專利名稱：肌肉生長抑制素(gdf-8)拮抗劑用于增進(jìn)創(chuàng)傷愈合和防止纖維變性疾病的用途的制作方法
肌肉生長抑制素(GDF-8)拮抗劑用于增進(jìn)創(chuàng)傷愈合和 防止纖維變性疾病的用途發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及用于增進(jìn)創(chuàng)傷愈合、并尤其用于防止在創(chuàng)傷自然愈合期間 在受損組織中出現(xiàn)的疤痕形成及由此的功能喪失的方法和組合物。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷是典型地與生物物質(zhì)的喪失相關(guān)的對組織完整性的破壞。單純創(chuàng) 傷包括皮膚的切傷和擦傷，而較深的對肌肉組織、骨骼系統(tǒng)或內(nèi)部器官的 損傷被定義為復(fù)雜傷、無論創(chuàng)傷類型或組織損害程度，每種創(chuàng)傷都有相似的修復(fù)過程1，2，3。已 認(rèn)識到創(chuàng)傷愈合有三個(gè)不同階段。首先是炎性或滲出階段，以使惡化組織 脫離并清潔創(chuàng)傷；第二是肉芽組織發(fā)育的增殖階段；而第三是分化或再生 階段，用于成熟和疤痕形成1。炎性階段的特征在于止血和發(fā)炎。組織損傷發(fā)生后，由于創(chuàng)傷形成而 被損壞的細(xì)胞膜釋放出血栓素八2和前列腺素2-a，其為強(qiáng)效血管收縮劑。 該最初的應(yīng)答幫助限制出血。然后發(fā)生毛細(xì)血管舒張，而且炎性細(xì)胞(血 小板、嗜中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、和T淋巴細(xì)胞)遷移到創(chuàng)傷位點(diǎn)。尤其是，嗜中性粒細(xì)胞通過吞噬作用而在傷口清潔中起著核心作用。創(chuàng)傷 中接下來出現(xiàn)的細(xì)胞是白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞對創(chuàng)傷愈合是必需的。大量酶和細(xì)胞因子由巨喧細(xì)胞分泌，其包括膠原酶，其能對創(chuàng)傷清創(chuàng)； 白細(xì)胞介素和胂瘤壞死因子(TNF)，其刺激成纖維細(xì)胞(以產(chǎn)生膠原)并促進(jìn) 血管生成；和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，其刺激角質(zhì)化細(xì)胞2。該步驟標(biāo)志著轉(zhuǎn) 換進(jìn)入組織重建的過程中，即增殖階段。增殖階段的特征在于上皮形成、血管生成、肉芽組織形成、和膠原沉 積。TNFa刺激的血管生成對于將營養(yǎng)物遞送到創(chuàng)傷位點(diǎn)中及其周圍而言是 必需的，并且對有效的創(chuàng)傷愈合而言是關(guān)鍵的。肉芽組織形成是復(fù)雜的事 件，其涉及白細(xì)胞、組織細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)>9包，并尤其涉及成纖維細(xì)
胞，其通過產(chǎn)生膠原而促進(jìn)組織生長?？刂圃鲋畴A段的精確步驟和機(jī)理是
未知的。 一些牽涉的細(xì)胞因子包括血小板衍生的生長因子(PDGF)、胰島素 樣生長因子(IGF)和上皮生長因子(EGF)。它們都是膠原形成所必需的2。
創(chuàng)傷愈合的最后階段是分化階段。創(chuàng)傷進(jìn)行收縮，而且肉芽組織變得 液體和血管越來越少，開始變硬，并進(jìn)行重塑用以形成疤痕組織。當(dāng)創(chuàng)傷 包括皮膚損傷時(shí)，創(chuàng)傷愈合的最后階段是上皮形成，其中表皮細(xì)胞遷移， 以重新覆蓋棵露的表面。當(dāng)創(chuàng)傷包括骨骼肌損傷時(shí)，由新的肌肉細(xì)胞通過 分化以形成成肌細(xì)胞的衛(wèi)星細(xì)胞而鋪成(除了增殖階段中的肉芽組織)4。在 創(chuàng)傷愈合的最后階段中，成肌細(xì)胞分化以形成肌管，其成熟并4參入肌肉纖 維。盡管該過程能在創(chuàng)傷位點(diǎn)處恢復(fù)出一些肌肉功能，而肌肉創(chuàng)傷總是會 喪失肌肉組織、結(jié)疤并喪失原有肌肉功能。
當(dāng)前對組織創(chuàng)傷的治療包括改善循環(huán)、由此4吏氧氣和營養(yǎng)物遞送到創(chuàng) 傷位點(diǎn)以改善愈合時(shí)間的方法。這可由機(jī)械來實(shí)現(xiàn)，如通過超聲波處理、 磁和電刺激、凝渦療法和氧氣療法。可是，盡管這些療法能刺激并甚至加 速創(chuàng)傷愈合進(jìn)程，但它們?nèi)耘f會在創(chuàng)傷位點(diǎn)上造成功能和/或美容上的損害
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當(dāng)前利用細(xì)胞因子和生長因子，如TGF-卩、EGF和IGF-1，來研究新的 療法。TNF激動(dòng)劑和拮抗劑也可用于改變血管生成，由此提供顯著的潛力 來直接增進(jìn)愈合進(jìn)程?？墒侵两瘢L因子只在臨床實(shí)踐中起著有限的作 用。當(dāng)前唯一可用的商品是PDGF,其顯示出能減少愈合時(shí)間，但其不能成 功地對創(chuàng)傷愈合的美容或功能方面起改善作用2。
因此，有需求提供新的創(chuàng)傷愈合療法，其能控制創(chuàng)傷愈合進(jìn)程從而使 新組織替代沒有功能或有美容損害的受損組織。
本發(fā)明的目的是以某些方式實(shí)現(xiàn)該需求和/或?yàn)楣娞峁┯杏玫倪x擇。
發(fā)明簡述
令人驚訝地，生長因子——肌肉生長抑制素(myostatin), TGF-P家族 的生長因子成員，首次顯示出涉及創(chuàng)傷愈合過程中。抑制肌肉生長抑制素 活性被發(fā)現(xiàn)能顯著增進(jìn)創(chuàng)傷愈合進(jìn)程。
因此，本發(fā)明提供了增進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合的方法，其包括以下步驟向 有需要的患者施用有效量的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑。本發(fā)明可用
于動(dòng)物和人的創(chuàng)傷愈合中。
在動(dòng)物和人患者中，通過一種或多種以下機(jī)制來增進(jìn)創(chuàng)傷愈合
(a) 減少創(chuàng)傷恢復(fù)的時(shí)間；
(b) 加速并增加炎性應(yīng)答；和
(c) 減少或抑制疤痕組織形成，
由此改善治療的組織的功能和美容表觀。
肌肉生長抑制素拮抗劑可選自任意 一 種或多種已知的肌肉生長抑制素 抑制劑。例如，US 6096506和US 6468535披露了抗肌肉生長抑制素抗體。 US 6369201和WO 01/05820教導(dǎo)了肌肉生長抑制素肽免疫原、月幾肉生長抑 制素多聚體和肌肉生長抑制素免疫綴合物，其能引發(fā)免疫應(yīng)答并阻斷肌肉 生長抑制素活性。肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)抑制劑在WO 02/085306中有公 開，其包括截短的II型激活蛋白(Activin)受體、肌肉生長抑制素前域、和 卵泡抑素。其他衍生自肌肉生長抑制素肽的肌肉生長抑制素抑制劑也是已
肌肉生長抑制素抑制齊'J(WO 00/43781);顯性陰性的肌肉生長抑制素(WO 01/53350),其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替換為酪氨 酸)和成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第 335至375位上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短。 US2004/0181033也教導(dǎo)了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能結(jié)合 并抑制肌肉生長抑制素。
一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑優(yōu)選包含一種或多種選自由肌肉生 長抑制素肽和Piedmontese等位基因組成的組的顯性陰性產(chǎn)物，所述肌肉生 長抑制素肽在氨基酸第335、 350位上或氨基酸第335、 350位之間被C-末 端截短了。
一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑還可包括肌肉生長抑制素剪接變 體，所述剪接變體包含SEQ ID NO: 8-14之任一項(xiàng)的多肽、或其功能片段 或變體、或與其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑還可包括與肌肉生長抑制素途徑有 關(guān)的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑包含多肽SEQ1DNO: 16或SEQIDNO: 18、或 其功能片段或變體、或與其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%
序列同一性的序列。
月幾肉生長抑制素拮抗劑還可包括反義多核苷酸、干擾RNA分子(例如 RNAi或siRNA)、或抗肌肉生長抑制素核酶，其能通過抑制肌肉生長抑制 素的基因表達(dá)來抑制肌肉生長抑制素活性。
當(dāng)一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑包括抗體時(shí)，則抗體可以是源自 哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物的抗體，例如源自鯊魚的IgNAR抗體，或者抗體可 以是人源化抗體、或包含源自抗體的功能片段。
本發(fā)明還提供了 一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑在制備用于增進(jìn)有 需要的患者的創(chuàng)傷愈合的藥物中的用途。
一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑可以選自以上公開的肌肉生長抑制 素拮抗劑組。
藥物可配制成用于局部或全身施用的配方，例如，藥物可配制成向外 傷位點(diǎn)局部施用的配方，或可配制成向內(nèi)傷位點(diǎn)注射的配方。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了組合物，其包含一種或多種肌肉生長抑制素拮抗 劑和藥學(xué)上可接受的載體，其用于增進(jìn)有需要的患者的創(chuàng)傷愈合的方法中。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑，其用于增進(jìn) 有需要的患者的創(chuàng)傷愈合的方法中。
現(xiàn)在，本發(fā)明將參考所附的附片來更詳細(xì)地描述，其中
附圖簡述


圖1A顯示了對野生型和肌肉生長抑制素缺失的小鼠中對照未受 損肌肉切片的蘇木精和曙紅染色；
圖1B顯示了用虎蛇毒素進(jìn)行創(chuàng)傷后一天(D1)的低倍視野；
圖1C顯示了與(B)相同的切片的較高倍視野觀察結(jié)果，染色顯示 了肌纖維嗜曙紅的(e)細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)小的細(xì)胞內(nèi)空泡化(v)，細(xì)胞內(nèi)空間增 加和顯著的肌纖維斷裂(箭頭)；
圖1D顯示了第2天(D2)的肌肉切片，其在肌肉生長抑制素缺失的小鼠的 肌肉中核數(shù)目增力吖箭頭)。箭頭朝向標(biāo)明了沿著壞死的肌纖維邊緣的肌核； 圖1E顯示了第3天(D3)的肌肉切片，其在野生型和肌肉生長抑制素缺失的 肌肉中都有浸潤的單核細(xì)胞，但在肌肉生長抑制素缺失的切片中數(shù)目 更高?？潭葪l等于10)im;
圖IF顯示了第5天的切片(D5),其在肌肉生長抑制素缺失的肌肉切片的 受損傷區(qū)域中核數(shù)目增加；
圖2A顯示了在野生型(肌肉生長抑制素+/+)和肌肉生長抑制素缺失(肌肉 生長抑制素,的再生肌肉中的MyoD陽性成肌前體細(xì)胞百分比；
圖2B顯示了在野生型(肌肉生長抑制素+/+)和月幾肉生長抑制素缺失(月幾肉 生長抑制素勺的再生肌肉中的Mac-l陽性細(xì)胞百分比；
圖2C顯示了用虎蛇毒素造成損傷后最多28天時(shí)，MyoD和肌細(xì)胞生成 素基因在對照未受損的肌肉(C)和再生野生型(wt)和肌肉生長抑制素缺失(月幾 肉生長抑制素缺失)的肌肉中的表達(dá)圖譜。GAPDH用作為對照來顯示所用的 RNA等量；
圖3 對野生型組織進(jìn)行損傷后第14、 21和28天，在得自肌肉生長抑制 素敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的組織切片上的免疫熒光，其顯示與敲除組 織相比，有較強(qiáng)的著色密度，即有更高的波形蛋白陽性細(xì)胞濃度；
圖4 顯示了用虎蛇毒素進(jìn)行損傷后2、 3、 7和10天，在用鹽水處理和 用肌肉生長抑制素抑制劑350 (顯性陰性肌肉生長抑制素肽，其在氨基酸 350位上C-末端截短了 )處理的小鼠中，在痊愈的肌肉中的Macl陽性細(xì)胞平 均數(shù)；
用肌肉生長抑制素拮抗劑(顯性陰性的肌肉生長抑制素肽，其在氨基酸350 位上C-末端截短了 )而得到的恢復(fù)；
圖6A顯示了肌肉生長抑制素對綿羊初級成纖維細(xì)胞(primary fibroblast)的化學(xué)吸引效應(yīng);
圖6B顯示了肌肉生長抑制素對綿羊初級成肌細(xì)胞(primary myoblast) 的化學(xué)抑制效應(yīng)以及利用肌肉生長抑制素拮抗劑(顯性陰性的肌肉生長抑 制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)而得到的恢復(fù)；
圖7 顯示了第28天的(D28)野生型和肌肉生長抑制素缺失的肌肉切片 的蘇木精和曙紅染色(H&E)以及Van Geisen(iii)染色的的低倍(i)和高倍(ii)顯 微照片。在野生型肌肉切片(ii)中見到了厚的結(jié)締組織(箭頭)；在野生型M^肉 切片(iii)中見到了膠原(箭頭)，刻度條等于10 在(iv)中顯示了再生24 天后野生型和肌肉生長抑制素缺失的肌肉的掃描電子顯微圖；刻度條等于 120拜；
圖8顯示了從虎蛇毒素進(jìn)行的肌肉損傷中恢復(fù)的小鼠中肌肉生長抑
制素拮抗劑(顯性陰性的肌肉生長抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截 短了)對肌肉重量的影響；
圖9A-D顯示了得自用虎蛇毒素進(jìn)行肌肉損傷后正在痊愈的小鼠在第 7天(A-用鹽水處理；B-用M^肉生長抑制素拮抗劑350處理)和第10天(C-用鹽
色。星號顯示了壞死區(qū)域；
圖10顯示了圖9肌肉切片的未再生的□和再生的,面積的百分比；
圖ll顯示了虎蛇毒素進(jìn)行損傷后第10和28天，在用鹽水處理和用月iL肉 生長抑制素抑制劑350處理的小鼠中，再生肌肉中的膠原形成的百分比；
圖12顯示了虎蛇毒素進(jìn)行損傷后第28天在用鹽水處理和用肌肉生長 抑制素抑制劑350處理的小鼠中，再生的肌纖維平均纖維面積；
圖13顯示了虎蛇毒素進(jìn)行損傷后第1、 3、 7、 10和28天，在用鹽水 (sal)和肌肉生長抑制素抑制劑350處理的脛骨前肌中，基因Pax7(A)和 MyoD (B)蛋白質(zhì)水平(通過蛋白質(zhì)印跡法斗企測)；
圖14顯示了受損傷后第2和4天受損傷肌肉中的炎性應(yīng)答增加，以及 (在第21天)在痊愈的肌肉中肌肉質(zhì)量增加。
圖15顯示了肌肉生長抑制素在骨骼肌愈合中所起作用的示意性才莫型。
定義
在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中使用的"創(chuàng)傷(wound)，，指一種或多種組 織的損傷，而且其不限于諸如割傷、擦傷、外科手術(shù)切口等開放性的創(chuàng)傷， 而且還包括諸如瘀傷、血腫等內(nèi)傷以及燒傷。
在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中使用的"抑制劑"或"拮抗劑"指任何化合 物，其用于全部或部分降低蛋白質(zhì)活性。它包括能結(jié)合并直接抑制蛋白質(zhì) 活性的化合物，或可用于減少蛋白質(zhì)的產(chǎn)生或增加其產(chǎn)量，由此影響存在 的蛋白質(zhì)的量并由此降低其活性。
在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中使用的"基因表達(dá)"指轉(zhuǎn)錄起始、將DNA 片段轉(zhuǎn)錄成mRNA、并將mRNA翻譯成多肽。
在整個(gè)說明書和權(quán)利要求書中使用的"包含"指'至少部分由……組成，， 也就是指當(dāng)解釋包括該術(shù)語的獨(dú)立權(quán)利要求時(shí)，每個(gè)權(quán)利要求中從該術(shù)語
開始的特征都需要出現(xiàn)，但其他特征也可以出現(xiàn)。 發(fā)明詳述
長抑制素顯示出是創(chuàng)傷愈合所有3個(gè)特征性階段(即炎性階段、增殖階l殳、 和分化階段)的負(fù)調(diào)節(jié)劑。
例如，當(dāng)缺少肌肉生長抑制素時(shí)，如在肌肉生長抑制素缺失的小鼠中， 或如利用肌肉生長抑制素拮抗劑抑制它，則巨噬細(xì)胞數(shù)量增加并且巨噬細(xì) 胞更早地向創(chuàng)傷位點(diǎn)遷移(炎性階段)，膠原沉積較少(增殖階段)并顯著減少 疤痕組織形成(分化階段)。
的功能喪失。沒有結(jié)疤對于美容目的來說也是重要的，尤其在創(chuàng)傷影響到 了容易被見到的身體外部部分(如臉、頸、手等)的時(shí)候。
因此，本發(fā)明涉及增進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合的方法，其包括以下步驟向有 需要的患者施用有效量的至少 一種肌肉生長抑制素拮抗劑。患者優(yōu)選是人
在人或動(dòng)物患者中，通過一種或多種以下機(jī)制來增進(jìn)創(chuàng)傷愈合
(d) 減少創(chuàng)傷恢復(fù)的時(shí)間；
(e) 加速并增加炎性應(yīng)答；和
(f) 減少或抑制疤痕組織形成，
由此改善治療的組織的功能和美容表觀。
肌肉生長抑制素拮抗劑可選自一種或多種分子，其能全部或部分抑制 肌肉生長抑制素活性。
尤其，肌肉生長抑制素拮抗劑可選自任意 一 種或多種已知的肌肉生長 抑制素抑制劑。例如，US 6096506和US 6468535披露了抗肌肉生長抑制 素抗體。US 6369201和WO 01/05820教導(dǎo)了肌肉生長抑制素肽免疫原、肌 肉生長抑制素多聚體和肌肉生長抑制素免疫綴合物，其能引發(fā)免疫應(yīng)答并 阻斷肌肉生長抑制素活性。肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)抑制劑在WO 02/085306中有公開，其包括截短的II型激活蛋白受體、肌肉生長抑制素前 域、和卵泡抑素。其他衍生自肌肉生長抑制素肽的肌肉生長抑制素抑制劑
也是已知的，包括例如，從過量表達(dá)肌肉生長抑制素的細(xì)胞釋放入培養(yǎng)物中的肌肉生長抑制素抑制劑(WO 00/43781);顯性陰性的肌肉生長抑制素 (WO 01/53350),其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替換 為酪氨酸)和成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨 基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短。 US2004/0181033也教導(dǎo)了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且所述小肽 能結(jié)合并抑制肌肉生長抑制素。優(yōu)選肌肉生長抑制素拮抗劑是顯性陰性的肽。這些肽衍生自親本蛋白 質(zhì)，其發(fā)揮抑制親本蛋白質(zhì)的生物活性的作用。如上所述，肌肉生長抑制 素的顯性陰性(dominant negative )的肽是已知的，包括成熟的肌肉生長抑 制素肽(其在氨基酸第335、 350位上或氨基酸第335、 350位之間C-末端 截短了 )和Piedmontese等位基因(其中第3位上的半胱氨酸替換成酪氨酸)。已知肌肉生長抑制素涉及肌肉形成并且它是肌肉生長的負(fù)調(diào)節(jié)劑6'7。 最初產(chǎn)生的肌肉生長抑制素是375個(gè)氨基酸的前體分子，其N-末端上具有 分泌信號序列，切掉它后產(chǎn)生無活性的原(pro-)形式。通過弗林蛋白內(nèi)切 蛋白酶在Arg 266裂解，釋放出N-末端的前域(或與潛伏期相關(guān)的肽(LAP) 結(jié)構(gòu)域)和成熟的肌肉生長抑制素結(jié)構(gòu)域，由此活化了肌肉生長抑制素?？?是，裂解后，前域仍舊能與成熟的結(jié)構(gòu)域結(jié)合成無活性的復(fù)合物8。所以，少癥。肌肉生長抑制素的剪接變體已經(jīng)被鑒定出來了 ，其也可用作肌肉生長 抑制素拮抗劑(PCT/NZ2005/000250)。肌肉生長抑制素剪接變體(MSV)由 額外的剪接事件產(chǎn)生，該事件去除了第三個(gè)外顯子的大部分。產(chǎn)生的MSV 多肽，在綿羊(oMSV; SEQIDNo: 8)和牛MSV (bMSV; SEQIDNo: 11) 中與天然的肌肉生長抑制素前肽共有最開始的257個(gè)氨基酸，但具有獨(dú)特 的64個(gè)氨基酸C-末端(綿羊oMSV65, SEQIDNo: 9和牛bMSV65, SEQ ID No: 12)。 mRNA有195個(gè)核苷酸的差別，可是，MSV第257位上的纈 氨酸殘基與常規(guī)的肌肉生長抑制素序列的相同。Belgian Blue牛的MSV (bMSVbb; SEQ ID No: 7)編碼短了 7個(gè)氨基酸的314個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì) (SEQ ID No: 14),但是余下的蛋白質(zhì)序列在兩個(gè)檢測的品種中顯示出具有 完全的同源性。在bMSVbb中，獨(dú)特的65個(gè)氨基酸的C-末端肽(SEQ ID No:12)是保守的。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了對于包括了弗林蛋白內(nèi)肽酶在內(nèi)的前肽轉(zhuǎn)變酶(PC 1-7) 來說，(KERK)裂解位點(diǎn)存在于第271至274位上。在第274位上裂解釋放 出有47個(gè)氨基酸的C-末端成熟的MSV片段(綿羊oMSV47， SEQIDNo: 10和牛bMSV47, SEQIDNo: 13)。65個(gè)氨基酸的MSV片段(SEQIDNO: 12)顯示出在體外可用作為月幾 肉生長抑制素拮抗劑(PCT/NZ2005/000250),而且預(yù)計(jì)在體內(nèi)，MSV將可用 于調(diào)節(jié)肌肉生長抑制素活性。所以，本文公開的MSV多肽可用于抑制月幾肉 生長抑制素，由此根據(jù)本發(fā)明而促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。通過導(dǎo)入干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的多核苷酸，可改變肌肉生長抑制素基因表達(dá)。 例如，可導(dǎo)入反義多核苷酸，其包括反義表達(dá)載體、反義寡脫氧核糖核 酸、反義硫代磷酸酯寡脫氧核糖核苷酸、反義寡核糖核苷酸、反義^5克代磷 酸酯寡核苷酸、或任何現(xiàn)有已知的其他形式，其包括應(yīng)用化學(xué)修飾以增強(qiáng) 反義多核苷酸的功效。通過現(xiàn)有已知方法9并根據(jù)肌肉生長抑制素基因序列 的知識w可產(chǎn)生肌肉生長抑制素的反義分子。將能理解，任何反義多肽不必100%互補(bǔ)于所討論的多核苷酸，而需要 有足夠的同一性以使反義多核苷酸結(jié)合于基因上，或結(jié)合于mRNA上來破 壞基因表達(dá)，而不實(shí)質(zhì)性地破壞其他基因的表達(dá)。也可以理解，互補(bǔ)于包 括5'非翻譯區(qū)域的基因的多核苷酸也可用于破壞肌肉生長抑制素蛋白的翻 譯。同樣，這些互補(bǔ)的多核苷酸不必100%互補(bǔ)，而要能足以結(jié)合mRNA并 破壞翻譯，而不實(shí)質(zhì)性地破壞其他基因的表達(dá)?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)也可通過使用催化性RNA分子或核酶來實(shí)現(xiàn)。現(xiàn)有已 知這類核酶可被設(shè)計(jì)成與特異性靶向的RNA分子配對。核酶結(jié)合并裂解靶 向的RNA1Q?，F(xiàn)有已知的任何其他調(diào)節(jié)基因表達(dá)和RNA加工的技術(shù)也可用于調(diào)節(jié)肌 肉生長抑制素基因表達(dá)。另一種肌肉生長抑制素拮抗劑是衍生自肌肉生長抑制素受體的肽。該 受體衍生的片段通常包括肌肉生長抑制素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其隨后結(jié)合并抑制 野生型肌肉生長抑制素。肌肉生長抑制素受體是IIB型激活蛋白，其肽序列 是已知的8。熟練技術(shù)人員無需過多實(shí)驗(yàn)就可生產(chǎn)出該受體拮抗劑。 長抑制素的抗體是現(xiàn)有已知的，如上所述，產(chǎn)生該抗體的方法也是現(xiàn)有已知的?？贵w可以是哺乳動(dòng)物或非哺乳動(dòng)物的抗體，例如鯊魚的IgNAR類抗 體；或衍生自能結(jié)合肌肉生長抑制素的任何這種蛋白質(zhì)的片段或衍生物。 將可理解，其他涉及肌肉生長抑制素信號傳導(dǎo)途徑的分子將適用于本稱為"強(qiáng)效(mighty)"，其被公開于PCT/NZ2004/000308中，其用于促進(jìn) 肌肉生長。通過肌肉生長抑制素可抑制"強(qiáng)效"表達(dá)，所以它涉及相同的信 號傳導(dǎo)途徑。所以將可理解，不直接抑制肌肉生長抑制素，而使用對抗肌 肉生長抑制素信號傳導(dǎo)作用的肽(例如"強(qiáng)效")可用于促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。能理解，編碼"強(qiáng)效"基因的多核苷酸(綿羊SEQIDNo: 15和牛SEQ ID No: 17)可用于在肌肉上進(jìn)行局部基因治療，其能永久或瞬時(shí)表達(dá)"強(qiáng)效"， 或可選地可直接使用"強(qiáng)效"蛋白質(zhì)(綿羊SEQ ID No.16和牛SEQ ID No.l8)。將可理解，由于遺傳密碼的冗余性，可產(chǎn)生與SEQ ID No: 15-18 中所公開的那些不完全一樣、但具有基本相同活性的序列。另外，也可產(chǎn) 生在非關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域上有改變、但具有基本相同的功能的其它肽。改變可包 括插入、缺失、或?qū)⒁粋€(gè)氨基酸殘基變化為另一個(gè)。這類變化包含在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)的，即肌肉生長抑制素能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合或改善 創(chuàng)傷損害。在人或動(dòng)物患者中，通過一種或多種以下機(jī)制來增進(jìn)創(chuàng)傷愈合(g) 減少創(chuàng)傷恢復(fù)的時(shí)間；(h) 加速并增加炎性應(yīng)答；和(i) 減少或抑制疤痕組織形成，由此改善受處理的組織的功能和美容表觀。所以任何已知的或開發(fā)中 的肌肉生長抑制素拮抗劑都適用于該方法中。這包括了任何能結(jié)合肌肉生 長抑制素的分子，例如，五.co/z'的IMM7免疫蛋白質(zhì)、或現(xiàn)有已知的任何其 他種類的結(jié)合蛋白質(zhì)。其他能結(jié)合并抑制肌肉生長抑制素的肽是已知的， 例如，含氨基酸WMCPP(US2004/0181033)的肽。將能理解，任何能抑制肌肌肉生長抑制素是分泌型生長因子，其主要在骨骼肌肉中被合成。可 是，肌肉生長抑制素也出現(xiàn)在其他組織中，包括心臟、乳腺、脂肪組織和
腦中，而且肌肉生長抑制素受體是普遍存在的。因此預(yù)計(jì)，肌肉生長抑制 素拮抗劑將能有效促進(jìn)存在肌肉生長抑制素受體的組織或包括該組織的器 官，如皮膚的創(chuàng)傷愈合。用于本發(fā)明方法中的肌肉生長抑制素拮抗劑可用于在下述創(chuàng)傷愈合的 動(dòng)物模型或體外模型中測試生物活性，其適宜地作為活性化合物配制成藥 物組合物。除了本文所述的一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑，本發(fā)明的 藥物組合物可包括藥學(xué)上可接受的賦形劑、載體、緩沖液、穩(wěn)定劑或其他 現(xiàn)有公知的材料。該材料應(yīng)是無毒的并應(yīng)當(dāng)不干擾活性成分的功效。載體 或其他材料的精確性質(zhì)將取決于藥物組合物所需的性質(zhì)和施用途徑，如口 服、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、皮內(nèi)、局部、鼻腔、肺部、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi) 施用途徑?？诜┯玫乃幬锝M合物可以是片劑、錠劑、膠嚢、粉劑、顆粒劑或液 體形式。片劑或其它固體口服劑型通常將包括固體載體，如明膠、淀粉、 甘露醇、結(jié)晶纖維素、或其它藥物制備中常用的惰性材料。相似地，液體 藥物組合物，如糖漿劑或乳劑， 一般將包括液體載體，如水、石油、動(dòng)物 或才直物油、礦物油或合成油。對于靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，活性成分將是可接受 的非腸道水溶液的形式，其不含熱原并具有合適的pH、等滲性和穩(wěn)定性。對于局部施用，活性成分將溶于或懸浮于合適的潤滑劑中，并可配制 成乳劑、滾抹劑、洗液、貼劑、噴霧劑、油膏、糊劑、或凝膠的形式，而 且它可直接應(yīng)用于創(chuàng)傷位點(diǎn)上或通過諸如襯墊、貼片等介質(zhì)來應(yīng)用。對于鼻腔或肺部施用，活性成分將是適于吸入的微小粉末或溶液或懸 浮液的形式?？蛇x地，活性成分可以是適于直接應(yīng)用于鼻粘膜的形式，如 膏劑或乳劑、鼻腔噴霧劑、鼻腔滴劑或氣霧劑。一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑治療肌肉傷的能力能在前述肌肉損 傷的虎蛇毒素模型"中來證實(shí)。本發(fā)明另 一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用是治療皮膚傷。一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑治療淺表或深層皮膚創(chuàng)傷的能力能 根據(jù)已知方法13來證實(shí)。本發(fā)明另 一個(gè)優(yōu)選的應(yīng)用是治療燒傷。
一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑治療燒傷的能力能在已知的動(dòng)物才莫型中證實(shí)。例如Yang等"所述的。在另一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明預(yù)見到了將一種或多種其他免疫應(yīng) 答性化合物與本發(fā)明的藥物組合物聯(lián)合施用的用途，從而為治療方案帶來 附加的或協(xié)同效應(yīng)。該免疫應(yīng)答性化合物通常是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的物質(zhì)。該物質(zhì)的例子包括糖皮質(zhì)激素，如脫氫皮甾醇和曱基脫氫皮甾醇；非甾族抗 炎藥(NSAID); PDGF、 EGF、 IGF、以及第一和第二代抗TNp oc劑。該物質(zhì) 可與本文所述的至少 一種肌肉生長抑制素拮抗劑分開、順序或同時(shí)聯(lián)合施 用，這取決于要治療的創(chuàng)傷類型，這對普通技術(shù)人員來說是會理解的。施用本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選以"預(yù)防有效量"或"治療有效量"來進(jìn)行， 其量足以對個(gè)體顯示出有益效果。實(shí)際施用量、和施用速率和時(shí)程將取決 于要治療的肌肉減少癥的性質(zhì)和嚴(yán)重性。開治療處方，如決定劑量等，在 開業(yè)醫(yī)生和其它內(nèi)科醫(yī)生的職責(zé)范圍內(nèi)，其典型地將考察要治療的疾病、 病患個(gè)體狀況、遞送位點(diǎn)、施用方法和其它醫(yī)師所知的因素。上述技術(shù)和 -見牙呈的例子可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,第16片反，Oslo, A. (編)，1980中找到。本發(fā)明也涉及 一 種或多種肌肉生長抑制素抑制劑在制備用于增進(jìn)有需 要的患者的創(chuàng)傷愈合的藥物中的應(yīng)用。 一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑 可選自上述肌肉生長抑制素拮抗劑組。藥物可配制成用于局部或全身施用的配方，例如，藥物可配制成用于 向外部或開放性創(chuàng)傷位點(diǎn)局部施用的配方，或可配制成用于向內(nèi)部或深層 創(chuàng)傷位點(diǎn)注射的配方。藥物可進(jìn)一步包含一種或多種其他免疫應(yīng)答性化合物從而對創(chuàng)傷愈合 帶來附加的或協(xié)同效應(yīng)，其選自上述免疫應(yīng)答性化合物的組。藥物可以配 制成一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑和一種或多種免疫應(yīng)答性化合物分 開、順序或同時(shí)施用的配方。不受理論所限，可認(rèn)為，肌肉生長抑制素拮抗劑能通過作用在創(chuàng)傷愈 合的所有3個(gè)公認(rèn)階段(即上述炎性階段、增殖階段、和分化階段)而有 效增進(jìn)創(chuàng)傷愈合。例如，抑制肌肉生長抑制素活性首次顯示出對巨噬細(xì)胞募集有直接效
用肌肉生長抑制素拮抗劑抑制的時(shí)候，巨噬細(xì)胞的數(shù)量和遷移到創(chuàng)傷位點(diǎn) 的時(shí)間增加了。因此，能顯著改善創(chuàng)傷愈合的第一階段(炎性階段)，預(yù)計(jì) 這將更快并更有效地清潔創(chuàng)傷并生成血管。另外，抑制肌肉生長抑制素活性，也顯示出能在增殖階段較少沉積膠 原。本文首次顯示，肌肉生長抑制素是針對成纖維細(xì)胞的化學(xué)引誘物。因 此，抑制肌肉生長抑制素活性被認(rèn)為能使較少的成纖維細(xì)胞向創(chuàng)傷位點(diǎn)募 集，由此通過減少成纖維細(xì)胞群而較少產(chǎn)生膠原。進(jìn)一步首次顯示了 ，肌肉生長抑制素涉及創(chuàng)傷愈合的分化階段中的疤 痕組織的形成。特定地，抑制肌肉生長抑制素活性顯示出能在恢復(fù)的創(chuàng)傷 組織中顯著減少疤痕組織形成。另外，也顯著減少功能組織的喪失，即抑 制肌肉生長抑制素也能改善組織再生，由此使恢復(fù)的組織被替代而不結(jié)疤， 因此幾乎不造成功能或美容損害。這在美容外科手術(shù)中或在治療可清晰看 見的身體部分(如臉、頸、手等)的創(chuàng)傷中尤其有益。盡管本發(fā)明僅用肌肉創(chuàng)傷模型進(jìn)行示例，但預(yù)計(jì)它也能相應(yīng)很好地治 療其他類型的創(chuàng)傷，如皮膚割傷和擦傷、貫穿皮膚和肌肉的深層傷(包括 外科手術(shù)切口 )以及內(nèi)傷(例如有運(yùn)動(dòng)損傷或外傷造成的肌肉和肌腱的損傷)、瘀傷、血腫、和燒傷。本發(fā)明也可廣義地被認(rèn)為個(gè)別或整體地存在于本申請說明書參考或所 示的部分、元素和特征中，以及兩個(gè)或更多所述部分、元素或特征的任意 或全部組合，而且本文提及了特定的完整事物，這些完整事物在本發(fā)明相 關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)中具有已知的等同物，該已知的等同物被認(rèn)為納入本文了 ， 就好像個(gè)別描述過一樣。本發(fā)明存在于前述內(nèi)容中，并也關(guān)注以下僅給出實(shí)例的那些內(nèi)容。實(shí)施例實(shí)施例1:肌肉生長抑制素拮抗劑增加肌肉創(chuàng)傷愈合中所涉及的炎性 應(yīng)答和細(xì)胞趨化性創(chuàng)傷愈合是高度有序的過程；肌肉組織創(chuàng)傷導(dǎo)致即刻的炎性應(yīng)答，然 后成肌前體衛(wèi)星細(xì)胞發(fā)生趨化性移動(dòng)。我們在本文中顯示了，肌肉生長抑 制素實(shí)際能抑制炎性應(yīng)答和成肌細(xì)胞向創(chuàng)傷位點(diǎn)的趨化性移動(dòng)。因此可證
質(zhì)量會帶來有益效果。 材料和方法對應(yīng)于牛M^肉生長抑制素267-350位氨基酸的cDNA (下文中一皮稱為 "350"或"350蛋白")被PCR擴(kuò)增出并克隆進(jìn)pET16-B載體中。350蛋 白的表達(dá)和純化按照制造商(Qiagen)的規(guī)程在天然條件下進(jìn)行。用25%芬太尼(Hypnorm )(檸檬酸芬太尼0.315 mg/ml和氟茴哌丁酮10 mg/ml)和10%速眠安(Hypnovel )(咪哇安定5 mg/ml)的混合物以0.1 ml/10g 體重的量來麻醉6至8周大的雄性C57BL/10和肌肉生長抑制素 一小鼠(每 組11=27)。右腿的脛骨肌前肌用100^1注射器(SGE,澳大利亞)月幾肉注射IO ^ 10叫/ml的虎蛇毒素。在第0天(對照)和第1、 2、 3、 5、 7、 10、 14 或28天(每天n二3),從安樂死的小鼠中切下脛骨前肌。脛骨前肌在組織Tec 液中固定，并在用液氮冷凍的異戊烷中冷凍。對于350對創(chuàng)傷進(jìn)行的試驗(yàn)， 如上所述，用虎蛇毒素注射l歲大的野生型小鼠的左脛骨前(TA)肌肉。在 第1、 3、 5、和7天，用肌肉生長抑制素拮抗劑(350 )以6pg每克體重皮 下注射受創(chuàng)傷的小鼠，或注射等量鹽水(對照小鼠)。為了評估350對肌肉康 復(fù)的效應(yīng)，在注射虎蛇毒素后第1、 3、 7、 10和28天使小鼠安樂死，切下 脛骨前肌，進(jìn)行蛋白質(zhì)分離或組織切片。冷凍的肌肉樣品儲存于-80。C。 7pm 的橫向切片(nK3)在3個(gè)水平進(jìn)行切割，相隔100nm。然后用蘇木精和曙紅 或Van Geisen對切片染色。然后用裝有DAGE-MTI DC-330彩色照相機(jī) (DAGE-MTI Inc.)的Olympus BX50顯微鏡(Olympus Optical Co.，德國)檢測 切片并拍照。用2%多聚甲醛后固定(postfix)冷凍的肌肉切片(7iim厚)，然后用含 0.3% (v/v) Triton X-100的PBS透化，然后用10% (v/v)正常羊血清-Tris緩沖 鹽水(NGS-TBS)于室溫封閉1小時(shí)。切片與用5% NGS-TBS稀釋的抗體一
起于4。C溫育過夜。所用的抗體是小鼠抗MyoD, 1: 25稀釋度(554130; PharMingen)，它是活化的成肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物(Cooper等，1999; Koishi 等，1995);山羊抗Mac-l， 1: 400稀釋度(整聯(lián)蛋白M-19; SantaCmz), 它是特異于浸潤的外周巨噬細(xì)胞的抗體(Springer等，1979); 1: 300稀釋 度的小鼠抗波形蛋白抗體，它是成纖維細(xì)胞的標(biāo)記物。用PBS洗切片3次， 然后與i: 400稀釋度的驢抗小鼠Cy3綴合物(715-165-150; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,美國)或1: 400稀釋度的生物素化的 驢抗綿羊/山羊IgG抗體(RPN 1025; Amersham)—起溫育。二級抗體溫育后， 與熒光素綴合的抗生物素蛋白鏈菌素(S-869; Molecular Probes)—起于室溫 溫育30分鐘，所述抗生物素蛋白鏈菌素稀釋度為1: 400,其用5%NGS-TBS 稀釋。用PBS漂洗切片3次，用DAPI復(fù)染并用Dako 熒光固定介質(zhì)固定。 用落射熒光顯微鏡檢測脛骨前肌切片。用裝有DAGE-MTI DC-330彩色照 相機(jī)(DAGE-MTI Inc.， IN,美國)的Olympus BX50顯微鏡(Olympus Optical Co.，德國)拍下典型的顯微照片。用Scion成像程序(MH)對5個(gè)隨機(jī)挑選的 肌肉切片測量出平均肌肉面積，所述肌肉切片是前面來自于對肌肉生長抑 制素 一和野生型小鼠進(jìn)行免疫組織化學(xué)而用的切片。老化^試-發(fā)根據(jù)公開的規(guī)程(Allen等，1997; Partridge, 1997),培養(yǎng)來自于4至 6周大的小鼠的后肢肌肉的初級成肌細(xì)胞。簡而言之，切石爭月幾肉并在0.2% 1A 型膠原酶中消化90分鐘。通過預(yù)先在未包被的平板上鋪板3小時(shí)來富集培 養(yǎng)物中的成肌細(xì)胞。成肌細(xì)胞培養(yǎng)物在10%基質(zhì)膠包被的平板上于 37。C/5% C02培養(yǎng)于補(bǔ)加20。/。胎牛血清(FCS)、 10% HS和1% CEE的生長 培養(yǎng)基(GM)中。48小時(shí)后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)物中MyoD的表達(dá)來 評估培養(yǎng)物純度程度。用胰蛋白酶收集細(xì)胞，以106個(gè)細(xì)胞/200 pl的濃度 重懸并用5 ml 70%乙醇于-20。C固定過夜。用1: 200的兔多克隆抗MyoD (Santa Cmz)于室溫進(jìn)行染色30分鐘，然后用1: 500的Alexa fluor488抗兔 綴合物染色(MolecularProbes)。分析一式兩份進(jìn)行，每個(gè)試-瞼中收集104個(gè) 細(xì)胞事件。通過對前向和側(cè)向散射圖譜進(jìn)行射門來排除碎片。通過FACscan (BectonDickinson)來分析細(xì)胞。通過腹膜灌洗技術(shù)來分離巨噬細(xì)胞。根據(jù)公 開的規(guī)程(Colditz和Movat, 1984)制備酵母聚糖活化的小鼠血清(ZAMS)。
在帶有7mm直徑的孔的Boyden型單盲孔腔室(Neuro Probe, MD美國)中 進(jìn)行趨化性實(shí)驗(yàn)。徹底洗滌帶有8nm洞的聚碳酸酯過濾膜(Neuroprobe;洞 =6%的表面積)，而對于成肌細(xì)胞試驗(yàn)，用含1%基質(zhì)膠的DMEM處理過 濾膜30分鐘。然后干燥過濾膜并置于頂層和底層腔室之間。對于成肌細(xì)胞的趨化性試驗(yàn)，含5。/。雞胚提取物(CEE)和透析緩沖液的 DMEM用作為陽性對照。將重組肌肉生長抑制素(2.5和5pg/ml肌肉生長 抑制素)和350蛋白質(zhì)(5倍肌肉生長抑制素濃度，即，12.5yg/ml和25pg/ml) 加入陽性對照培養(yǎng)基中。純DMEM用作陰性對照。在24孔板上，用測試 或?qū)φ张囵B(yǎng)基注滿底層孔。將七萬五千個(gè)細(xì)胞加入到頂層孔中。于37。C、 5% C02溫育平板7小時(shí)。用預(yù)先濕潤的藥簽清洗膜的頂層表面以去除未遷 移的細(xì)胞。然后固定膜，用Gill氏蘇木精染色并濕固定在載玻片之上。在 每個(gè)膜的4個(gè)代表區(qū)域上計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞并得出平均數(shù)。對于巨噬細(xì)胞的趨化性試驗(yàn)，含33%酵母聚糖活化的小鼠血清 (ZAMS))的DMEM和透析緩沖液用作為陽性對照。將重組肌肉生長抑制 素(5pg/ml肌肉生長抑制素)和350蛋白質(zhì)(2和5倍肌肉生長抑制素濃度， 即，10|ig/ml和25pg/ml)加入陽性對照培養(yǎng)基或純DMEM中。在24孔板 上，用測試或?qū)φ张囵B(yǎng)基注滿底層孔。將七萬五千個(gè)細(xì)胞加入到帶有聚對 苯二曱酸乙二醇酯(PET)0.8pm膜的頂層孔中。于37。C、 5%(:02溫育平板4 小時(shí)。用預(yù)先濕潤的藥簽清洗膜的頂層表面以去除未遷移的細(xì)胞。然后固 定膜，用Gill氏蘇木精染色并濕固定在載玻片之上。在每個(gè)膜的4個(gè)代表 區(qū)域上計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞并得出平均數(shù)。從羊羔皮膚外植體上獲取初級成纖維細(xì)胞。含10pg/ml重組TGF-p的DMEM用作為陽性對照。將重組肌肉生長抑制素(5pg/ml肌肉生長抑制素) 加入到陽性對照培養(yǎng)基中。在24孔板上，用測試或?qū)φ张囵B(yǎng)基注滿底層孔。 將八萬八千個(gè)細(xì)胞加入到帶有聚對苯二曱酸乙二醇酯(PET) 0.8pm膜的頂層 孔中。于37。C、 5。/。C02溫育平板4小時(shí)。用預(yù)先濕潤的藥簽清洗膜的頂層 表面以去除未遷移的細(xì)胞。然后固定膜，用Gill氏蘇木精染色并濕固定在 載玻片之上。在每個(gè)膜的4個(gè)代表區(qū)域上計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞并得出平均數(shù)。奸考差^《3的i r戶O 根據(jù)廠商規(guī)程用Trizol (Invitrogen)分離總RNA。用Superscript預(yù)擴(kuò)增
試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行反逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用1 jil反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行PCR，即 94。C30秒，55。C30秒，和72°C 30秒。對于每個(gè)基因，利用不同的循環(huán)來 確定指數(shù)擴(kuò)增所需的循環(huán)數(shù)。在瓊脂糖凝膠上分離擴(kuò)增子并轉(zhuǎn)移至尼龍膜 上。通過DNA印跡雜交來檢測PCR產(chǎn)物。用3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH) mRNA的豐度來校正每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。結(jié)果肌肉生長抑制素影響成肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的趨化性 在用虎蛇毒素進(jìn)行創(chuàng)傷后24小時(shí)內(nèi)在野生型和肌肉生長抑制素—一肌 肉中都見到如嗜曙紅細(xì)胞的出現(xiàn)和成肌細(xì)胞遷移所指示的針對肌肉創(chuàng)傷的 炎性應(yīng)答(圖1C)。到第2天，野生型和肌肉生長抑制素一應(yīng)答在炎性應(yīng)答 和衛(wèi)星細(xì)胞遷移中的差異變得明顯，在肌肉生長抑制素 一肌肉切片中創(chuàng)傷 位點(diǎn)上的核增長具有明顯增高(圖1D,箭頭)。觀察到的核數(shù)目的增加是由 于巨噬細(xì)胞和成肌細(xì)胞數(shù)目增加而造成的。尤其在肌肉生長抑制素；切片 中，沿著壞死的肌纖維邊緣可見到核的最高密度(圖1D,箭頭)。到第3天， 恢復(fù)的野生型肌肉切片也顯示出核數(shù)目增加了 ，然而仍舊遠(yuǎn)小于從肌肉生 長抑制素；小鼠中收集的對應(yīng)組織(圖1E)。在野生型和肌肉生長抑制素 一月幾肉切片中，虎蛇毒素創(chuàng)傷后單核細(xì)胞增加的最高點(diǎn)都出現(xiàn)在第5天(圖 1F)。所示的主要效應(yīng)是巨噬細(xì)胞和成肌細(xì)胞加速遷移到肌肉生長抑制素 v—肌肉切片中的創(chuàng)傷位點(diǎn)上。在對肌肉創(chuàng)傷進(jìn)行應(yīng)答過程中，炎性細(xì)胞和衛(wèi)星細(xì)胞遷移到創(chuàng)傷位點(diǎn) 上18。為了確定缺少肌肉生長抑制素是否能增強(qiáng)活化的衛(wèi)星細(xì)胞或炎性細(xì)胞 的遷移，定量創(chuàng)傷位點(diǎn)上的炎性細(xì)胞和成肌細(xì)胞的比例。用免疫組織化學(xué) 來檢測MyoD (成肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記物)19和Mac-l (用于浸潤性外周巨 噬細(xì)胞)2、未處理的對照肌肉切片對于MyoD免疫染色是陰性的。用DAPI 染色肌肉切片從而計(jì)數(shù)出核的總數(shù)。定量結(jié)果證明了與野生型切片相比， 在肌肉生長抑制素-A恢復(fù)的肌肉中在第二天，創(chuàng)傷愈合位點(diǎn)上出現(xiàn)了兩倍 數(shù)量的成肌細(xì)胞(MyoD陽性)(圖2A)和巨噬細(xì)胞(Mac-1陽性)(圖2B)。從 創(chuàng)傷愈合的第2天到第5天，肌肉生長抑制素一肌肉切片上比野生型肌肉 有更多的成肌細(xì)胞(圖2A)。像MyoD陽性細(xì)胞一樣，在肌肉生長抑制素一 肌肉中，在對創(chuàng)傷應(yīng)答的更早期(第2天)，可見到巨噬細(xì)胞向創(chuàng)傷位點(diǎn)浸潤
增加(圖2B)。另外，肌肉生長抑制素；肌肉中更迅速減少的炎性細(xì)胞數(shù)表明，肌肉生長抑制素一小鼠中整個(gè)炎性細(xì)胞應(yīng)答過程都加速了(圖2B)。 Grounds等(Grounds等，1992)證明了 MyoD和肌細(xì)胞生成素的物。因此在正在恢復(fù)的組織中確定MyoD和肌細(xì)胞生成素的表達(dá)。定量 RT-PCR結(jié)果確證了肌肉調(diào)節(jié)因子myoD和肌細(xì)胞生成素的表達(dá)與野生 型肌肉相比在肌肉生長抑制素-/-月幾肉中是在較早時(shí)表達(dá)的。在肌肉生長 抑制素一肌肉中，在受創(chuàng)傷12小時(shí)內(nèi)檢測到了高水平的MyoDmRNA?？?是在野生型肌肉中，直到虎蛇毒素注射后第1天才^f全測到MyoD表達(dá)(圖 2C)。相似地，在再生的肌肉生長抑制素^肌肉中，在受創(chuàng)傷后12小時(shí) 內(nèi)的非常早期階段也檢測到更高水平的肌細(xì)胞生成素mRNA。可是，在野生型再生的肌肉中，直到肌肉創(chuàng)傷后1天才檢測到肌細(xì)胞生成素mRNA (圖2C)。因此，免疫組織化學(xué)和基因表達(dá)分析的結(jié)杲同時(shí)表明，肌肉生長 抑制素 一月幾肉中成肌細(xì)胞向受創(chuàng)傷位點(diǎn)的遷移增加并加速了 。除了成肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞也會遷移至受創(chuàng)傷位點(diǎn)并在其上擴(kuò)增。研 究肌肉創(chuàng)傷時(shí)肌肉生長抑制素對成纖維細(xì)胞遷移動(dòng)力學(xué)的影響。如用波形 蛋白抗體(成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)記)染色的圖3所示，與野生型肌肉相比， 在肌肉生長抑制素一小鼠脛骨前肌中的受創(chuàng)傷位點(diǎn)上成纖維細(xì)胞的增加 實(shí)質(zhì)上較小。該結(jié)果以及以下成纖維細(xì)胞遷移試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，清楚證明了肌 肉生長抑制素是用作為成纖維細(xì)胞的化學(xué)引誘物的。果，虎蛇毒素進(jìn)行創(chuàng)傷后進(jìn)行創(chuàng)傷愈合的小鼠用350蛋白處理，并確定炎性 應(yīng)答。第2天在用350處理過了的受損的肌肉中發(fā)現(xiàn)更高百分比的Macl陽性 巨噬細(xì)胞(圖4)。到第3天，350處理的肌肉中的百分比掉落到鹽水處理的第3 天的肌肉之下，并在第7和10天的肌肉中持續(xù)更低。該結(jié)果顯示到第2天在 350處理的肌肉中有早期或更深層次的巨噬細(xì)胞募集，然后到第7和10天募 集降低了。這些結(jié)果顯示350處理加速傷口愈合過程。通過月幾肉生長抑制素抑制成月幾細(xì)胞和巨噬細(xì)月包的趨化性并通過350對 其拯救已經(jīng)證明了創(chuàng)傷后24小時(shí)，熱創(chuàng)傷(燒傷)組織中的肌肉生長抑制素
水平出現(xiàn)了 3倍增加"。相似地，在由虎蛇毒素進(jìn)行創(chuàng)傷的肌肉組織中，創(chuàng)傷后24小時(shí)在肌肉組織中測量到了顯著增加的肌肉生長抑制素水平12。以上提供的結(jié)果顯示，肌肉生長抑制素^肌肉中巨噬細(xì)胞浸潤增加并 加速，和成肌細(xì)胞向再生區(qū)域遷移增加并加速。由于這兩種細(xì)月包類型已知 都受趨化性因子影響而指導(dǎo)它們的運(yùn)動(dòng)22，23，研究肌肉生長抑制素對衛(wèi)星細(xì) 胞衍生的成肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移能力的影響。為了測試肌肉生長抑制素是否干擾趨化性信號，使用盲孔(blind-well)趨化性腔室。通過過濾膜 來評估分離的成肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞針對化學(xué)引誘物(針對成肌細(xì)胞是CEE， 而針對巨噬細(xì)胞是ZAMS活化的血清)的遷移能力。如流式細(xì)胞術(shù)所測得的， 發(fā)現(xiàn)分離的成肌細(xì)胞卯o/。是成肌性(MyoD陽性)的。如圖5所示，將5)ig/ml肌 肉生長抑制素加入到ZAMS培養(yǎng)基中能完全消除巨噬細(xì)胞遷移。當(dāng)向含 5|ig/ml肌肉生長抑制素的培養(yǎng)基中加入350蛋白時(shí)，觀察到了肌肉生長抑制 素對巨噬細(xì)胞的化學(xué)抑制效應(yīng)的顯著拯救(增加了 20倍)。該結(jié)果確認(rèn)了施用 諸如350的肌肉生長抑制素抑制劑能通過降低肌肉生長抑制素對巨噬細(xì)胞 遷移的抑制而加速傷口愈合。除了對巨噬細(xì)胞遷移的影響，我們在本文中還證明了諸如350的肌肉生 長抑制素拮抗劑也能降低肌肉生長抑制素對成肌細(xì)胞趨化性移動(dòng)的負(fù)效 應(yīng)。向陽性對照培養(yǎng)基中加入2.5和5iLig/ml重組肌肉生長抑制素會分別造成 成肌細(xì)胞遷移被抑制了 66和82%。當(dāng)向含重組肌肉生長抑制素的培養(yǎng)基中加于陽性對照中所觀察到的水平，因此證明了諸如350的月幾肉生長抑制素拮抗 劑能通過增強(qiáng)成肌細(xì)胞遷移而有效地加速創(chuàng)傷愈合。肌肉生長抑制素用作針對成纖維細(xì)胞的化學(xué)引誘物與巨噬細(xì)胞和成肌細(xì)胞相反，肌肉生長抑制素可用作成纖維細(xì)胞遷移 的化學(xué)引誘劑。在肌肉生長抑制素缺失的肌肉中觀察到成纖維細(xì)胞向創(chuàng)傷 位點(diǎn)遷移的減少支持了這個(gè)結(jié)果(圖6)。為了直接證明肌肉生長抑制素對成 纖維細(xì)胞的趨化性效應(yīng)，利用重組肌肉生長抑制素在體外進(jìn)行遷移試驗(yàn)。 如圖6所示，與緩沖液對照相比，肌肉生長抑制素的加入增加了成纖維細(xì) 胞的趨化性移動(dòng)。 實(shí)施例2:對肌肉生長抑制素進(jìn)行拮抗使得纖維變性減少并增強(qiáng)肌肉 愈合。方法切割創(chuàng)傷模型在每只小鼠(野生型和肌肉生長抑制素缺失)的左脛骨前肌(TA)切開 3mm的橫向切口。在損傷后第0、 3、 5、和7天，野生型脛骨前肌在損傷 位點(diǎn)上以2jag/g體重注射350蛋白(總量為85嗎/小鼠)或鹽水(注射入脛骨前 肌肉)。未受損的右脛骨前肌用作為對照。在切割后第2、 4、 7、 10和21 天收集受損的和對照肌肉，并確定它們的重量。還通過Van Geisen染色來 測定膠原沉積在正在愈合和已經(jīng)愈合的切割傷口上的程度。掃描電子顯微術(shù)剔除肌肉樣品的脂肪和肌腱，并用含2.5。/。(v/v)戊二醛的10 ml 0.1 M 磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)固定48小時(shí)，期間輕輕搖動(dòng)。用PBS洗去戊二搭， 洗l小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移到50ml2MNaOH中，并于25°C恒溫溫育5天。然后 用PBS洗樣品并移入50 ml無菌蒸餾水中。再于25°C恒溫保存肌肉4天。 在前36小時(shí)，每隔12小時(shí)換水，然后每隔24小時(shí)換。然后將肌肉轉(zhuǎn)移入 1%丹寧酸，放置2小時(shí)，然后用PBS洗3次。用1。/。Os04處理肌肉2小時(shí)， 然后用遞增梯度的乙醇(50% - 100%)用浸入法脫水3次，每次15分鐘。用 二氧化碳干燥肌肉樣品并用金包被。檢測標(biāo)本并用帶有10kV加速電壓的掃 描電子顯微鏡(HITACHI 4100,日本)拍照。如實(shí)施例1所述用VanGeisen在第21天評估野生型相對于缺失型的割 傷脛骨前肌中的膠原積聚。結(jié)果缺 溝^長#斜#^#致增強(qiáng),溝痊奮并減>、^舉^# 在骨骼肌中，纖維變性的發(fā)展始于虎蛇毒素創(chuàng)傷后2周并隨著時(shí)間而 持續(xù)24。為了評估肌肉生長抑制素在纖維變性中的作用，虎蛇毒素創(chuàng)傷之后 比較這兩種肌肉基因型的組織(參見實(shí)施例1中的方法一節(jié))。在第28天， 在蘇木精和曙紅染色的切片中觀察到來自于受傷的野生型肌肉的疤痕組
織，而在肌肉生長抑制素〃-肌肉切片中只觀察到非常少的(圖7)。 VanGeisen 氏染色進(jìn)一步確認(rèn)了結(jié)締組織的存在(圖7)。在第28天，野生型肌肉切片上 有較大的膠原面積，所以與肌肉生長抑制素一肌肉相比，受傷的野生型組織 中可見到更多疤痕組織。為了進(jìn)一步確認(rèn)該結(jié)果，用掃描電子顯微鏡分析 再生的肌肉。第0天(對照)和第24天的再生肌肉的掃描電子顯孩t照片，顯 示結(jié)締組織框架包圍著曾一度由肌纖維占據(jù)的空間(圖7)。在對照(未受損) 的樣品中，野生型和肌肉生長抑制素一肌肉在纖維腔周圍都沒有變厚的結(jié)締 組織?？墒?，到了創(chuàng)傷愈合的第24天，在野生型肌肉中觀察到了密集的結(jié) 締組織束(圖7)，但在肌肉生長抑制素一肌肉中沒有觀察到。相似地，在割 傷肌肉模型中比較肌肉生長抑制素缺失的與野生型小鼠，在肌肉生長抑制 素缺失的小鼠中，第28天修復(fù)的創(chuàng)傷位點(diǎn)上膠原積累的程度顯著減少(數(shù)據(jù) 未提供)。這些結(jié)果確認(rèn)了缺少肌肉生長抑制素會導(dǎo)致創(chuàng)傷后疤痕組織減少。^邏^乂,資y^冷存i #/^效/產(chǎn)舉茇#為了研究諸如350的肌肉生長抑制素拮抗劑在增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合中的功效， 用虎蛇毒素使1歲大的野生型小鼠(C57 Black)受損傷并注射350 (參見實(shí) 施例1中的方法)。典型地，在虎蛇毒素?fù)p傷后，肌肉重量起初由于產(chǎn)生的 水腫而增加，然后由于受損的肌纖維壞死而降低，所述受損肌纖維從受損 位點(diǎn)處被清除。這以后，肌肉重量由于新纖維的生長而開始增加。試驗(yàn)結(jié) 果顯示在第7和10天，350處理的肌肉的重量喪失不如注射對照鹽水的肌 肉的多(圖8)。這可能是由于較快修復(fù)受損的肌肉而造成的。提供的分子數(shù) 據(jù)(圖4)確實(shí)支持以下假說即在350治療的小鼠中，受損的肌肉較快地 愈合是由于巨噬細(xì)胞遷移的加速和增強(qiáng)以及較早討論的其它加速肌肉再生 的過程的組合而造成的，所述其它加速創(chuàng)傷愈合的過程與肌肉生長抑制素 拮抗劑用于創(chuàng)傷愈合的用途有關(guān)。組織學(xué)分析證實(shí)了鹽水和350處理的肌肉之間的差異。蘇木精和曙紅 染色顯示了與鹽水處理的肌肉相比，在用350處理的肌肉中初生肌纖維較 早的形成了，而且相關(guān)地壞死區(qū)域較早的減少？(圖9)。該結(jié)果證實(shí)了在 350處理的小鼠中肌肉創(chuàng)傷愈合加速并增強(qiáng)了。分析圖9所示的組織學(xué)數(shù)據(jù) 以定量整個(gè)肌肉橫切面視野區(qū)域上的愈合的和未愈合的面積。肌肉切片始 終取自每片肌肉中間飽滿部分。圖10中所示的分析顯示，與350治療的小
鼠相比，在第7天在鹽水治療的對照小鼠中未再生的面積增加了。結(jié)果，與350處理的小鼠相比，在第7天在對照中有相對較多的肌肉組織喪失。 在第IO天也見到了相同的效果。這些結(jié)果確認(rèn)了，用350蛋白質(zhì)治療在從 創(chuàng)傷損傷中恢復(fù)的肌肉中導(dǎo)致較少的肌肉組織喪失。這預(yù)期能導(dǎo)致愈合肌 肉的功能性增強(qiáng)。另外，4企測月交原的Van Geisen染色顯示在施用虎蛇毒素后第10和28 天，與鹽水處理的肌肉相比，膠原沉積的水平在350處理的肌肉中下降了， 這顯示在傷口愈合過程中，350處理能減少纖維變性(圖11)。該結(jié)果證明 了 ，諸如350的肌肉生長抑制素拮抗劑在創(chuàng)傷愈合期間減少了疤痕組織(纖 維變性)的形成。此外，較少的疤痕組織以及增多的肌肉組織將顯著增加用 3 5 0處理的愈合肌肉與對照相比的功能性。利用VanGeisen染色成像，施用虎蛇毒素后第28天測量隨機(jī)挑選的再 生的纖維區(qū)域以評估纖維大小(圖12)。得自該分析的結(jié)果顯示，來自350 處理的肌肉的恢復(fù)的肌纖維顯著大于鹽水處理的肌肉。經(jīng)修復(fù)的肌纖維大 小增加確認(rèn)了由于通過350抑制肌肉生長抑制素功能而誘導(dǎo)出肌肉細(xì)胞的 肥大。為了進(jìn)一步確認(rèn)350處理的小鼠中創(chuàng)傷愈合增加部分是由于衛(wèi)星細(xì)胞 活化增加而造成的，我們對Pax7和MyoD蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分子分析。 Pax7蛋白是衛(wèi)星細(xì)胞的標(biāo)記物，而MyoD的表達(dá)表示衛(wèi)星細(xì)胞的活化。蛋 白質(zhì)分析確認(rèn)衛(wèi)星細(xì)胞水平和活化增加(圖13)。用350治療的Pax7水平 (圖13A)在第3、 7、 10、和28天較高，這顯示與鹽水處理的肌肉相比，衛(wèi) 星細(xì)胞活化增加了。另外，在350處理的肌肉中，Pax7水平在第7和10 天之間增加了，而相反，在鹽水處理的肌肉中觀察到了下降。這顯示了， 在350處理的肌肉中，在第10天左右衛(wèi)星細(xì)胞活化增加了 。用350治療的 MyoD水平(圖13B)在第3、 7、和10天也較高，這顯示與鹽水處理的肌肉 相比，增加了肌形成。綜合考慮，在350處理的組織中較高的Pax7和MyoD 水平支持了衛(wèi)星細(xì)胞活化的觀察結(jié)果，因此繼而肌形成增加了。該結(jié)果確 認(rèn)了用350處理能加速并增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合。350誘導(dǎo)創(chuàng)傷愈合增強(qiáng) 為了評估在創(chuàng)傷位點(diǎn)直接應(yīng)用350對增強(qiáng)創(chuàng)傷愈合的有效性，將350后正在再生的脛骨前肌上。未受損的右脛骨前肌用作為對照。在創(chuàng)傷后第2、 4、 7、 10和21天收集受損的和對照肌肉并確定 它們的重量。在創(chuàng)傷后第2和4天，在注射350和注射鹽水的脛骨前肌中 都觀察到了由于炎性浸潤造成的最初的肌肉重量增力口(圖14)。在對肌肉進(jìn)行 創(chuàng)傷后第7至10天，注射350和注射鹽水的脛骨前肌都恢復(fù)到它們的正常 重量。可是，在創(chuàng)傷后第21天，與鹽水處理的肌肉相比，注射350的脛骨 前肌顯示出通過肌肉重量反映出的肌肉大小顯著增加。討論肌肉生長抑制素是有效的肌肉形成負(fù)調(diào)節(jié)劑。令人驚訝地，當(dāng)前結(jié)果 證實(shí)了，肌肉生長抑制素也參與調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答，并從而控制肌肉愈合過程 和疤痕組織形成。作為正常創(chuàng)傷愈合過程的部分，創(chuàng)傷后巨噬細(xì)胞立即浸 潤創(chuàng)傷位點(diǎn)，并通過釋放趨化因子參與愈合過程的關(guān)鍵步驟，如調(diào)節(jié)皮膚 "和其他組織中的上皮形成、組織重塑和血管生成。組織學(xué)數(shù)據(jù)清楚證明了，與野生型小鼠相比，巨噬細(xì)胞和成肌細(xì)胞向 肌肉生長抑制素；小鼠的脛骨肌前肌創(chuàng)傷區(qū)域的浸潤增加并加速(圖1)。其 次，在肌肉生長抑制素；小鼠中，新的肌纖維替代了大部分喪失的肌纖維， 而結(jié)締組織的積聚減少了(圖7)。在受傷的肌肉中，受損的肌纖維會壞死。 在創(chuàng)傷愈合期間，小血管、單核細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞侵入壞死區(qū)域。這 些活化的淋巴細(xì)胞同時(shí)分泌幾種細(xì)胞因子和生長因子，其在趨化性和隨之 的創(chuàng)傷愈合過程中起關(guān)鍵作用。更重要的是，在損傷位點(diǎn)上釋放生長因子 還調(diào)節(jié)了成肌細(xì)胞遷移、增殖和分化，從而促進(jìn)肌肉創(chuàng)傷愈合和修復(fù)26。本 文顯示，肌肉生長抑制素拮抗劑通過增加較早的成肌細(xì)胞的積聚而增加組 織修復(fù)，從而加速愈合。先前顯示，在許多創(chuàng)傷類型中，受創(chuàng)傷后肌肉生長抑制素很快出現(xiàn)在 創(chuàng)傷位點(diǎn)。本文顯示在趨化性實(shí)驗(yàn)中，肌肉生長抑制素抑制了巨噬細(xì)胞和 成肌細(xì)胞的遷移。重要的是，加入諸如350的肌肉生長抑制素拮抗劑成功 克服肌肉生長抑制素對成肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞遷移的負(fù)效應(yīng)。因此當(dāng)用肌肉 生長抑制素拮抗劑處理損傷組織時(shí)，巨噬細(xì)胞和成肌細(xì)胞向創(chuàng)傷位點(diǎn)的遷 移的加速和增強(qiáng)導(dǎo)致創(chuàng)傷愈合改善。我們的結(jié)果顯示有效的肌肉生長抑制 素拮抗劑350在注射入正在創(chuàng)傷愈合的小鼠中時(shí)，可增進(jìn)創(chuàng)傷愈合。纖維變性是創(chuàng)傷愈合過程的一部分，但過多的纖維變性導(dǎo)致留下疤痕 并減少組織的功能。成纖維細(xì)胞在膠原沉積和創(chuàng)傷的疤痕形成中起主要作 用。研究在此前已經(jīng)將成纖維細(xì)胞積聚的程度與皮膚燒傷創(chuàng)傷的疤痕相關(guān) 聯(lián)"。我們在本文中顯示，肌肉生長抑制素是強(qiáng)有力的成纖維細(xì)胞化學(xué)引誘 物，而以前已顯示肌肉生長抑制素在受創(chuàng)傷后不久在創(chuàng)傷組織中以增加的 水平積聚。在肌肉生長抑制素缺失的小鼠中減少了切傷位點(diǎn)處成纖維細(xì)胞 的積聚，繼而減少了在痊愈的創(chuàng)傷處的疤痕形成。重要的是，本文提供的 數(shù)據(jù)顯示，通過局部和全身施用拮抗劑而得到的拮抗肌肉生長抑制素的能 力在已經(jīng)歷創(chuàng)傷愈合的組織中繼而導(dǎo)致減少組織中膠原積聚和疤痕形成。 在許多纖維變性疾病中發(fā)現(xiàn)膠原是主要的病理檢查所見27。因此預(yù)計(jì)，通過 施用肌肉生長抑制素抑制劑可以治療其他醫(yī)學(xué)狀況，如嚢性纖維化、胰腺 的纖維嚢性疾病、胰管粘稠物阻塞癥、胰嚢性纖維化、骨髓纖維化、特發(fā) 性肺纖維變性、肝纖維變性、硬皮病、成骨不全或特征在于膠原和纖維變 性組織過度沉積的任何其他的纖維變性狀況。結(jié)論本文顯示，全身和局部使用的肌肉生長抑制素抑制劑通過加速和增強(qiáng) 幾種關(guān)鍵過程來增加創(chuàng)傷愈合的速率。也顯示，應(yīng)用肌肉生長抑制素抑制 劑可在最終痊愈的創(chuàng)傷位點(diǎn)上減少膠原沉積，其防止組織功能的喪失或由 于結(jié)疤造成的美容性損害。上述實(shí)施例的目的不在于限制本發(fā)明的范圍。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將能 認(rèn)識到，許多變化也是可能的而不超出本發(fā)明的范圍(如所附權(quán)利要求書 所設(shè)定的)。參考文獻(xiàn)1. 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權(quán)利要求
1. 增進(jìn)組織創(chuàng)傷愈合的方法，包括向有需要的人或非人患者施用有效 量的至少 一種肌肉生長抑制素拮抗劑的步驟。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑選自 由下列所組成的組-抗月幾肉生長抑制素抗體；-肌肉生長抑制素肽免疫原、肌肉生長抑制素多聚體或肌肉生長抑制 素免疫綴合物，其能引發(fā)免疫應(yīng)答并阻斷肌肉生長抑制素活性；-肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)抑制劑，其選自截短的激活蛋白II型受體、 肌肉生長抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白質(zhì)抑制劑的功能片段；-從過量表達(dá)肌肉生長抑制素的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)物中的肌肉生長抑 制素抑制劑；-顯性陰性的肌肉生長抑制素，其選自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能結(jié)合并抑制肌肉生長抑 制素；-肌肉生長抑制素的剪接變體；-肌肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑；和-反義多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生長抑制素核酶，其能通過
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是顯 性陰性的肌肉生長抑制素，所述顯性陰性的肌肉生長抑制素選自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是成 熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335或 350位上具有C-末端截短。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是肌 肉生長抑制素的剪接變體，所述剪接變體選自多肽SEQIDNO: 8-14、或其 功能片段或變體、或與其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是肌 肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑，其包含"強(qiáng)效"肽SEQIDNO: 16或SEQIDNO: 18、或其功能片段或變體、或與其具有至少95%、卯％、 85%、 80%、 75% 或70%序列同一性的序列。
7. 如權(quán)利要求l-6任一項(xiàng)所述的方法，其用于增進(jìn)以下的創(chuàng)傷的愈合 淺表皮膚創(chuàng)傷，包括割傷和擦傷；貫穿皮膚和肌肉的深層創(chuàng)傷，包括外科 手術(shù)切口；內(nèi)傷，包括由運(yùn)動(dòng)損傷或外傷造成的肌肉和肌腱創(chuàng)傷，挫傷和 血腫；和燒傷。
8. 如權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)所述的方法，其中一種或多種額外的免疫應(yīng)答 化合物與至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑分開、順序或同時(shí)聯(lián)合施用以進(jìn) 一步增進(jìn)創(chuàng)傷愈合，所述免疫應(yīng)答化合物選自由糖皮質(zhì)激素、非甾族抗炎 藥(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a拮抗劑組成的組。
9. 如權(quán)利要求l-7任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮 抗劑配制成用于局部或全身施用。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑配 制成用于口服、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、皮內(nèi)、局部、鼻腔、肺部、肌肉內(nèi) 或腹膜內(nèi)施用。
11. 至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑在制備用于增進(jìn)有需要的人或非 人患者的組織創(chuàng)傷愈合的藥物中的用途。
12. 如權(quán)利要求ll所述的用途，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑選 自由下列所組成的組-抗肌肉生長抑制素抗體；-肌肉生長抑制素肽免疫原、肌肉生長抑制素多聚體或肌肉生長抑制 素免疫綴合物，其能引發(fā)免疫應(yīng)答并阻斷肌肉生長抑制素活性；-肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)抑制劑，其選自截短的激活蛋白n型受體、肌肉生長抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白質(zhì)抑制劑的功能片段；-從過量表達(dá)肌肉生長抑制素的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)物中的肌肉生長抑 制素抑制劑；-顯性陰性的肌肉生長抑制素，其選自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小狀，而且其能結(jié)合并抑制肌肉生長抑 制素；-肌肉生長抑制素的剪接變體；-肌肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑；和-反義多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生長抑制素核酶，其能通過
13. 如權(quán)利要求12所述的用途，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是 顯性陰性的肌肉生長抑制素，所述顯性陰性的肌肉生長抑制素選自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短。
14. 如權(quán)利要求13所述的用途，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是 成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335或 350位上具有C-末端截短。
15. 如權(quán)利要求12所述的用途，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是 肌肉生長抑制素的剪接變體，所述剪接變體選自多肽SEQIDNO: 8-14、或 其功能片段或變體、或與其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同 一性的序列。
16. 如權(quán)利要求12所述的用途，其中至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑是 肌肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑包含"強(qiáng)效"肽SEQ ID NO: 16 或SEQIDNO: 18、或其功能片段或變體、或與其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同 一性的序列。
17. 如權(quán)利要求11-16任一項(xiàng)所述的用途，其用于增進(jìn)以下的創(chuàng)傷的愈 合淺表皮膚創(chuàng)傷，包括割傷和擦傷；貫穿皮膚和肌肉的深層創(chuàng)傷，包括 外科手術(shù)切口；內(nèi)傷，包括由運(yùn)動(dòng)損傷或外傷造成的肌肉和肌腱創(chuàng)傷，挫 傷和血肺；和燒傷。
18. 如權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)所述的用途，其中所述藥物進(jìn)一步包含選 自由糖皮質(zhì)激素、非甾族抗炎藥(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a拮抗劑組成的組的 一種或多種額外的免疫應(yīng)答化合物，并且其中該藥物配制成 用于至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑和所述額外的化合物分開、順序或同 時(shí)施用。
19. 如權(quán)利要求11-17任一項(xiàng)所述的用途，其中該藥物配制成用于局部 或全身施用。
20. 如權(quán)利要求19所述的用途，其中所述藥物配制成用于口服、靜脈內(nèi)、 經(jīng)皮、皮下、皮內(nèi)、局部、鼻腔、肺部、肌肉內(nèi)或腹月莫內(nèi)施用。
21. 藥物化合物，其包含至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑和藥學(xué)上可接 受的載體，所述藥物化合物用于增進(jìn)有需要的人或非人患者的創(chuàng)傷愈合的 方法中。
22. 如權(quán)利要求21所述的藥物化合物，其中至少一種肌肉生長抑制素拮 抗劑選自由下列所組成的組-抗肌肉生長抑制素抗體；-月幾肉生長抑制素肽免疫原、肌肉生長抑制素多聚體或肌肉生長抑制 素免疫綴合物，其能引發(fā)免疫應(yīng)答并阻斷肌肉生長抑制素活性；-肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)抑制劑，其選自截短的激活蛋白II型受體、 肌肉生長抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白質(zhì)抑制劑的功能片段；-從過量表達(dá)肌肉生長抑制素的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)物中的肌肉生長抑 制素抑制劑；-顯性陰性的肌肉生長抑制素，其選自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能結(jié)合并抑制肌肉生長抑 制素；-肌肉生長抑制素的剪接變體；-月幾肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑；和-反義多核苦酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生長抑制素核酶，其能通過
23.如權(quán)利要求22所述的藥物化合物，其中至少一種肌肉生長抑制素拮 抗劑是顯性陰性的肌肉生長抑制素，所述顯性陰性的肌肉生長抑制素選自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短。
24. 如權(quán)利要求23所述的藥物化合物，其中至少一種肌肉生長抑制素拮 抗劑是成熟的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸 第335或350位上具有C-末端截短。
25. 如權(quán)利要求22所述的藥物化合物，其中至少一種肌肉生長抑制素拮 抗劑是肌肉生長抑制素的剪接變體，所述剪接變體選自多肽SEQ ID NO: 8-14、或其功能片段或變體、或與其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或 70%序列同一性的序列。
26. 如權(quán)利要求22所述的藥物化合物，其中至少一種肌肉生長抑制素拮 抗劑是肌肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑包含"強(qiáng)效"肽SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18、或其功能片^R或變體、或與其具有至少95。/。、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
27. 如權(quán)利要求21-26任一項(xiàng)所述的藥物化合物，其用于增進(jìn)以下的創(chuàng) 傷的愈合表面皮膚創(chuàng)傷，包括割傷和擦傷；延伸穿過皮膚和肌肉的深層 創(chuàng)傷，包括外科手術(shù)切口；內(nèi)傷，包括由運(yùn)動(dòng)損傷或外傷造成的肌肉和肌 腱創(chuàng)傷，挫傷和血腫；和燒傷。
28. 如權(quán)利要求21-27任一項(xiàng)所述的藥物化合物，其進(jìn)一步包含選自由 糖皮質(zhì)激素、非甾族抗炎藥(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a拮抗劑組 成的組的一種或多種額外的免疫應(yīng)答化合物，其中該組合物配制成與至少 一種肌肉生長抑制素拮抗劑分開、順序或同時(shí)施用。
29. 如權(quán)利要求21-27任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其配制成用于局部或 全身施用。
30. 如權(quán)利要求29所述的藥物化合物，其配制成用于口服、靜脈內(nèi)、經(jīng) 皮、皮下、皮內(nèi)、局部、鼻腔、肺部、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)施用的配方。
31. 至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，其用于增進(jìn)有需要的人或非人患 者的創(chuàng)傷愈合的方法中。
32. 如權(quán)利要求31所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，其選自由下 列所組成的組-抗肌肉生長抑制素抗體；-肌肉生長抑制素肽免疫原、肌肉生長抑制素多聚體或肌肉生長抑制 素免疫綴合物，其能引發(fā)免疫應(yīng)答并阻斷肌肉生長抑制素活性；-肌肉生長抑制素的蛋白質(zhì)抑制劑，其選自截短的激活蛋白II型受體、肌肉生長抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白質(zhì)抑制劑的功能片段；-從過量表達(dá)肌肉生長抑制素的細(xì)胞中釋放到培養(yǎng)物中的月/L肉生長抑 制素抑制劑；-顯性陰性的肌肉生長抑制素，其選自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之間具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能結(jié)合并抑制肌肉生長抑 制素；-肌肉生長抑制素的剪接變體；-肌肉生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑；和-反義多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生長抑制素核酶，其能通過
33. 如權(quán)利要求32所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，其包含顯性 陰性的肌肉生長抑制素，其選自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生長抑 制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸 第335至375位之間具有C-末端截短。
34. 如權(quán)利要求33所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，其包含成熟 的肌肉生長抑制素肽，所述成熟的肌肉生長抑制素肽在氨基酸第335或350 位上具有C-末端截短。
35. 如權(quán)利要求32所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，其包含肌肉 生長抑制素的剪接變體，所述剪接變體選自多肽SEQIDNO: 8-14、或其功 能片段或變體、或與其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性 的序列。
36. 如權(quán)利要求32所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑，其包含肌肉 生長抑制素途徑的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑包含"強(qiáng)效"肽SEQIDNO: 16或SEQ ID NO: 18、或其功能片段或變體、或與其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
37. 如權(quán)利要求31-36任一項(xiàng)所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑， 其用于增進(jìn)以下的創(chuàng)傷的愈合表面皮膚創(chuàng)傷，包括割傷和擦傷；延伸穿 過皮膚和肌肉的深層創(chuàng)傷，包括外科手術(shù)切口；內(nèi)傷，包括由運(yùn)動(dòng)損傷或 外傷造成的肌肉和肌腱創(chuàng)傷，挫傷和血腫；和燒傷。
38. 如權(quán)利要求31-37任一項(xiàng)所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑， 其與選自由糖皮質(zhì)激素、非甾族抗炎藥(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a 拮抗劑組成的組的一種或多種其他的免疫應(yīng)答化合物組合在一起，用于與 至少 一種肌肉生長抑制素拮抗劑分開、順序或同時(shí)施用以進(jìn)一 步增進(jìn)創(chuàng)傷 愈合。
39. 如權(quán)利要求31-37任一項(xiàng)所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑， 其配制成用于局部或全身施用。
40. 如權(quán)利要求34所述的至少一種肌肉生長抑制素拮抗劑配制成用于 口服、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、皮內(nèi)、局部、鼻腔、肺部、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi) 施用。
41. 治療纖維變性疾病或病癥的方法，其包括向有需要的患者施用治療 有效量的肌肉生長抑制素拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過利用一種或多種肌肉生長抑制素拮抗劑抑制肌肉生長抑制素(GDF-8)活性而增進(jìn)人或動(dòng)物患者的創(chuàng)傷愈合的方法。本發(fā)明還涉及治療纖維變性疾病或病癥的方法，包含施用肌肉生長抑制素拮抗劑。
文檔編號A61K38/18GK101146547SQ200680009255
公開日2008年3月19日 申請日期2006年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月7日
發(fā)明者亞歷克斯·亨內(nèi)布里, 姆里杜拉·沙瑪, 拉維·坎巴德, 莫妮卡·森納塞勒諾德莫拉 申請人:奧里科有限公司