專(zhuān)利名稱(chēng)：：抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別屬于抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子的單克隆抗體領(lǐng)域。更具體的講，本發(fā)明涉及優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-ll且耐受蛋白質(zhì)裂解的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，還涉及所述抗體在哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)中用于治療、預(yù)防或診斷各種紊亂或疾病的用途。
背景技術(shù)：
：肌肉生長(zhǎng)抑制因子(也稱(chēng)為生長(zhǎng)分化因子8(GDF-8))是TGF-(3蛋白超家族的成員，與其他的TGF-P家族成員有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)。肌肉生長(zhǎng)抑制因子在發(fā)育的和成熟的骨骼肌中大量表達(dá)，并發(fā)揮骨骼肌負(fù)調(diào)節(jié)物的功能。肌肉生長(zhǎng)抑制因子也參與其他的生理過(guò)程，包括脂肪前體細(xì)胞(preadipocyte)向脂肪細(xì)胞的分化，以及間接地參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)和骨形成的抑制。生長(zhǎng)分化因子-11,也稱(chēng)為GDF-ll或者BMP-ll，是與肌肉生長(zhǎng)抑制因子最相似的TGF-P蛋白超家族成員。成熟形式的人類(lèi)肌肉生長(zhǎng)抑制因子與GDF-ll的M酸序列大約卯％是相同的；然而，GDF-11在組織中的表達(dá)范圍比肌肉生長(zhǎng)抑制因子更廣，包括牙髓，腦，心臟，腎臟和肺以及肌肉和脂肪組織。最近發(fā)現(xiàn)人GDF-ll調(diào)控臨時(shí)窗口期，其間多能祖細(xì)胞保留分化為不同神經(jīng)細(xì)胞后代的潛能。存在特異性抑制肌肉生長(zhǎng)抑制因子活性而最小程度抑制其他TGF-P蛋白超家族(尤其是GDF-ll)的活性的治療需要。另外，為了更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)或測(cè)定樣本中的肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平，診斷上需要與其他TGF-P蛋白超家族(尤其是GDF-ll)有最低交叉反應(yīng)的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體。優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-ll的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體公開(kāi)于國(guó)際z&開(kāi)號(hào)WO2005/094446中。優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-ll的人源化單克隆抗體公開(kāi)于國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2007/044411中。治療性的抗體可以發(fā)生多種降解反應(yīng)，例如脫酰胺作用或裂解，其可以在體內(nèi)或制造，配制，貯存或治療過(guò)程中發(fā)生。例如，抗體或其他多肽類(lèi)中的天冬酰胺(Asn)在水性溶液中對(duì)裂解特別敏感。因此，需要優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是結(jié)合GDF-ll的，對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制因子有很強(qiáng)的結(jié)合親和力(即，不超過(guò)大約3xl(TSM)，并且耐受化學(xué)降解的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體。發(fā)明概要本發(fā)明抗體優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是結(jié)合GDF-ll,即，它們與GDF-ll的反應(yīng)顯著低于與肌肉生長(zhǎng)抑制因子的反應(yīng)。通過(guò)本領(lǐng)域方法，例如通過(guò)竟?fàn)幮悦嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),或者通過(guò)BIACORE或KINEXA測(cè)定法測(cè)量的，本發(fā)明的抗體與肌肉生長(zhǎng)抑制因子的結(jié)合力比與GDF-ll的結(jié)合力大至少大約2、3、5、10、20、22或者25倍，證明抗體與GDF-8的親和力比與GDF-ll的親和力高(即，低Kd)。最為優(yōu)選地，在結(jié)合試驗(yàn)中所采用的本發(fā)明抗體與GDF-ll的結(jié)合并未超過(guò)背景水平。(GDF-ll)結(jié)合的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其中所述抗體結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子的親和力不超過(guò)大約3x10—8M，并且其中至少95%的單克隆抗體在抗體溶液中于4。C保存一年，25。C保存六個(gè)月，37。C保存2個(gè)月或者40QC保存4周的條件下不裂解。示例性的抗體溶液包含lmg/mL的本發(fā)明抗體，10mM磷酸鹽，pH7.4和150mMNaCl。優(yōu)選地，在本文實(shí)施例4中所述的體外肌肉生長(zhǎng)抑制因子/SBE報(bào)告分子試驗(yàn)中，本發(fā)明的抗體的另一特征是具有低于25nM的IC5o。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體當(dāng)其在選自下列各溫度和時(shí)間的抗體溶液中保存時(shí)耐受化學(xué)降解4DC為期1年、25°C為期6個(gè)月、37°C為期2個(gè)月和40°C為期4周，即100%、99%、98%、97%、96%、或者95%的抗體不裂解。優(yōu)選的溫度和時(shí)間是40。C為期4周。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的另一個(gè)特征在于其在成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子的氨基酸40-64[人類(lèi)ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQIDNO:29)，43-57[人類(lèi)CSGECEFVFLQKYPH(SEQIDNO:30)或45-59[人類(lèi)GECEFVFLQKYPHTH(SEQIDNO:31)區(qū)域結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的另一個(gè)特征在于結(jié)合由成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子氨基酸40-64,43-57或45-59組成的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含序列如SEQIDNO:11顯示的重鏈可變區(qū)(HCVR)，和具有選自SEQIDNO:4、5、6和7的序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的單克隆抗體包含SEQIDNO:12所示序列的HCVR和具有選自SEQIDNO:9和10的序列的LCVR。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HCVR和LCVR，其中所述的HCVR包含序列如SEQIDNO:23所顯示的位于CDRH1的肽，序列如SEQIDNO:25所顯示的位于CDRH2的肽，序列如SEQIDNO:27所顯示的位于CDRH3的肽，其中所述的LCVR包含序列如SEQIDNO:13所顯示的位于CDRL1的肽，序列如SEQIDNO:14所顯示的位于CDRL2的肽，和具有選自SEQIDNO:16、17、18和19的序列的位于CDRL3的肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含HCVR和LCVR,其中所述的HCVR包含序列如SEQIDNO:24所顯示的位于CDRH1的肽，序列如SEQIDNO:26所顯示的位于CDRH2的肽，以及序列如SEQIDNO:28所顯示的位于CDRH3的肽，其中所述的LCVR包含序列如SEQIDNO:13所顯示的位于CDRL1的肽，序列如SEQIDNO:14所顯示的位于CDRL2的肽，和具有選自SEQIDNO:21和22的序列的位于CDRL3的肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體另外包含恒定區(qū)，其中所述的恒定區(qū)來(lái)源于人類(lèi)基因組或選自家畜，運(yùn)動(dòng)性動(dòng)物或食源性動(dòng)物的基因組。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體包含M酸序列如SEQIDNO:32所示的輕鏈和^J^酸序列如SEQIDNO:33所示的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明抗體的組合物(例如，藥物組合物)。本發(fā)明組合物可以進(jìn)一步包含可藥用栽體。在所述組合物中，本發(fā)明抗體是活性成分。優(yōu)選地該組合物包含同型的或基本上同型的本發(fā)明抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體群。用于治療或預(yù)防用途的組合物是無(wú)菌的，可以是凍干的，并且優(yōu)選地與適當(dāng)?shù)南♂寗┮黄鹛峁?。本發(fā)明提供一種在有需要的動(dòng)物，優(yōu)選在哺乳動(dòng)物或禽類(lèi)，優(yōu)選在人類(lèi)中抑制至少一種肌肉生長(zhǎng)抑制因子生物學(xué)活性的方法，包括給予所述哺乳動(dòng)物或禽類(lèi)治療有效量或者預(yù)防有效量的本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供通過(guò)中和或者拮抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子生物活性來(lái)增強(qiáng)肌肉量或治療或預(yù)防疾病或紊亂或改善病癥的方法，包括給予需要此類(lèi)治療或預(yù)防的患者(例如，人類(lèi))治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明抗體。本發(fā)明涉及本發(fā)明抗體在治療中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及本發(fā)明抗體在制造用于治療肌肉萎縮、虛弱、年齡相關(guān)性少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)的藥物中的用途。本發(fā)明涉及本發(fā)明抗體在制造用于預(yù)防肌肉萎縮、虛弱、年齡相關(guān)性少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)的藥物中的用途。本發(fā)明涉及通過(guò)給予治療有效量的本發(fā)明抗體，在有需要的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選在人類(lèi)中治療肌肉萎縮、虛弱、年齡相關(guān)性少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)的方法。本發(fā)明涉及通過(guò)給予預(yù)防有效量的本發(fā)明抗體，在有需要的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選在人類(lèi)中預(yù)防肌肉萎縮、虛弱、年齡相關(guān)性少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)的方法。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1A顯示人類(lèi)肌肉生長(zhǎng)抑制因子成熟形式和人類(lèi)GDF-ll的氨基酸序列比對(duì)，其中Mab510C2和C12及其變體結(jié)合的抗原表位用下列線標(biāo)出，并且用粗體表示在抗原表位內(nèi)肌肉生長(zhǎng)抑制因子和GDF-ll之間的不同殘基。圖1B列出了Mab510C2和C12以及其變體結(jié)合的抗原表位。圖2A和B分別顯示了親本Mab510C2和C12以及幾種變體可變區(qū)的氨基酸序列，包括CDR結(jié)構(gòu)域和框架區(qū)。CDR結(jié)構(gòu)域用粗體表示，CDR結(jié)構(gòu)域內(nèi)的變異用下劃線示出。圖3顯示了親本Mab510C2和C12以及本發(fā)明抗體的CDR結(jié)構(gòu)域的氨基^列比對(duì)。變異用粗體和下劃線示出。圖4列出本發(fā)明的單克隆抗體，即N93H-C12的輕鏈和重鏈的氨基酸序列。圖5A和B通過(guò)ELISA測(cè)定比較了本發(fā)明的某些單克隆抗體與它們親本抗體的結(jié)合親和力。發(fā)明詳述定義本文使用的術(shù)語(yǔ)"成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子"(見(jiàn)人類(lèi)、鼠類(lèi)、大鼠、雞、火雞、犬、馬和豬等物種的SEQIDNO:l)是指蛋白水解裂解后產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的單體或同源二聚形式，所述裂解例如在人類(lèi)肌肉生長(zhǎng)抑制因子375個(gè)氨基酸的前體蛋白形式的Arg266上的裂解。本文使用的術(shù)語(yǔ)"肌肉生長(zhǎng)抑制因子"是指成熟的肌肉生長(zhǎng)抑制因子，除非本文有另外說(shuō)明。天然狀態(tài)下存在的全長(zhǎng)抗體是4條肽鏈的免疫球蛋白分子，包含通過(guò)二硫鍵互相聯(lián)接的2條重鏈(H)(全長(zhǎng)大約50J0kDa)和2條輕鏈(L)(全長(zhǎng)大約25kDa)。每條鏈的氛基末端部分包括大約100-110個(gè)或更多的氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每條鏈的羧基末端部分定義了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。輕鏈分為K或入，其特征在于本領(lǐng)域中已知的特定恒定區(qū)。每一條重鏈的特征在于本領(lǐng)域中已知的特定恒定區(qū)。IgG,和IgG4是本發(fā)明優(yōu)選的抗體同種型。每條重鏈包含N末端重鏈可變區(qū)(本文稱(chēng)為"HCVR")和重鏈恒定區(qū)。對(duì)于IgG，IgD和IgA，重鏈恒定區(qū)包含3個(gè)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和CH3);而對(duì)于IgM和IgE，則包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、CH3和CH4)。每條輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文稱(chēng)為"LCVR")和輕鏈恒定區(qū)CL。HCVR和LCVR區(qū)可進(jìn)一步細(xì)分為超變區(qū)，稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，間隔分布于更加保守的稱(chēng)為框架區(qū)(FR)的區(qū)域中。每個(gè)HCVR和LCVR包含3個(gè)CDR和4個(gè)FR，從氨基末端到氣基末端按照以下順序排列FR1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2,FR3，CDR3和FR4。在此，重鏈的3個(gè)CDR稱(chēng)為"CDRH1、CDRH2和CDRH3"，輕鏈的3個(gè)CDR稱(chēng)為"CDRL1、CDRL2和CDRL3"。CDR包含形成與抗原特異作用的大多數(shù)的殘基。根據(jù)公知慣例將氨基酸指定到每個(gè)結(jié)構(gòu)域中[Kabat,"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991)]?？贵w結(jié)合特定抗原的功能在很大程度上受6個(gè)CDR的影響。如本文使用的，涉及本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體(或者簡(jiǎn)稱(chēng)為"本發(fā)明的單克隆抗體"或"本發(fā)明抗體，，)的術(shù)語(yǔ)"抗體"是指單克隆抗體。本文使用的"單克隆抗體"或者"Mab"，除非有特別的說(shuō)明，是指嵌合抗體、人源化抗體或者完全的人類(lèi)抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明單克隆抗體以同型或者基本上同型抗體群的形式存在。本發(fā)明的單克隆抗體可以利用本領(lǐng)域公知的細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以及重組技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)，合成技術(shù)或這些技術(shù)的組合或本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)來(lái)生產(chǎn)。"單克隆抗體"是指源自單拷貝或者單克隆的抗體，包括例如任何真核的、原核的或者噬菌體克隆，而不是生產(chǎn)其的方法。"單克隆抗體，，可以是完整的抗體(包含完整的或全長(zhǎng)的Fc區(qū)域)，基本上完整的抗體，或者包含抗原結(jié)合部分的抗體部分或片段，例如，嵌合體、人源化或人類(lèi)抗體的Fab片段，F(xiàn)ab，片段或F(ab，)2片段。每個(gè)輕鏈/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，完整的IgG抗體有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除了在雙功能抗體或者雙特異抗體，這兩個(gè)結(jié)合部位是相同的。如本文所用的，"抗原結(jié)合部分，，或"抗原結(jié)合區(qū)域"或"抗原結(jié)合片段"可以交替使用，是指可變區(qū)域內(nèi)的抗體分子那一部分，其含有與抗原相互作用并賦予抗體對(duì)抗原的特異性和親和力的氨基酸殘基。抗體的抗原結(jié)合部分包含維持抗原結(jié)合殘基的正確構(gòu)象所必需的框架區(qū)M酸殘基。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體框架區(qū)是人類(lèi)起源的或者基本上是人類(lèi)起源的(至少85%、卯％、95%、97%或99%是人類(lèi)起源)。此外，本文所用的"單克隆抗體"可以是單鏈Fv片段，此片段可通過(guò)使用接頭序列將編碼LCVR和HCVR的DNA連接而生成(見(jiàn)Pluckthun，77re戶/m簡(jiǎn)flco/05jJw說(shuō)ofZ/es，vol.113，Rosenburg和Moore編著，Springer畫(huà)Verlag，NewYork,pp269-315，1994)。要理解不管片段或部分是否是特別指出，本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包含這樣的片段或者部分以及單鏈形式。只要蛋白質(zhì)保持特異性地或優(yōu)選地結(jié)合其預(yù)期乾位(例如表位或者抗原)的能力，則其屬于術(shù)語(yǔ)"抗體"的范疇。如本文使用的，"親本，，抗體是用于制備修飾抗體或變體的M^^列編碼的抗體。親本抗體可能包含鼠類(lèi)框架，但是優(yōu)選地包含人類(lèi)框架區(qū)域。親本抗體可能是鼠類(lèi)、嵌合體、人源化的或者人類(lèi)抗體。"務(wù)飾的"或"變體"抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體本文是指通過(guò)在親本抗體序列中添加、刪除和/或取代一個(gè)或者多個(gè)氨基酸殘基形成的與親本抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體氨基酸序列不同的分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，相比親本抗體，變體抗體在可變區(qū)域包含一個(gè)或者多個(gè)氨基酸取代。本發(fā)明的抗體(變體抗體)保持親本抗體優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-ll的能力，具有與親本抗體類(lèi)似或者更大的肌肉生長(zhǎng)抑制因子的結(jié)合親和力，并且相比那些親本抗體有更加穩(wěn)定的特性(即，化學(xué)穩(wěn)定性)。"化學(xué)穩(wěn)定性，，是指耐受化學(xué)降解的能力，例如，肽鍵斷裂("裂解")。本文使用的"耐受化學(xué)降解"的本發(fā)明抗體是指與親本抗體相比耐受自發(fā)的肽鍵斷裂且具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性的抗體。優(yōu)選地，100%、99%、98%、97%、96%或95%的本發(fā)明抗體耐受化學(xué)降解，即，在抗體溶液中4。C保存一年，25°C保存6個(gè)月，37QC保存2個(gè)月，或40°C保存4周而不裂解?？贵w溶液是用于抗體藥物組合物的溶液。優(yōu)選的抗體溶液包含lmg/mL的抗體，10mM確酸鹽，pH7.4和150mMNaCl。增高的化學(xué)穩(wěn)定性的單克隆抗體，其中除去了親本抗體中Asn-Pro二肽的不穩(wěn)定Asn殘基，優(yōu)選用天然M酸殘基取代，甚至更加優(yōu)選用組氨酸(H)、色氨酸(S)、蘇氨酸(T)、丙氨酸(A)或精氨酸(R)殘基取代。另外，此經(jīng)修飾抗體的特點(diǎn)在于優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是結(jié)合GDF-ll，與肌肉生長(zhǎng)抑制因子結(jié)合的Kd小于大約3x10—8M，優(yōu)選地其進(jìn)一步的特點(diǎn)在于的IQo低于25nM。本文使用的術(shù)語(yǔ)"不穩(wěn)定Asn殘基"是指在抗體，蛋白質(zhì)或者多肽中的天冬酰胺殘基，其在體外或者體內(nèi)可能發(fā)生自發(fā)脫酰胺作用或者肽鍵斷本文使用的術(shù)語(yǔ)"裂解的或裂解，，是指抗體中肽鍵的裂解。特別關(guān)注的裂解位點(diǎn)是抗體中的Asii殘基，位于Asn殘基的氨基端或氯基端。抗體裂解可能導(dǎo)致穩(wěn)定性下降和/或蛋白質(zhì)活性的下降或喪失，或者抗體結(jié)合親和力的喪失。導(dǎo)致裂解的自發(fā)修飾可能發(fā)生在體外治療制劑的制備過(guò)程中，不良影響藥物制劑的制造和儲(chǔ)存。裂解也可能發(fā)生在體外抗體的制造或儲(chǔ)存過(guò)程中。此外，自發(fā)修飾可能發(fā)生在體內(nèi)，影響蛋白質(zhì)和抗體的效果和作用持續(xù)時(shí)間。然而，在裂解位點(diǎn)的任何其他氨基酸的簡(jiǎn)單取代可能對(duì)抗體預(yù)期的生物作用(例如結(jié)合親和力或者中和作用)產(chǎn)生負(fù)面影響。術(shù)語(yǔ)"表位，，指分子的能夠被一個(gè)或者多個(gè)抗體的抗原結(jié)合區(qū)域識(shí)別和結(jié)合的那部分。表位通常由分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)(例如氨基酸或者糖支鏈)構(gòu)成，并且具有特定的立體結(jié)構(gòu)以及特定的電荷特征。本文4吏用的術(shù)語(yǔ)"表位"另外是指在動(dòng)物，優(yōu)選地在哺乳動(dòng)物(例如小鼠或者人類(lèi)中)具有抗原和/或免疫原活性的多肽部分。本文使用的術(shù)語(yǔ)"抗原性表位，，，定義為抗體可以特異性結(jié)合的多肽部分，該特異結(jié)合可以用本領(lǐng)域熟知的任何方法測(cè)定，例如通過(guò)傳統(tǒng)的免疫測(cè)定。抗原的表位不一定是免疫原性的，但是可能是免疫原性的。本文使用的"免疫原性的表位"定義為在動(dòng)物中引起可由本領(lǐng)域任何已知方法進(jìn)行測(cè)定的抗體應(yīng)答的多肽部分。(參見(jiàn)，例如Geysen等人.，7Varf.爿ow/.fAS^81:3998-4002(1983))。涉及本發(fā)明的抗體時(shí)，短語(yǔ)"生物學(xué)特性"或"生物活性"、"活性"或"生物學(xué)活性"，在本文可交替使用并且包含，但不局限于表位/抗原親和力和特異性，體內(nèi)或者體外中和或者拮抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子活性的能力，本文實(shí)施例4所示的肌肉生長(zhǎng)抑制因子/SBE報(bào)告分子試驗(yàn)中的IC5o，或體外活性試驗(yàn)中的其他，抗體在體內(nèi)或體外的穩(wěn)定性?？贵w其他確定的生物學(xué)特性包括，例如交叉反應(yīng)性(即，通常與靶肽的非人類(lèi)同源物，或者與其他的蛋白質(zhì)或組織的交叉反應(yīng)性)，以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中保持蛋白質(zhì)高水平表達(dá)的能力。可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)觀察或測(cè)量或評(píng)估前面提到的特性或者特征，這些技術(shù)包括，但不局限于ELISA、竟?fàn)幮訣LISA、表面等離子體共振分析、體外或體內(nèi)無(wú)限制中和試驗(yàn)、受體結(jié)合、BIACORE或KINEXA試驗(yàn)，細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子生成和/或分泌，非洲螗繚屬動(dòng)物冠發(fā)育(Xenopusanimalcapdevelopment)，來(lái)自包括人類(lèi)，靈長(zhǎng)類(lèi)或其他根據(jù)需要的任何不同來(lái)源的組織的信號(hào)傳導(dǎo)和免疫組織化學(xué)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"肌肉生長(zhǎng)抑制因子活性"是指與活性肌肉生長(zhǎng)抑制因子蛋白相關(guān)的一種或者多種生理性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)或者形態(tài)發(fā)生的活性。例如活性肌肉生長(zhǎng)抑制因子是骨骼肌質(zhì)量的負(fù)調(diào)節(jié)子?；钚约∪馍L(zhǎng)抑制因子也可以調(diào)整肌肉特異性酶(例如，肌酸激酶)的產(chǎn)生，刺激肌原細(xì)胞增殖，并且調(diào)節(jié)脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。本文使用的術(shù)語(yǔ)"抑制，，或"中和"涉及本發(fā)明的抗體活性時(shí)是指充分地拮抗、禁止、妨礙、抑制，減緩，破壞，排除，終止，降低或者逆轉(zhuǎn)例如正^皮抑制的包括但不局限于生物學(xué)活性的逸艮或嚴(yán)重性的能力。優(yōu)選地抑制或中和是在抗體缺乏時(shí)活性的至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、95%或者更高。術(shù)語(yǔ)"個(gè)體"、"受試者"、"患者，，在本文可交替使用，是指動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物(包含非靈長(zhǎng)類(lèi)和靈長(zhǎng)類(lèi))或者禽類(lèi)，包含但不局限于鼠類(lèi)、猿類(lèi)、人類(lèi)、哺乳類(lèi)農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物(即，牛、豬、羊)、哺乳類(lèi)運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(即，馬)、以及哺乳類(lèi)寵物(即，犬科動(dòng)物和貓科動(dòng)物)；優(yōu)選地，此術(shù)語(yǔ)是指人類(lèi)。此術(shù)語(yǔ)也指禽類(lèi)，包含但不局限于雞和火雞。在某個(gè)實(shí)施方案中，受試者(優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人類(lèi))其進(jìn)一步的特點(diǎn)在于患有其治療受或者病癥。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，受試者(優(yōu)選哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人類(lèi))其進(jìn)一步的特點(diǎn)在于具有罹患紊亂、疾病或者病癥的危險(xiǎn)，該紊亂、疾病或者病癥的治療受益于降低水平或者降低生物學(xué)活性的肌肉生長(zhǎng)抑制因子?？贵w表征本發(fā)明提供這樣的抗體，其優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-ll，并且比親本抗體更加穩(wěn)定(即，相比親本抗體更加耐受化學(xué)降解)，同時(shí)維持，或改善親本抗體表現(xiàn)出來(lái)的與肌肉生長(zhǎng)抑制因子的結(jié)合力。在一個(gè)實(shí)施方案中，如圖2中顯示的親本抗體MabCU或Mab510C2中位于CDRL3的不穩(wěn)定Asn殘基由其它氨基酸取代。本發(fā)明抗體中優(yōu)選的M酸取代是1)減低對(duì)自發(fā)化學(xué)降解(即，裂解或者脫酰胺作用)的敏感性，和2)維持正如親本抗體表現(xiàn)出的抗原抗體結(jié)合親和力的那些取代。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，MabC12的位于CDRL3上的Asn殘基^皮H或R取代。在另外一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，Mab510C2的位于CDRL3上的Asn殘基被H、S、T或A取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體耐受自發(fā)化學(xué)降解，即，當(dāng)在選自下列各溫度和時(shí)間的#^牛下4。C下l年，25。C下6個(gè)月，37。C下2個(gè)月，和40。C下4周，于抗體溶液中保存時(shí)，100%、99%、98%、97%、96%或95%的抗體不裂解?？贵w溶液是指適用于包含抗體的藥物組合物的任何溶液。示例性的抗體溶液包含lmg/mL抗體，10mM砩酸鹽，pH7.4和150mMNaCl。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體的進(jìn)一步特征在于具有與肌肉生長(zhǎng)抑制因子的強(qiáng)結(jié)合親和力(KD)，即，低于大約3xl(rSM、lxlO-SM或lxlO力M，優(yōu)選低于大約9xlO"。M、8.7xlO"。M或更優(yōu)選地低于大約8xl(T"M?；蛘?，本發(fā)明抗體的特征在于與肌肉生長(zhǎng)抑制因子的KD不超過(guò)大約3xl(T8M、lxl(T8M、lxl(T9M或9xlO"°M，更優(yōu)選地不超過(guò)大約8.7xlO"QM或最優(yōu)選地不超過(guò)大約8xlO—"M。本發(fā)明抗體的結(jié)合親和力與其親本抗體的結(jié)合親和力類(lèi)似或者高于其親本抗體的結(jié)合親和力。優(yōu)選地，特征為如上文描述的強(qiáng)結(jié)合親和力的本發(fā)明抗體還具有如本文實(shí)施例4所示體外肌肉生長(zhǎng)抑制因子/SBE報(bào)告分子試驗(yàn)中的IC5o,其低于25nM、20nM、16nM、14nM、10nM、9nM、6nM或5.2nM。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體的ICso與其親本抗體的類(lèi)似或者優(yōu)于其親本抗體的IC5C。本發(fā)明的所有抗體與GDF-ll的反應(yīng)顯著低于與肌肉生長(zhǎng)抑制因子的反應(yīng)。即，它們優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-11。本發(fā)明抗體優(yōu)選是嵌合體，人源化或人類(lèi)抗體或者其抗原結(jié)合部分，并且優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子，其結(jié)合于成熟形式肌肉生長(zhǎng)抑制因子氨基酸40-64或者更加優(yōu)選地結(jié)合于成熟形式肌肉生長(zhǎng)抑制因子氨基酸43-57和/或45-59的區(qū)域。此外，本發(fā)明抗體在體內(nèi)或體外中和肌肉生長(zhǎng)抑制因子生物學(xué)活性。本發(fā)明抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子的單克隆抗體的特異性結(jié)合使得本發(fā)明抗體可以用于治療或預(yù)防與肌肉生長(zhǎng)抑制因子相關(guān)的病癥、疾病或者紊亂，即這些病癥、疾病或者紊亂的治療或預(yù)防受益于降低的肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平或者受拮抗的或者受抑制的肌肉生長(zhǎng)抑制因子的生物學(xué)活性。此外，本發(fā)明抗體可以用于診斷或者監(jiān)測(cè)治療或預(yù)防受益于改變的肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平或者其生物學(xué)活性的病癥、疾病或者紊亂，或者用于在樣本中測(cè)定肌肉生長(zhǎng)抑制因子的水平。14本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體結(jié)合的抗原性表位發(fā)現(xiàn)位于成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子(人類(lèi)SEQIDNO:1)的氨基酸40-64，優(yōu)選地位于成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子的氨基酸43-57和/或45-59。此外，本發(fā)明的肌肉生長(zhǎng)抑制因子免疫原性表位位于成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子(人類(lèi)SEQIDNO:l)的氨基酸40-64，優(yōu)選位于任何哺乳動(dòng)物或者鳥(niǎo)類(lèi)成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子的M酸43-57和/或45-59。本發(fā)明的免疫原性表位也是抗原性表位。此外，肌肉生長(zhǎng)抑制因子的氨基酸40-64外的殘基可能影響抗原性結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，從而改變本發(fā)明抗體與抗原性表位的結(jié)合。包含來(lái)自不同物種的部分的單鏈抗體，和嵌合、人源化抗體，以及嵌合或CDR移植的單鏈抗體等等，也包含在本發(fā)明和術(shù)語(yǔ)"抗體"或"修飾抗體"中。這些抗體的不同部分可以通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)化學(xué)地，合成地結(jié)合在一起或使用基因工程技術(shù)制成連續(xù)蛋白質(zhì)。例如，可以表達(dá)編碼嵌合或人源化鏈的核酸從而產(chǎn)生連續(xù)蛋白質(zhì)。此外，也可以產(chǎn)生抗體的功能部分，包含嵌合的、人源化、人類(lèi)或者單鏈抗體的抗原結(jié)合部分。上述抗體的功能部分保留來(lái)源其的全長(zhǎng)抗體的至少一個(gè)抗原結(jié)合功能和/或生物學(xué)功能或生物學(xué)活性。優(yōu)選的功能部分保留相應(yīng)全長(zhǎng)抗體的抗原結(jié)合功能(例如，結(jié)合哺乳動(dòng)物成熟形式肌肉生長(zhǎng)抑制因子的能力)。特別優(yōu)選的功能部分或片段保留抑制哺乳動(dòng)物成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子的一個(gè)或者多個(gè)功能或生物活性(例如結(jié)合活性、信號(hào)活性，和/或細(xì)胞反應(yīng)的刺激)的能力。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，功能部分或者片段可以抑制成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子與一個(gè)或者多個(gè)其配體的相互作用，和/或可以抑制一個(gè)或者多個(gè)受體介導(dǎo)的功能。本發(fā)明也包含能夠結(jié)合成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子或其部分(優(yōu)選地在成熟肌肉生長(zhǎng)抑制因子氨基酸40-64、43-57和/或45-59)的抗體部分或片段，包含但不僅局限于Fv、Fab、Fab，和F(ab，)2片段。這樣的片段可以通過(guò)酶法裂解或重組技術(shù)產(chǎn)生。例如，木瓜酶或者胃蛋白酶裂解可以分別產(chǎn)生Fab或F(ab，)2片段。最小的抗原結(jié)合片段是Fv，由HCVR和LCVR結(jié)構(gòu)域組成。由HCVR-CH1和LCVR-CL結(jié)構(gòu)域組成的Fab片段通過(guò)恒定區(qū)間的二硫鍵共價(jià)連接。當(dāng)在宿主細(xì)胞中共表達(dá)時(shí)，為了克服Fv中非共價(jià)鍵連接的HCVR和LCVR結(jié)構(gòu)域解離的趨勢(shì)，可以構(gòu)成所謂的單鏈(sc)Fv片段(scFv)，其中柔性的和適當(dāng)長(zhǎng)度的多肽或者將HCVR的C-末端連接到LCVR的N-末端或者將LCVR的C-末端連接到HCVR的N-末端。通常使用的接頭是15殘基(Gly4Ser)3的肽，但是本本領(lǐng)域也已知其他接頭。也可以使用在自然終止位點(diǎn)上游引入一個(gè)或多個(gè)終止密碼子的抗體基因生成各種截短形式的抗體。例如，編碼F(ab，)2重鏈部分的嵌合基因可以設(shè)計(jì)成包含編碼重鏈CHi區(qū)域和鉸鏈區(qū)DNA序列的基因。不穩(wěn)定Asn殘基的識(shí)別^艮多方法可以用來(lái)檢測(cè)或者量化蛋白質(zhì)(例如抗體)中不穩(wěn)定Asn殘基的自發(fā)修飾。脫酰胺作用(一種導(dǎo)致天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)變成異天冬氨酸和天冬氨酸混合物，其可提供蛋白質(zhì)降解的信號(hào)的修飾)引入負(fù)電荷并改變蛋白質(zhì)質(zhì)量(NH2vsOH，A=lDa)和疏7JC性。分離技術(shù)包括電學(xué)方法或?qū)游龇ǎ?，IEF、cIEF、尿素凝膠電泳、反相PHLC、離子交換PHLC和親水性相互作用，可用來(lái)分開(kāi)或者分離抗體或蛋白質(zhì)或多肽的脫酰胺化或經(jīng)裂解的形式。離子交換層析法廣泛應(yīng)用于分離脫酰胺化的蛋白質(zhì)?？贵w或蛋白質(zhì)或多肽的自發(fā)修飾的位置以及程度可以通過(guò)液相層析/質(zhì)譜分析(LC/MS)和N-末端序列測(cè)定而進(jìn)一步地得到表征。不穩(wěn)定Asn殘基的取代或抗體的其他修飾為了除去抗體或其他蛋白質(zhì)中的不穩(wěn)定Asn殘基，例如通過(guò)氨基酸取代，不穩(wěn)定Asn殘基可由單一M酸取代。希望的是M酸取代不改變(即，陰性的)或者4艮少(例如，10%、5%、4%、3%、2。/?；蛘吒?改變抗體和抗原的結(jié)合親和力。更加希望的是氨基酸取代不改變(即，陰性的)或者很少改變抗體的中和作用，表位特異性和抗體優(yōu)先結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是結(jié)合GDF-ll的能力。ELISA可以用來(lái)測(cè)定單獨(dú)的M酸取代對(duì)本發(fā)明抗體與肌肉生長(zhǎng)抑制因子或其抗原性表位的結(jié)合親和力的影響，并且將16ELISA值與其親本抗體(例如，C12或510C2抗體)結(jié)合同樣抗原的值進(jìn)行比較?；蛘?，可以使用BIACORE⑧或KINEXA⑧試驗(yàn)測(cè)量抗體的結(jié)合親和力。本發(fā)明抗體可以進(jìn)一步地例如在CDR結(jié)構(gòu)域中誘變(或者在除去導(dǎo)致親本抗體不穩(wěn)定的Asn殘基前誘變)，以產(chǎn)生具有例如結(jié)合親和力、IC5。、特異性等等最佳目標(biāo)特性的變異抗體。優(yōu)選通過(guò)氨基酸取代產(chǎn)生的本發(fā)明抗體，且其具有至少一種親本抗體分子的氨基酸殘基被除去并且在其位置插入一種不同的殘基。此類(lèi)取代誘變最希望發(fā)生的部位包括CDR區(qū)域，但是也涵蓋FR改變。生成取代變體的簡(jiǎn)便方法是使用噬菌體展示的親和力成熟。簡(jiǎn)要地講，突變一些CDR區(qū)的位點(diǎn)以在各個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生所有可能的氨基酸取代。如此產(chǎn)生的抗體變體以與包裝于每個(gè)顆粒中的M13的基因III產(chǎn)物的融合在絲狀噬菌體顆粒上以單價(jià)形式展示。正如本文公開(kāi)的，篩選噬菌體展示變體的生物學(xué)活性(例如，結(jié)合親和力、特異性、IC5Q)。為了識(shí)別用于修飾的候選CDR區(qū)域位點(diǎn)，進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以用來(lái)識(shí)別對(duì)抗原結(jié)合有顯著作用的CDR區(qū)域殘基。或者或此外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)有益于識(shí)別抗體和肌肉生長(zhǎng)抑制因子間的接觸點(diǎn)。根據(jù)本文詳細(xì)描述的技術(shù)或者本領(lǐng)域已知的技術(shù)，此類(lèi)接觸殘基和附近的殘基是取代的候選者。或者或此外，隨^L誘變可能發(fā)生在一個(gè)或者多個(gè)CDR序列的一個(gè)或者多個(gè)殘基位置上，其間該CDR或者有效地連接于可變區(qū)或者該CDR區(qū)相對(duì)其他可變區(qū)序列是獨(dú)立的，然后使用重組DNA技術(shù)使該改變的CDR返回到可變區(qū)。一旦產(chǎn)生和表達(dá)這樣的變異抗體，正如本文描述的對(duì)變體組進(jìn)行篩選，可以篩選出在一個(gè)或者多個(gè)相關(guān)試驗(yàn)中具有較好特性的抗體并且將其用作進(jìn)一步的研究?？贵w表達(dá)本發(fā)明還涉及表達(dá)本發(fā)明抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體或其中部分的細(xì)胞系?？梢酝ㄟ^(guò)使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)制造和分離產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的細(xì)胞系。優(yōu)選的細(xì)胞系包括COS、CHO、SP2/0、NS0和酵母(可以從公共保藏單位獲得，例如ATCC，美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，Manassas,VA)。多種宿主表達(dá)系統(tǒng)可以用來(lái)表達(dá)本發(fā)明的抗體，包含原核(細(xì)菌的)和真核表達(dá)系統(tǒng)(例如酵母，桿狀病毒，植物，哺乳動(dòng)物和其他動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，和雜交瘤細(xì)胞)，以及噬菌體展示表達(dá)系統(tǒng)。適當(dāng)?shù)募?xì)菌表達(dá)載體的實(shí)例是pUC119而適當(dāng)?shù)恼婧吮磉_(dá)載體是DHFR選擇系統(tǒng)減弱的經(jīng)修飾的pcDNA3.1載體。其他的抗體表達(dá)系統(tǒng)也是本領(lǐng)域已知的并且涵蓋于本文中。本發(fā)明抗體可以通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因而制備。為了表達(dá)重組抗體，一個(gè)或者多個(gè)攜帶編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和/或重鏈的DNA片段的重組表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，感染或者類(lèi)似方式而導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，從而使得輕鏈和/或重鏈在宿主細(xì)胞中表達(dá)?？蓮脑谝粋€(gè)載體中的與重鏈和/或輕鏈有效連接的不同啟動(dòng)子獨(dú)立地表達(dá)重鏈和/或輕鏈，或者可選擇地，從在兩個(gè)載體中的與重鏈和/或輕鏈有效連接的不同啟動(dòng)子獨(dú)立地表達(dá)重鏈和/或輕鏈--"個(gè)表達(dá)重鏈，一個(gè)表達(dá)輕鏈。任選地重鏈和輕鏈可在不同的宿主細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，重組抗體被分泌到培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，從其中回收和純化抗體。用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因合并到重組表達(dá)載體中，并將這些載體導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。編碼HCVR區(qū)域的分離的DNA可以通過(guò)將HCVR編碼DNA有效連接到另一個(gè)編碼重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)的DNA分子而轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人類(lèi)重鏈恒定區(qū)基因序列是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如Kabat等人,5^rwewcesiV她/"s6>/7m附w鼎/ogZcfl//"tems^,第五版，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIH公布號(hào)91-3242(1991)?？梢酝ㄟ^(guò)例如標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得包含這些區(qū)域的DNA片段。重鏈恒定區(qū)可以是如Kabat(同上)所描述的任何類(lèi)型，(例如IgG、IgA、IgE、IgM或IgD),類(lèi)另iJ(例如IgG!、IgG2、IgG3和IgG4)或亞類(lèi)恒定區(qū)及其任何異型的變體?；蛘撸乖Y(jié)合部分可以是Fab片段，F(xiàn)ab，片段、F(ab，h片段、Fd或單鏈Fv片段(scFv)。對(duì)于Fab片段重鏈基因，編碼HCVR的DNA可以有效地連接到另一個(gè)僅僅編碼重鏈CH1恒定區(qū)的DNA分子上。編碼LCVR區(qū)域的分離的DNA可以通過(guò)將編碼LCVR的DNA有效連接到另一個(gè)編碼輕鏈恒定區(qū)CL的DNA分子而轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因(以及轉(zhuǎn)化為Fab輕鏈基因)。本領(lǐng)域已知人類(lèi)輕鏈恒定區(qū)基因序列。參見(jiàn)，例如Kabat(同上)。可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得包含這些區(qū)域的DNA片段。輕鏈恒定區(qū)可以是K或k恒定區(qū)。為了生成scFv基因，編碼HCVR和LCVR的DNA片段有效地連接到另一個(gè)編碼柔性接頭的片段上，例如編碼M^列(Gly4-Ser)3的片段，這樣HCVR和LCVR序列可表達(dá)為連續(xù)的單鏈蛋白質(zhì)，LCVR和HCVR區(qū)域通過(guò)柔性接頭而連接在一起。為了表達(dá)本發(fā)明的抗體，將如上描述所獲得的編碼部分或者全長(zhǎng)輕鏈和/或重鏈的DNA插入到表達(dá)載體中，從而使得基因有效地與轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列相連接。選擇與使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)控制序列。將抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因插入不同的栽體，或者更典型地，將兩種基因插入相同的表達(dá)栽體?？贵w基因通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達(dá)載體。此外，重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體輕鏈和/或重鏈從宿主細(xì)胞分泌的信號(hào)肽?？辜∪馍L(zhǎng)抑制因子單克隆抗體輕鏈和/或重鏈基因可以克隆到載體，這樣信號(hào)肽可以有效地以符合讀框的方式連接到抗體鏈基因的氨基端。信號(hào)肽可能是免疫球蛋白信號(hào)肽或者異源性信號(hào)肽。除了抗體重鏈和/或輕鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體攜帶控制宿主細(xì)胞內(nèi)抗體鏈基因表達(dá)的調(diào)控序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"包括啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和其他的表達(dá)控制元件(例如多腺苷酸信號(hào))，根據(jù)需要，控制抗體鏈基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)控序列的選擇，可以取決于諸如轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇，預(yù)期蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素。針對(duì)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)，優(yōu)選的調(diào)控序列包括導(dǎo)致在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)高水平表19達(dá)的病毒元件，諸如來(lái)源于巨細(xì)胞病毒(CMV)，猿猴病毒(SV40)，腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。除了抗體重鏈和/或輕鏈基因和調(diào)控序列以外，本發(fā)明重組表達(dá)載體可攜帶其他序列，例如在宿主細(xì)胞調(diào)控載體復(fù)制的序列(例如復(fù)制起點(diǎn))以及一個(gè)或者多個(gè)可選擇的標(biāo)記基因。可選擇的標(biāo)記基因有利于已經(jīng)導(dǎo)入了載體的宿主細(xì)胞的選擇。例如，典型的可選擇標(biāo)記基因?qū)е螺d體已導(dǎo)入的宿主細(xì)胞對(duì)藥物，諸如G418、均霉素或氨甲喋呤的抗性。優(yōu)選地，可選擇的標(biāo)記基因包含二氬葉酸還原酶(DHFR)基因(與氨甲喋呤一起用于DHFR陰性宿主細(xì)胞的選擇/擴(kuò)增)，wm基因(用于G418選擇)，和用于GS陰性細(xì)胞系(例如NSO)的選擇/擴(kuò)增的谷氨酰胺合成酶(GS)。為了表達(dá)輕鏈和/或重鏈，將編碼重鏈和/或輕鏈的表達(dá)載體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法導(dǎo)入到宿主細(xì)胞，例如電穿孔、磷酸鉀沉淀、DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染等等。盡管從理論上講，無(wú)論在原核或真核宿主細(xì)胞中皆可能表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是優(yōu)選真核細(xì)胞，并且最優(yōu)選哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，因?yàn)檫@樣的細(xì)胞更容易組裝和分泌正確折疊的和免疫活性的抗體。優(yōu)選地表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳宿主細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞、和SP2/0細(xì)胞。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入哺乳宿主細(xì)胞中后，通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體，宿主細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為足以允許宿主細(xì)月包表達(dá)抗體的時(shí)間，或者優(yōu)選地，將抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中?？梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法從宿主細(xì)胞和/或培養(yǎng)基中回收抗體。通過(guò)傳統(tǒng)的技術(shù)，宿主細(xì)胞可以用來(lái)產(chǎn)生完整抗體的部分或者片段，例如，F(xiàn)ab片段或者scFV分子。熟練的技術(shù)人員理解上述步驟的變化仍然屬于本發(fā)明的范圍。例如，可以用編碼本發(fā)明抗體的輕鏈或者重鏈的DNA轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞。重組DNA技術(shù)也可以用于除去編碼并非結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子所必須的重鏈或者輕鏈中的一種或者兩種的部分或者全部DNA。此類(lèi)截短的DNA分子表達(dá)的分子也包含在本發(fā)明的抗體中。在本發(fā)明抗體重組表達(dá)的優(yōu)選系統(tǒng)中，編碼抗體重鏈和抗體輕鏈兩者的重組表達(dá)載體通過(guò)例如磷酸釣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染而引入到CHO細(xì)胞中。在重組表達(dá)載體中，抗體重鏈和輕鏈基因分別有效連接到增強(qiáng)子/啟動(dòng)子調(diào)控元件以驅(qū)動(dòng)該基因的高水平轉(zhuǎn)錄。重組表達(dá)載體也攜帶DHFR基因，允許通過(guò)氨甲喋呤選擇/擴(kuò)增而選擇已轉(zhuǎn)染載體的CHO細(xì)胞。培養(yǎng)挑選出的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞從而表達(dá)抗體重鏈和輕鏈并從培養(yǎng)基中回收完整的抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞和從培養(yǎng)基中回收抗體。本發(fā)明抗體，或其抗原結(jié)合部分可在人類(lèi)免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物(例如小鼠)中表達(dá)(參見(jiàn)例如Taylor等人，7V"c/"U"Vfci"20:6287-95，1992)。用途正如本文描述的，本發(fā)明抗體可以用于治療，預(yù)防，^t斷和研究。本病。以相似的方式，本發(fā)明抗體可以用于正在進(jìn)^f亍肌肉生長(zhǎng)抑制因子相關(guān)病癥治療的患者的肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平監(jiān)測(cè)試驗(yàn)?？贵w的治療用途肌肉生長(zhǎng)抑制因子在肌肉發(fā)育和許多相關(guān)紊亂和疾病中發(fā)揮作用。對(duì)于成年人，肌肉生長(zhǎng)抑制因子mRNA主要在骨骼肌中檢測(cè)到，也可以在脂肪組織和心臟組織中檢測(cè)到低濃度的肌肉生長(zhǎng)抑制因子(Sharma，M.等人，丄CW/尸/i戸/。/.180:1，1999)。肌肉生長(zhǎng)抑制因子敲除的小鼠的肌肉量是同窩出生的野生型小鼠的兩倍到三倍。增加的肌肉量是纖維肥大和增生的結(jié)果(McPherron，A.等人，7V"/""387:83-卯，1997和Zhu，X.等人，i^J5S474:71)。此外，肌肉生長(zhǎng)抑制因子敲除的小鼠脂肪積累少于同窩出生的野生型小鼠，但是其他方面表現(xiàn)為正常和健康。最近顯示肌肉生長(zhǎng)抑制因子是脂肪生成的重要調(diào)節(jié)子(Rebbapragada,A.等人，Mo/,am/CW/.祝汰23:7230-7242，2003)。此外，最近在肌肉生長(zhǎng)抑制因子缺陷的小鼠中21研究了其骨結(jié)構(gòu)和含量(HamrickM.W.等人，/.Ow^/7"^//cZe^wrA21:1025,2003;Hamrick,M.W.等人，CW"/77Me71:63，2002)。因此，包含本發(fā)明抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體的組合物可以用來(lái)增加肌肉量，增加骨密度，降低肌肉萎縮，或者可以用于治療或者預(yù)防其中存在的肌肉生長(zhǎng)抑制因子導(dǎo)致或者促使不良病理影響的病癥，或者肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平的降低在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選在人類(lèi)中具有治療作用。優(yōu)選地，可以使用包含本發(fā)明抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體的組合物來(lái)增加肌肉量。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體可以用來(lái)治療或者預(yù)防肌肉萎縮、肌損傷、外科、損傷肌肉的修復(fù)、虛弱、年齡相關(guān)少肌癥、廢用性萎縮、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、韌帶生長(zhǎng)和修復(fù)、肥胖癥、抑制機(jī)體脂肪堆積、肥胖癥、任何類(lèi)型的肌營(yíng)養(yǎng)不良、病危護(hù)理肌病、酒精中毒性肌病、惡病質(zhì)(例如，癌癥相關(guān)的或者HIV誘導(dǎo)的，或者COPD,慢性肺病，膿毒癥恢復(fù)，腎衰竭、肝衰竭、心衰竭或者心臟病所導(dǎo)致的)、代謝綜合癥、燒傷后肌肉萎縮以及II型糖尿病。更加優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體可以用于治療和預(yù)防肌肉萎縮、虛弱、年齡相關(guān)少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)。最為優(yōu)選地，本發(fā)明抗體用于治療和預(yù)防廢用性萎縮或惡病質(zhì)。廢用性萎縮可能由多種原因和包括任何導(dǎo)致長(zhǎng)期固定或者廢用或者臥床的紊亂或者疾病或者狀況的事件引起，包括但不局限于，實(shí)體器官移植、關(guān)節(jié)置換、中風(fēng)、脊髓損傷、嚴(yán)重?zé)齻謴?fù)、坐式的長(zhǎng)期血液透析、膿毒癥后恢復(fù)和暴露于孩i重力。因?yàn)榧∪馍L(zhǎng)抑制因子的序列和功能在物種間高度保守，本發(fā)明抗體可以用于非人類(lèi)哺乳動(dòng)物或者禽類(lèi)[例如家畜(例如犬科和貓科)、運(yùn)動(dòng)性動(dòng)物(例如馬類(lèi))、食源性動(dòng)物(例如牛、豬和羊)、禽類(lèi)(例如雞、火雞、其他獵鳥(niǎo)或家禽)的增加肌肉量，增加骨密度或治療或預(yù)防疾病。其中存在的肌肉生長(zhǎng)抑制因子導(dǎo)致或者促使不良病理影響或者降低的肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平有治療作用。本文涵蓋了^f吏用本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體治療或預(yù)防至少一種前述紊亂，其中肌肉生長(zhǎng)抑制因子活性是有害的或者該紊亂的治療或預(yù)防受益于降低的肌肉生長(zhǎng)抑制因子生物活性水平。此外，涵蓋了本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體在制造用于治療至少一種前述紊亂的藥物中的用途。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"治療""處理"等等，是指獲得預(yù)期的藥理的和/或生理效應(yīng)。從部分或者完全治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良^Jl角度而言，這種效應(yīng)可能是治療性的。本文使用的"治療"，包括向哺乳動(dòng)物，尤其是人施用本發(fā)明化合物來(lái)治療其疾病或者病癥，包括(a)抑制疾病，即，抑制其M;和(c)緩解疾病，即，使得疾病或者紊亂消退或者緩解其癥狀或并發(fā)癥?？梢哉{(diào)整給藥方案以提供最佳的預(yù)期反應(yīng)。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"是指完全或者部分預(yù)防疾病或其癥狀。如本文使用的"預(yù)防"，包含向受試者施用本發(fā)明的化合物來(lái)預(yù)防疾病的發(fā)生，該受試者可能易于罹患該疾病但是還未被診斷出來(lái)罹患該疾病。組合物本發(fā)明的抗體可以合并到適合患者服用的藥物組合物中。本發(fā)明化合物可以單獨(dú)給藥或者與可藥用載體，稀釋劑和/或輔料組合，單劑量或者多倍劑量給藥。設(shè)計(jì)給藥組合物以適合選定的給藥模式，且適當(dāng)?shù)厥褂每伤幱孟♂寗d體和/或輔料，例如+軟劑，緩沖液，表面活性劑，防腐劑，增溶劑、等滲劑，穩(wěn)定劑等等。所述的組合物是根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)設(shè)計(jì)的，例如Remington,5Wewce尸m"/ce尸/r"r附tfcy,第19版，Gennaro編著，MackPublishingCo.，Easton，PA1995，它提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的配制技術(shù)的一覽表。本發(fā)明組合物優(yōu)選是"治療有效量"或"預(yù)防有效量"的本發(fā)明的抗體。"治療有效量"是指在必要的劑量和持續(xù)時(shí)間有效獲得預(yù)期治療效果的量?？贵w的治療有效量可能根據(jù)多種因素而不同，例如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重，以及抗體或抗體部分在個(gè)體中引發(fā)預(yù)期反應(yīng)的能力。治療有效量也是指抗體的治療有益效果優(yōu)于其任何的毒性或有害影響的量。"預(yù)防有效量"是指在必要的劑量和持續(xù)時(shí)間有效獲得預(yù)期預(yù)防效果23的量。典型地，因?yàn)轭A(yù)防劑量是在受試者患病之前或者在疾病早期使用，所以預(yù)防有效劑量可能比治療有效量低。治療有效量或預(yù)防有效量至少是對(duì)患者提供治療效果所必需的活性劑的最小劑量，但是低于毒性劑量。用另一種方式來(lái)講，本發(fā)明抗體的治療有效量是指在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選在人類(lèi)中增加肌肉量，增加骨密度，或者治療其中存在的肌肉生長(zhǎng)抑制因子導(dǎo)致或者促使不良病理影響，或者在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選在人類(lèi)中降低肌肉生長(zhǎng)抑制因子水平導(dǎo)致有效治療效果的劑量，包含但不局限于肌肉萎縮、肌損傷、外科虛弱、年齡相關(guān)少肌癥、廢用性萎縮、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、韌帶生長(zhǎng)和修復(fù)、肥胖癥、抑制機(jī)體脂肪堆積、任何類(lèi)型的肌營(yíng)養(yǎng)不良、病危護(hù)理肌病、惡病質(zhì)(例如癌癥相關(guān)或者HIV誘導(dǎo)的，或者COPD、腎衰竭、肝衰竭、心衰竭或者心臟病導(dǎo)致的)、代謝綜合癥以及II型糖尿病。廢用性萎縮可能由多種原因或事件導(dǎo)致，包括導(dǎo)致長(zhǎng)期固定或廢用或臥床的任何紊亂或疾病或狀況，其中包括但不局限于，實(shí)體器官移植、關(guān)節(jié)置換、中風(fēng)、脊髓損傷、嚴(yán)重?zé)齻謴?fù)、坐式長(zhǎng)期血液透析、膿毒癥后恢復(fù)和暴露于微重力。本發(fā)明抗體的給藥途徑是胃腸外給藥。優(yōu)選地，本發(fā)明抗體可以合并入適合胃腸外給藥的藥物組合物中。本文使用的術(shù)語(yǔ)胃腸外給藥包含靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，直腸，陰道或者內(nèi)給藥。優(yōu)選靜脈內(nèi)或皿內(nèi)或皮下注射的外周系統(tǒng)給藥。適于這些注射的介質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。所述組合物典型地必須是無(wú)菌的并且在制造條件下和在提供的容器中保存的情況下是穩(wěn)定的，容器包括例如密封小瓶或注射器。因此，組合物在配制后必須經(jīng)過(guò)無(wú)菌過(guò)濾，或者制成微生物學(xué)上可接受的。靜脈輸注的典型組合物的體積是20-1000mL的液體，例如無(wú)菌林格氏溶液、生理鹽水、葡萄糖溶液和Hank氏溶液和治療有效量(例如1到1000mg)的抗體濃度。劑量可能根據(jù)疾病的類(lèi)型和嚴(yán)重程度而不同。正如在醫(yī)學(xué)技術(shù)中所熟知的，任何一個(gè)患者的劑量取決于很多因素，包括患者的體積、體表面積、年齡、施用的特定組合物、性別、給藥時(shí)間和途徑、一般健康狀況、和同時(shí)施用的其他藥物。例如，典型的劑量可能是l到1000mg;然而，也考慮低于或者超出該示例范圍的劑量，尤其是在考慮到上面的因素時(shí)。典型的給藥方案可能是每天，每周，每?jī)芍芑蛘呙吭?。典型的胃腸外給藥方案可能是總體重大約10jug/kg到大約20mg/kg，優(yōu)選地從大約20嗎/kg到大約10mg/kg。通過(guò)定期評(píng)估監(jiān)測(cè)整個(gè)過(guò)程。關(guān)于重復(fù)給藥，取決于狀態(tài)，可在發(fā)生疾病癥狀預(yù)期的抑制或者疾病癥狀預(yù)期的預(yù)防前進(jìn)行重復(fù)治療。然而，其他的給藥方案也可能有用，因此不排除。這些建議的抗體量受很多治療學(xué)考慮的影響。選擇合理的劑量和計(jì)劃安排的關(guān)鍵因素是獲得的結(jié)果。本文中考慮的因素包括治療的特定紊亂，治療的特定哺乳動(dòng)物，個(gè)體患者的臨床狀況，紊亂的原因，抗體給藥的部位，抗體的特定類(lèi)型，給藥方法，給藥的計(jì)劃安排和醫(yī)生已知的其他因素。本發(fā)明的治療制劑可能采用冷凍或凍干的形式儲(chǔ)藏，^使用前在適當(dāng)?shù)臒o(wú)菌栽體中重構(gòu)。凍干和重構(gòu)可能導(dǎo)致抗體活性不同程度的損失?？赡苄枰{(diào)整劑量進(jìn)行補(bǔ)償。一般情況下優(yōu)選pH6-8。制品在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含用于治療或預(yù)防上述描述的病癥或狀況的材料的制品。制品包括容器和標(biāo)簽。適當(dāng)?shù)娜萜靼?，例如瓶、小瓶、注射器和試管。容器可以使用玻璃或塑料等各種材料制成。容器儲(chǔ)藏能有效預(yù)防或治療紊亂或病癥的本發(fā)明組合物，可能有無(wú)菌通道(例如容器可能是具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈溶液包或小瓶)。組合物的活性成分是本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子抗體。容器的或與容器相關(guān)的標(biāo)簽指示本組合物用來(lái)治療選擇的病癥。制品可能進(jìn)一步包含第二個(gè)容器，其中包含可藥用緩沖液，例如磷酸鹽緩沖鹽水，Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。其可能進(jìn)一步包括其他商業(yè)者和使用者需要的其他材料，包括其他的緩沖液，稀釋液，過(guò)濾器，針頭，注射器，和說(shuō)明用法的包裝說(shuō)明書(shū)。以下的實(shí)施例僅僅是為了說(shuō)明目的而提供的，在任何方面都不希望限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1:確定MabC12和510C2的裂解位點(diǎn)在各種緩沖溶液(10mM檸檬酸鹽pH5，10mM檸檬酸鹽pH6，10mM檸檬酸鹽pH7，和10mM檸檬酸鹽/150mMNaClpH7)中的lmg/mL抗體溶液在不同的溫度(-20。C、4。C、25。C和40。C)下孵育4周。孵育后，通過(guò)十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)樣品的特征。對(duì)于包含C12或510C2可變結(jié)構(gòu)域(在多個(gè)Fc同種型的情況中)的抗體，可以觀察到抗體重鏈和輕鏈的預(yù)期條帶外的其它條帶。這些條帶只能在pH7下(含有或者不含NaCl)孵育的樣本中觀察到；在樣本裂解情況下，可以觀察到兩條帶，具有8-10kDa和12-14kDa的表觀質(zhì)量，在樣本不裂解下，可以觀察到一條表觀質(zhì)量8-10kDa的條帶。通過(guò)這些條帶的相對(duì)強(qiáng)度測(cè)定的裂解程度似乎是pH值依賴的(因?yàn)樵趐H6孵育的樣本，其條帶的強(qiáng)度較低，對(duì)于在pH5孵育的樣本，其條帶不明顯)和溫度依賴的。為了進(jìn)一步判斷裂解位置，并且量化裂解的程度，使用液相色讒法/質(zhì)鐠分析法(LC/MS)和N-末端序列測(cè)定來(lái)進(jìn)一步了解同種抗體溶液的特性。通過(guò)LC/MS分析樣本采取以下步驟進(jìn)行。對(duì)于部分裂解的抗體，化L的各個(gè)樣本與36pL水混合。然后，15jtL每種溶液與0.5pL的3M，pH8.0的Tris-HCl緩沖液以及0.5jiL的50mg/mLDTT和45pL的水混合。每種樣本的兩份溶液使用LC/MS進(jìn)行分析。對(duì)于去糖基化的抗體，3pL每種樣本與60pL水，l.OpL的3M，pH8.0的tris-HCl緩沖液和l.OpL的PNGaseF溶液(PROZYME,1U/mL)混合。將溶液在37°C孵育6小時(shí)，然后用LC/MS進(jìn)行分析。對(duì)于完全胰蛋白酶消化的抗體，20nL每種樣本在高速真空系統(tǒng)中凍干，然后在4.5|nL的7M鹽酸胍，pH8.0的0.4Mtris-HCI緩沖液和0.5pL的50mg/mLDTT溶液中重構(gòu)。該溶液在37。C孵育40分鐘然后用95pL水稀釋。每種溶液用2.0pL的0.5mg/mL豬胰蛋白酶在37°C處理3小時(shí)。用乙酸酸化溶液然后用LC/MS或LC/MS/MS分析。使用WatersHPLC/LCTpremier或者Q-TOF樹(shù)^t諳儀對(duì)完整的、部分裂解的、或者去糖基化的樣本進(jìn)行分析。根據(jù)樣本和需求對(duì)HPLC和質(zhì)語(yǔ)儀的^t26設(shè)置進(jìn)4于調(diào)整。在pH7,40°C時(shí)孵育4周的C12抗體的解巻積質(zhì)if(deconvolutedmassspectra)表現(xiàn)為兩個(gè)峰，質(zhì)量為134894和145116Da。兩者之間的質(zhì)量區(qū)別大約為10220Da，與輕鏈N-末端肽l-93預(yù)期的殘基質(zhì)量(預(yù)期10221.4Da)相匹配。通過(guò)LC/MS分析部分裂解樣本而證實(shí)了該結(jié)果。在這個(gè)樣本中，檢測(cè)到3種質(zhì)量；23312.7，13091.3和10239.4Da，與完整輕鏈l-219(預(yù)期23313.1Da)，輕鏈C-末端肽94-219(預(yù)期13091.6Da)和輕鏈N-末端肽1-93(預(yù)期10239.4Da)—致。510C2抗體也得到基本相同的結(jié)果，盡管該抗體裂解產(chǎn)物的數(shù)量相對(duì)較低。表l總結(jié)了部分裂解樣本分析測(cè)定的裂解的輕鏈的百分比。N-末端序列分析也用于檢測(cè)孵育樣本的特征。使用AppliedBiosystemInc.(ABI)氣相(GP-PVDF)方法對(duì)施加于PROSORB樣品制備柱的樣本進(jìn)行自動(dòng)埃德曼(Edman)降解氨基酸序列分析。每個(gè)殘基于55。C以325pL/分鐘流速在sphere-5PTH220x2.1mmABIBROWNLEE⑧柱上進(jìn)行分析。使用ABI的Model610A數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)于在40。C孵育的抗體樣本，可以觀察到兩個(gè)序列；對(duì)于C12，觀察到的兩個(gè)序列是"DIQMTQ"(SEQIDNO:34)，此序列對(duì)應(yīng)C12輕鏈預(yù)期的N-末端和"PLTFGG"(SEQIDNO:35)，此序列對(duì)應(yīng)C12輕鏈的殘基94-99。對(duì)孵育的510C2抗體溶液的分析得到同樣的結(jié)果。使用每種序列的相對(duì)量，計(jì)算裂解的產(chǎn)品的含量，并總結(jié)在表l中。27表1.Asn93-Pro94肽鍵裂解程度小結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例2:在C12和510C2抗體中除去化學(xué)裂解位點(diǎn)為了除去C12和510C2中的裂解位點(diǎn)，使用每種氨基酸的單一氨基酸取代代替兩種單克隆抗體中位于CDRL3的天冬酰胺殘基。使用ELISA測(cè)定相比較于C12或510C2Fab的各個(gè)M酸取代對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制因子親和力的影響。ELISA平板中每孔加入50pL用碳酸鹽緩沖液(50mMNaHC03pH8.3)稀釋為4ug/ml的肌肉生長(zhǎng)抑制因子。用密封帶密封平板并在4°C孵育過(guò)夜。然后，使用自動(dòng)平板清洗器將平板(GreinerU-bottom平板，目錄號(hào)650061)用PBS-T(0.1。/。Tween-20)清洗3次。每孔加入200pL封閉緩沖液(PBS+l。/。BSA+0.1。/。Tween-20)并在室溫下孵育1小時(shí)。清洗平板并在每孔中加入50jtl樣本。樣本由periprepFab與PBST/BSA首先以1:3稀釋?zhuān)缓筮M(jìn)行一系列半對(duì)數(shù)稀釋而構(gòu)成。清洗平板并在每孔中加入50pL二抗溶液(1:2000稀釋在PBST/BSA中的山羊抗人-k-AP,SouthernBiotech,目錄號(hào)2060-04)。再次清洗后，每孔加入100pLAP底物并且在室溫下孵育大約10分鐘。讀取560nm的吸光度或OD值。每個(gè)ELISA平板中都包含C12或510C2作為親和力參考標(biāo)準(zhǔn)。使用定量ELISA測(cè)定Fab濃度，使用抗Fd抗體(綿羊抗-Fd，Biodesign)結(jié)合蛋白質(zhì)然后用山羊抗人-k-AP(SouthernBiotech)來(lái)測(cè)定。在每個(gè)平板中測(cè)定純化的Fab標(biāo)準(zhǔn)樣品，從而產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定濃度。如ELISA所測(cè)定的，從C12和510C2改良的Fab(其中位于CDRL3的Asn殘基在C12中由H或R代替，而在510C2中由H、S、T或A代替條持了與親本Fab類(lèi)似的對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制因子的親和力。如在同樣Fab濃度下通過(guò)相似的吸光度讀數(shù)確定的每種這些取代產(chǎn)生的ELISA親和力曲線類(lèi)似于相應(yīng)的親本Fab對(duì)照的(見(jiàn)圖4)。然而，如果C12中位于CDRL3的天冬酰胺殘基由纈氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、賴氨酸、丙氨酸、天冬氨酸或谷氨酸，或者在510C2中由精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、色氨酸或脯氨酸取代，相比其親本的Fab，這些取代的每個(gè)都降低了修飾的Fab對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制因子的結(jié)合親和力。此外，對(duì)二肽Asn-Pro的Pro殘基進(jìn)行修飾的嘗試都失敗了，因?yàn)樗械娜〈啾扔谟H本Fab都減低了修飾的Fab對(duì)肌肉生長(zhǎng)抑制因子的結(jié)合親和力。實(shí)施例3:C12抗體及變體LC-N93H之間的裂解比較在10mM磷酸鹽，pH7.4/150mMNaCl中的lmg/mL抗體溶液，在多個(gè)溫度(4。C、25。C和40。C)下孵育4周。孵育后，樣本的特征通過(guò)上述的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳和N-末端序列測(cè)定。在這些情況下，40°C孵育的C12抗體樣本在SDS-PAGE中觀察到除預(yù)期的抗體重鏈和輕鏈條帶之外的附加條帶；在未裂解的情況下觀察到的條帶遷移到8kDa的位置，而在裂解的情況下觀察到的條帶遷移到8kDa和14kDa的位置。相比之下，未觀察到LC-N93H變體出現(xiàn)額外的條帶。孵育樣本的N-末端序列測(cè)定，證實(shí)C12抗體樣本輕鏈中發(fā)生的裂解位于Asn93和Pro94之間，大約10-20%的序列對(duì)應(yīng)新N-末端(PLTFGG(SEQIDNO:35))，然而，對(duì)于LC-N93H變體除了預(yù)期的N-末端序列沒(méi)有額外的輕鏈序列。實(shí)施例4肌肉生長(zhǎng)抑制因子/SBE報(bào)告分子試驗(yàn)在本報(bào)告分子試驗(yàn)中，編碼位于SMAD結(jié)合元件(更具體地講(CAGA)12)下游的熒光素酶基因的質(zhì)粒("SBE-熒光素酶")，當(dāng)諸如肌肉生長(zhǎng)抑制因子、GDF-ll或者其他TGF-(5超家族成員等的分子結(jié)合其受體時(shí)表達(dá)熒光素酶蛋白，因此觸發(fā)SMAD信號(hào)，進(jìn)而導(dǎo)致形成能夠結(jié)合SBE的磚酸化SMAD復(fù)合物。CAGA序列是TGF-(J誘導(dǎo)基因PAI-1的啟動(dòng)子中的TGF-卩應(yīng)答序列(Denner等人，￡7kf50/.，17:3091-3100，1998)。為了產(chǎn)生質(zhì)粒，將SBE重復(fù)序歹寸tcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaa'agccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacactcgagagccagacaaaaagccagacatttagccagacac(SEQIDNO:36)克隆到pGL3曙基礎(chǔ)栽體(Promega弁E1751)的Nhel-HindIII位點(diǎn)。這種質(zhì)粒用來(lái)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293EBNA細(xì)胞。測(cè)量的光量與熒光素酶的產(chǎn)生量成比例，而熒光素酶的產(chǎn)生量與細(xì)胞接觸的肌肉生長(zhǎng)抑制因子數(shù)量成比例。抑制劑(例如，結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子的抗體)的出現(xiàn)降低了能夠活化SEB的肌肉生長(zhǎng)抑制因子的量，并最終導(dǎo)致光量產(chǎn)生的降低。在本試驗(yàn)中，將DMEM/F12培養(yǎng)基(3:1)(Gibco93-0152DK),10。/。FBS，20mMHepes，4mML-谷氨酰胺("完全培養(yǎng)基")中的HEK293EBNA細(xì)胞(EdgeBiosystems)接種到多聚賴氨酸包被孔內(nèi)測(cè)的96孔板(BDBiocoat35-4461)中，每孑L接種大約25000個(gè)細(xì)胞，并在37°C孵育過(guò)夜。第二天，用PBS清洗細(xì)胞并且每孔加入50|lUOptiMEMI(Gibco31985-070)。用下述50jal的SBE-熒光素酶DNA混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合80^1Lipofectamine(Gibco11668-019)和1,5mlOptiMEM并靜置5分鐘，然后將其加入到試管中，其中含有混合的20照SBE-熒光素酶DNA和1.5mlOptiMEM以及200pLPlus試劑(Invitrogen)，混合并且靜置5分鐘。這兩種混合物加到一起后，用力混合溶液并且靜置30分鐘，然后每個(gè)孔中加入50jiL該溶液("轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基")。然后將細(xì)胞在5%<:02,37。C下孵育過(guò)30夜。對(duì)于每種細(xì)胞的平板，將肌肉生長(zhǎng)抑制因子(R&DSystems788-G8)在完全培養(yǎng)基中稀釋到20ng/ml。待檢測(cè)的本發(fā)明的每種抗體都在完全培養(yǎng)基中進(jìn)行滴定，例如從大約40照/ml到大約50ng/ml。從孔中移走轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并在每孔中加入50iaL抗體稀釋液和50pLGDF-8(肌肉生長(zhǎng)抑制因子)或GDF-11(R&DSystems)。然后將細(xì)胞平板在5%C02,37°C下孵育過(guò)夜。第二天，吸走培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞并且加入75pL裂解緩沖液(PromegaE266A)。根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)(PromegaE2620)使用熒光素酶試劑測(cè)定細(xì)胞溶解產(chǎn)物的熒光素酶活性。以Log,oMab濃度(照/ml)對(duì)熒光作圖并且計(jì)算每種肌肉生長(zhǎng)抑制因子和GDF-ll的Mab的IC50。MabC12和來(lái)源于C12的改良單克隆抗體(C12-N93H)，在這些條件下用肌肉生長(zhǎng)抑制因子檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的ICso值分別是大約9.59nM和7.03nM。在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)用GDF-ll而不是肌肉生長(zhǎng)抑制因子檢測(cè)C12和C12-N93H時(shí)，兩者都不表現(xiàn)中和活性，表明改良的抗體與其親本抗體一樣都優(yōu)先結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-11。權(quán)利要求1.一種抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-11，其中所述的抗體結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子的親和力不超過(guò)約3×10-8M，并且當(dāng)其在選自4℃為期1年，25℃為期6個(gè)月，37℃為期2個(gè)月，和40℃為期4周的條件下在抗體溶液中保存時(shí)，其中至少95％的單克隆抗體不裂解。2.權(quán)利要求l的單克隆抗體，其中所述的單克隆抗體結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子的親和力不超過(guò)約9xlO_1GM。3.權(quán)利要求1或2的單克隆抗體，其中所述的單克隆抗體在體外肌肉生長(zhǎng)抑制因子/SBE試驗(yàn)中的IC50小于或者等于約25nM。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述的抗體溶液包含lmg/mL該抗體，10mM磷酸鹽，pH7.4和150mMNaCl。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述的單克隆抗體結(jié)合由選自如ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA(SEQIDNO:29)和CSGECEFVFLQKYPH(SEQIDNO:30)所示的^J^酸序列組成的多肽。6.—種抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其包含序列如SEQIDNO:11所示的重鏈可變區(qū)(HCVR)和序列選自SEQIDNO:4、5、6和7的輕鏈可變區(qū)(LCVR)。7.—種抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其包含序列如SEQIDNO:12所示的HCVR和序列選自SEQIDNO:9和10的LCVR。8.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其中所述抗體包含HCVR和LCVR，其中所述HCVR包含序列如SEQIDNO:23所示的位于CDRH1的肽，序列如SEQIDNO:25所示的位于CDRH2的肽，和序列如SEQIDNO:27所示的位于CDRH3的肽，且其中所述LCVR包含序列如SEQIDNO:13所示的位于CDRL1的肽，序列如SEQIDNO:14所示的位于CDRL2的肽，和序列選自SEQIDNO:16、，17、18和19的位于CDRL3的肽。9.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的單克隆抗體，其中所述抗體包含HCVR和LCVR，其中所述HCVR包含序列如SEQIDNO:24所示的位于CDRH1的肽，序列如SEQIDNO:26所示的位于CDRH2的肽，和序列如SEQIDNO:28所示的位于CDRH3的肽，且其中所述LCVR包含序列如SEQIDNO:13所示的位于CDRL1的肽，序列如SEQIDNO:14所示的位于CDRL2的肽，和序列選自SEQIDNO:21和22的位于CDRL3的肽。10.權(quán)利要求8或9中的單克隆抗體，包含人框架區(qū)。11.權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)的單克隆抗體，包含恒定區(qū)，其中所述的恒定區(qū)起源于人類(lèi)基因組或起源于選自家畜、運(yùn)動(dòng)性動(dòng)物和食源性動(dòng)物的動(dòng)物的基因組。12.—種抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其包含序列如SEQIDNO:32所示的輕鏈和序列如SEQIDNO:33所示的重鏈。13.組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗體和可藥用的載體。14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗體在治療中的應(yīng)用。15.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗體在制造用于提高有需要的受試者的肌肉量的藥物中的用途。16.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的抗體在制造用于治療或預(yù)防肌萎縮、虛弱、年齡相關(guān)的少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)中一種或者幾種病癥的藥物中的用途。17.—種治療需要治療的受試者的肌萎縮、虛弱、年齡相關(guān)的少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)的方法，其是通過(guò)施用治療有效量的本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。18.—種預(yù)防需要預(yù)防的受試者的肌萎縮、虛弱、年齡相關(guān)的少肌癥、廢用性萎縮和惡病質(zhì)的方法，其是通過(guò)施用預(yù)防有效量的本發(fā)明的抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。全文摘要抗肌肉生長(zhǎng)抑制因子單克隆抗體，其優(yōu)選結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子而不是GDF-11，有很強(qiáng)的結(jié)合肌肉生長(zhǎng)抑制因子的結(jié)合親和力并且耐受化學(xué)降解。本發(fā)明的抗體用于在哺乳動(dòng)物和禽類(lèi)中增加肌肉量，增加骨密度，或者治療或預(yù)防各種病癥。文檔編號(hào)A61P21/00GK101511871SQ200780032787公開(kāi)日2009年8月19日申請(qǐng)日期2007年8月23日優(yōu)先權(quán)日2006年9月5日發(fā)明者R·O·塞耶斯,黃立華申請(qǐng)人:伊萊利利公司