測(cè)量結(jié)合親和力。或者，可通過(guò)FORTCbio，例如通過(guò)用由伯胺偶聯(lián)偶聯(lián)在CM5針上的肌生成抑制素來(lái)進(jìn)行抗原捕獲并將抗體捕獲到該表面，來(lái)測(cè)量結(jié)合親和力。 可將實(shí)施例5. 1中所述的FORTCbio方法用于測(cè)量結(jié)合親和力。然而，由于本發(fā)明抗原結(jié)合蛋白與肌生成抑制素的結(jié)合特性，可將結(jié)合親和力用于等級(jí)評(píng)定的目的。kd可為IxlO-3S-1或更小、ΙχΙΟΛΓ1或更小或lxlOY1或更小。kd可在 ΙχΚΤ ^-ΙχΙΟΛΓ1之間；或在lxK^f-lxKTY1之間。緩慢的kd可導(dǎo)致抗原結(jié)合蛋白-配體復(fù)合物慢解離，并配體中和改進(jìn)。本說(shuō)明書(shū)通篇所用術(shù)語(yǔ)"中和"，意即與缺乏抗原結(jié)合蛋白時(shí)的肌生成抑制素的活性比較，在本文所述抗原結(jié)合蛋白存在下，體外或體內(nèi)肌生成抑制素的生物學(xué)活性降低了。中和可因以下原因中的一種或多種而產(chǎn)生阻斷肌生成抑制素與其受體的結(jié)合；防止肌生成抑制素激活其受體；下調(diào)肌生成抑制素或其受體；或影響效應(yīng)功能。中和可由于封阻肌生成抑制素與其受體結(jié)合并因此防止肌生成抑制素激活其受體而產(chǎn)生。肌生成抑制素活性包括與活性肌生成抑制素有關(guān)的生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)和形態(tài)發(fā)生活性中的一種或多種，例如調(diào)節(jié)肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能。與活性肌生成抑制素有關(guān)的另外的活性可包括調(diào)節(jié)肌纖維數(shù)量、肌纖維大小、肌肉再生、肌肉纖維變性、成肌細(xì)胞增殖率、 肌分化；衛(wèi)星細(xì)胞激活、衛(wèi)星細(xì)胞增殖、衛(wèi)星細(xì)胞自我更新；參與肌肉生長(zhǎng)和功能的蛋白質(zhì)的合成或分解。所述肌肉可為骨骼肌。生物學(xué)活性的降低或抑制可為部分或全部。相對(duì)于在缺乏抗原結(jié)合蛋白時(shí)的肌生成抑制素的活性，中和抗原結(jié)合蛋白可中和肌生成抑制素活性至少20% JO^dO^jO^、 55%,60%,65%,70%,75%,80%,82%,84%,86%,88%,90%,92%,94%,95%,96%, 97^^98^^99%或100%。在功能測(cè)定(例如以下所述中和測(cè)定)中，IC5tl是降低生物學(xué)反應(yīng)最大值的50%的濃度。用技術(shù)人員已知或本文所述的一種或多種測(cè)定可測(cè)定或測(cè)量中和。例如，可在三明治ELISA中通過(guò)BIAc0reTM、FMAT、FORTCbi0TM或相似體外測(cè)定例如表面等離子共振，來(lái)評(píng)估抗原結(jié)合蛋白與肌生成抑制素的結(jié)合?？赏ㄟ^(guò)在抗原結(jié)合蛋白存在下測(cè)量肌生成抑制素與固定在板上的可溶性ActRIIb 受體的結(jié)合，將基于ELISA的受體結(jié)合測(cè)定用于測(cè)定抗原結(jié)合蛋白的中和活性(更詳細(xì)資料參見(jiàn)實(shí)施例2. 5)。受體中和測(cè)定是靈敏的方法，其可用于基于效價(jià)區(qū)分IC50低于InM的分子。然而，其本身對(duì)有結(jié)合能力的生物素化肌生成抑制素的精確濃度敏感。因此，可獲得介于 0. 1ηΜ-5ηΜ 范圍的 IC50 值，例如 0. 1ηΜ_3ηΜ 或 0. 1ηΜ_2ηΜ 或 0. InM-InM 范圍?；蛘撸赏ㄟ^(guò)測(cè)量對(duì)受體結(jié)合、下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因激活的抑制，將基于細(xì)胞的受體結(jié)合測(cè)定用于測(cè)定抗原結(jié)合蛋白的中和活性。例如，可通過(guò)其在橫紋肌肉瘤細(xì)胞(A204) 中抑制肌生成抑制素-誘導(dǎo)的熒光素酶活性的能力，來(lái)確定抗原結(jié)合蛋白的中和，所述橫紋肌肉瘤細(xì)胞用在PAI-I特異性啟動(dòng)子調(diào)控下編碼熒光素酶基因的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，本測(cè)定亦稱(chēng)為肌生成抑制素響應(yīng)報(bào)告基因測(cè)定(關(guān)于更詳細(xì)資料參見(jiàn)實(shí)施例1. 2)?？稍陲@示肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中的任一種或組合變化的動(dòng)物中用多種不同測(cè)定來(lái)確定體內(nèi)中和。例如，可將體重、肌肉質(zhì)量(例如瘦肉質(zhì)量)、肌肉收縮性(例如強(qiáng)直性張力)、握力、動(dòng)物懸空自己的能力和游泳測(cè)定，單獨(dú)或以任何組合用于評(píng)估肌生成抑制素抗原結(jié)合蛋白的中和活性。例如可測(cè)定以下肌肉的肌肉質(zhì)量腓腸肌、四頭肌、三頭肌、趾長(zhǎng)伸肌(EDL)、脛骨前肌(TA)和比目魚(yú)肌。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白，術(shù)語(yǔ)"起源"意欲不僅從來(lái)源意義上界定所述材料的身體來(lái)源，而且界定在結(jié)構(gòu)上與所述材料一樣但并不是來(lái)源于參考來(lái)源的材料。因此"在供體抗體中存在的殘基"不必一定純化自供體抗體。分離意指分子例如抗原結(jié)合蛋白被從其可實(shí)際存在的環(huán)境中移出。例如，所述分子可從其實(shí)際上正常存在的物質(zhì)中純化。例如，抗原結(jié)合蛋白可被純化為關(guān)于含有抗原結(jié)合蛋白的培養(yǎng)基至少95%、96%、97%、98%或99%或更高。“嵌合抗體"指工程抗體類(lèi)型，其含有與源自受體抗體的輕鏈和重鏈恒定區(qū)締合的源自供體抗體的天然存在的可變區(qū)(輕鏈和重鏈)?！叭嗽椿目贵w"指工程抗體類(lèi)型，其具有源自非人供體免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)CDR，所述分子的源自免疫球蛋白的其余部分源自一個(gè)或多個(gè)人免疫球蛋白。另外， 可改變構(gòu)架支撐殘基以保留結(jié)合親和力(參見(jiàn)例如Queen等Natl Acad Sci USA, 86 :10029-10032(1989), Hodgson 等 Bio/technology，9 :421 (1991))。合適的人受體抗體可為通過(guò)與供體抗體的核苷酸及氨基酸序列的同源性選自以下常規(guī)數(shù)據(jù)庫(kù)的一種例如 KABAT 數(shù)據(jù)庫(kù)、Los Alamos數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss Protein數(shù)據(jù)庫(kù)。特征為與供體抗體構(gòu)架區(qū)同源(基于氨基酸)的人抗體，可適宜地提供重鏈恒定區(qū)和/或重鏈可變構(gòu)架區(qū)用于插入供體CDR?？砂聪嗨频姆绞竭x擇能夠貢獻(xiàn)輕鏈恒定或可變構(gòu)架區(qū)的合適的受體抗體。應(yīng)該注意，受體抗體重鏈和輕鏈不必源自同一個(gè)受體抗體?，F(xiàn)有技術(shù)闡述了產(chǎn)生所述人源化的抗體的幾種方式,參見(jiàn)例如EP-A-0239400和EP-A-0M951。術(shù)語(yǔ)"供體抗體"指將其可變區(qū)、一個(gè)或多個(gè)CDR或其它功能片段或其類(lèi)似物的氨基酸序列貢獻(xiàn)給初始免疫球蛋白伴侶的抗體。因此，供體提供改變的免疫球蛋白編碼區(qū)， 得到具有供體抗體的抗原特異性和中和活性特點(diǎn)的表達(dá)的改變的抗體。術(shù)語(yǔ)"受體抗體"指與供體抗體異源的抗體，其將編碼其重鏈和/或輕鏈構(gòu)架區(qū)和/或其重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列的全部(或任何部分)貢獻(xiàn)給初始免疫球蛋白伴侶。人抗體可為受體抗體。本文所用術(shù)語(yǔ)"Vh"和"分別指抗原結(jié)合蛋白的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)?！?OTR"定義為抗原結(jié)合蛋白的互補(bǔ)決定區(qū)氨基酸序列。這些是免疫球蛋白重鏈和輕鏈的高可變區(qū)。在免疫球蛋白的可變部分有3個(gè)重鏈和3個(gè)輕鏈CDR (或CDR區(qū))。因此，本文所用“CDR"指所有3個(gè)重鏈CDR、所有3個(gè)輕鏈CDR、所有重鏈和輕鏈CDR或至少兩個(gè)⑶R。除非另外規(guī)定，否則在本說(shuō)明書(shū)中通篇按照Kabat編號(hào)規(guī)則來(lái)對(duì)可變結(jié)構(gòu)域序列和全長(zhǎng)抗體序列的氨基酸殘基進(jìn)行編號(hào)。同樣地，實(shí)施例中所用術(shù)語(yǔ)"OTR"、“⑶RL 1"、” CDRL2"、” CDRL3"、” CDRHl “、” CDRH2"、” CDRH3"遵循 Kabat 編號(hào)規(guī)則。對(duì)于進(jìn)一步的資料，參見(jiàn) Kabat 等，SEQuences of Proteins of Immunological Interest, 第 4 版，U. S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然明白，對(duì)于可變結(jié)構(gòu)域序列和全長(zhǎng)抗體序列的氨基酸殘基， 有備選編號(hào)規(guī)則。對(duì)于⑶R序列亦有備選編號(hào)規(guī)則，例如在ChOthia等(1989) Nature 342 877-883中提出的那些編號(hào)規(guī)則?？贵w的結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)折疊可意味著認(rèn)為其它殘基是CDR 序列的部分，技術(shù)人員應(yīng)該如此理解。因此，本文所用術(shù)語(yǔ)"對(duì)應(yīng)的CDR"指用任何編號(hào)規(guī)則(例如表1中提出的那些)的CDR序列。技術(shù)人員可獲得的用于CDR序列的其它編號(hào)規(guī)則包括〃 AbM" (University of Bath)禾口〃 接通(contact) ‘‘ (University College London)方法。用 Kabat、Chothia、AbM 和接通方法中的至少兩種可測(cè)定最小重疊區(qū)，以提供"最小結(jié)合單位"。最小結(jié)合單位可為⑶R的亞部分。下表1代表用每一種編號(hào)規(guī)則對(duì)每一個(gè)CDR或結(jié)合單位的一種定義。表1中用 Kabat編號(hào)方案來(lái)給可變結(jié)構(gòu)域氨基酸序列編號(hào)。應(yīng)該注意，某些CDR定義可視所用的單獨(dú)出版物而變化。表 權(quán)利要求
1.與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白包含SEQID NO 3 的CDRH3 ；或變體CDRH3。
2.權(quán)利要求1的抗原結(jié)合蛋白，其中所述變體⑶RH3為(i)SEQID NO :82-92或110 中的任一種；或(ii)以下Kabat取代中的任一種V102Y、V102H、V102I、V102D或V102G。
3.權(quán)利要求1或2的抗原結(jié)合蛋白，其進(jìn)一步包含選自以下的一種或多種或所有CDR CDRHl (SEQ ID NO 1)或變體 CDRHl ；CDRH2(SEQ ID NO 2)或變體 CDRH2 ；CDRLl (SEQ ID NO 4)或變體 CDRLl ；CDRL2(SEQ ID NO 5)或變體 CDRL2 ；和 CDRL3(SEQ ID NO :6 或 109)或變體 CDRL3。
4.權(quán)利要求2的抗原結(jié)合蛋白，其中所述變體⑶RH2為(i)SEQID NO :93-97中的任一種；或(ii)以下 Kabat 取代中的任一種N50R、N50E、N50W、N50Y、N50G、N50Q、N50V、N50L、 N50K、N50A、I51L、I51V、I51T、I51S、I51N、Y52D、Y52L、Y52N、Y52S、Y53A、Y53G、Y53S、Y53K、 Y53T、Y53N、N54S、N54T、N54K、N54D、N54G、V56Y、V56R、V56E、V56D、V56G、V56S、V56A、N58K、 N58T、N58S、N58D、N58R、N58G、N58F 或 N58Y。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白，其中⑶RH3為SEQID NO :90 ；和/或⑶RH2 為 SEQ ID NO 95 ；禾口 / 或 CDRL3 為 SEQ ID NO :109。
6.與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋包含SEQID N0:7可變結(jié)構(gòu)域序列的對(duì)應(yīng)的CDRH3或其變體CDRH3。
7.權(quán)利要求6的抗原結(jié)合蛋白，其進(jìn)一步包含選自以下的一種或多種或全部對(duì)應(yīng)的 ⑶R 所述SEQ ID NO :7可變結(jié)構(gòu)域序列的⑶RHl或其變體⑶RHl或⑶RH2或其變體⑶RH2 ； 或所述SEQ ID NO 8可變結(jié)構(gòu)域序列的⑶RLl或其變體⑶RL1、⑶RL2或其變體⑶RL2和 CDRL3或其變體CDRL3。
8.與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白包括包含SEQID NO 7的95-101位Kabat殘基的結(jié)合單位H3或變體H3。
9.權(quán)利要求8的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含選自以下的一種或多種或全部結(jié)合單位包含SEQ ID NO :7的31-32位Kabat殘基的Hl或變體Hl ；包含SEQ ID NO :7的52-56位Kabat殘基的H2或變體H2 ；包含SEQ ID NO 8的30_；34位Kabat殘基的 Ll或變體Ll ；包含SEQ ID NO :8的50-55位Kabat殘基的L2或變體L2 ；和包含SEQ ID NO :8的89-96位Kabat殘基的L3或變體L3。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含選自以下的Kabat氨基酸殘基中的任一種或組合(a)所述可變重鏈觀位的S或T；(b)所述可變重鏈105位的T或Q；(c)所述可變重鏈的以下位置2位V、I或G;4位L或V ；20位L、I、M或V ；22位C ；24 位 Τ、A、V、G 或 S J6 位 G ；四位 I、F、L 或 S ;36 位 W ；47 位 W 或 Y ;48 位 I、Μ、V 或 L ；69 位 I、L、F、M 或 V ;78 位 A、L、V、Y 或 F ;80 位 L 或 M ;90 位 Y 或 F ；92 位 C ；禾口 / 或 94 位 R、K、 G、S、H 或 N ；(d)所述可變輕鏈的16位R或G；(e)所述可變輕鏈71位的Y或F；(f)所述可變輕鏈100位的A或Q；和/或(g)所述可變輕鏈的以下位置2位I、L或V ;3位V、Q、L或E ;4位M或L ;23位C ；35 位 W ;36 位 Y、L 或 F ；46 位 S、L、R 或 V ；49 位 Y、H、F 或 K ；88 位 C ；和 / 或 98 位 F。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白進(jìn)一步包含與SEQID NO 10所示構(gòu)架區(qū)具有75%或更高序列同一性的重鏈可變區(qū)受體抗體構(gòu)架；或與SEQ ID NO 11所示構(gòu)架區(qū)具有75%或更高序列同一性的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域受體抗體構(gòu)架。
12.與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白包含(i)選自SEQID NO :7或SEQ IDNO 25的重鏈可變區(qū)；和/或選自SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 21的輕鏈可變區(qū)；或具有75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)； 或(ii)SEQID NO :26的重鏈；禾口 /或選自SEQ ID NO 27或SEQ ID NO 37的輕鏈；或具有75%或更高序列同一性的變體重鏈或輕鏈。
13.與肌生成抑制素特異性結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白，所述抗原結(jié)合蛋白包含(i)選自SEQID NO: 12、13或14中任一種的重鏈可變區(qū)；和/或選自SEQ ID NO :15、 16、17、18或M中任一種的輕鏈可變區(qū)；或具有75%或更高序列同一性的變體重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)；或(ii)選自SEQID NO :28、四、30、98或99中任一種的重鏈；和/或選自SEQ ID NO :31、 32、33、34或40中任一種的輕鏈；或具有75%或更高序列同一性的變體重鏈或輕鏈。
14.權(quán)利要求12或13的抗原結(jié)合蛋白，其中存在以下Kabat取代(i)所述重鏈可變區(qū)或重鏈中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B_I、W100E_ F、F100G_N、F100G_S、F100G_Y、V102N 或 V102S ；禾卩 / 或(ii)所述重鏈可變區(qū)或重鏈中的G55D、G55L、G55S、G55T或G55V；和/或(iii)所述輕鏈可變區(qū)或輕鏈中的C91S。
15.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白，其中所述抗原結(jié)合蛋白為Fc無(wú)效化。
16.編碼權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白的核酸分子。
17.權(quán)利要求16的核酸分子，所述核酸分子包含(i)SEQ ID NO 41重鏈DNA序列；和/或選自SEQ ID NO 42或52的輕鏈DNA序列；或具有75%或更高同一性的變體重鏈或輕鏈；或(ii)選自SEQID NO :43、44或45中任一種的重鏈DNA序列；和/或選自SEQ ID NO 46、47、48、49或55中任一種的輕鏈DNA序列；或具有75%或更高同一性的變體重鏈或輕鏈。
18.權(quán)利要求16的核酸分子，其中所述DNA序列編碼具有以下Kabat取代的重鏈或輕鏈(i)所述重鏈中的Y96L、G99D、G99S、G100A_K、P100B_F、P100B I、W100E_F、F100G_N、 F100G_S、F100G_Y、V102N 或 V102S ；和 / 或(ii)所述重鏈中的G55D、G55L、G55S、G55T 或 G55V ；和 / 或(iii)所述輕鏈中的C91S。
19.包含權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所定義的核酸分子的表達(dá)載體。
20.包含權(quán)利要求19中所定義的表達(dá)載體的重組宿主細(xì)胞。
21.用于制備權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所定義的抗原結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞及回收所述抗原結(jié)合蛋白的步驟。
22.包含權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白及藥用載體的藥物組合物。
23.治療罹患降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中任一種或組合的疾病的受試者的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白或權(quán)利要求22的組合物的步驟。
24.治療罹患以下疾病的受試者的方法少肌癥、惡病質(zhì)、肌肉萎縮、廢用性肌肉萎縮、 HIV、AIDS、癌癥、外科手術(shù)、燒傷、肌肉骨頭或神經(jīng)創(chuàng)傷或損傷、肥胖癥、糖尿病(包括II型糖尿病)、關(guān)節(jié)炎、慢性腎衰竭(CRF)、末期腎病(ESRD)、充血性心力衰竭(CHF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、選擇性關(guān)節(jié)修復(fù)、多發(fā)性硬化病(MQ、中風(fēng)、肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元神經(jīng)病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森氏病、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、脂肪酸肝病、肝硬化、阿狄森病、庫(kù)欣病、急性呼吸窘迫綜合征、類(lèi)固醇誘導(dǎo)的肌肉萎縮、肌炎或脊柱側(cè)凸，所述方法包括給予權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白或權(quán)利要求22的組合物的步驟。
25.在受試者中增加肌肉質(zhì)量、增加肌肉力量和/或改進(jìn)肌肉功能的方法，所述方法包括給予權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的抗原結(jié)合蛋白或權(quán)利要求22的組合物的步驟。
全文摘要
本文闡述了與肌生成抑制素結(jié)合的抗原結(jié)合蛋白例如抗體、編碼所述抗原結(jié)合蛋白的多核苷酸、包含所述抗原結(jié)合蛋白的藥物組合物和制備方法。此外，本文闡述了所述抗原結(jié)合蛋白在治療或預(yù)防與降低肌肉質(zhì)量、肌肉力量和肌肉功能中的任一種或組合有關(guān)的疾病的用途。
文檔編號(hào)C07K16/22GK102325793SQ200980157393
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者A·比頓, A·路易斯, B·韓, C·阿什曼, F·庫(kù)爾, H·張, I·柯比, J·H·艾利斯, K·M·林德利, M·A·奧雷基亞, P·威爾遜, T·S·徐, Y·沈 申請(qǐng)人:葛蘭素集團(tuán)有限公司