一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米功能材料、免疫分析以及生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤的發(fā)病率高，生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移速度快，對(duì)人類(lèi)的健康有極大的危害。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和釋放的以抗原、酶、激素等形式的代謝產(chǎn)物存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)或宿主體液中，其在臨床上對(duì)于隨原發(fā)腫瘤的發(fā)現(xiàn)，腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度的判斷，腫瘤的治療效果的觀(guān)察和評(píng)價(jià)及腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的預(yù)測(cè)產(chǎn)生極大的影響，引起人們的廣泛關(guān)注。
[0003]AFP、CEA等常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物，對(duì)于肝癌的診斷都能起到一定的作用。對(duì)于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)方法很多，如放射免疫分析法、免疫放射分析法、酶標(biāo)記免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光分析法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等，但多數(shù)檢測(cè)方法繁瑣，操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，檢出限高，因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法有重要意義。
[0004]夾心型電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了高特異性的免疫分析技術(shù)和高靈敏的電化學(xué)分析技術(shù)，具有靈敏度高、制備簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全控制、生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價(jià)值。而構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器的關(guān)鍵有兩點(diǎn):其一是采用簡(jiǎn)單、快速、有效的方法將抗原、抗體等生物分子固定在電極表面；其二是開(kāi)發(fā)傳感器的信號(hào)放大技術(shù)。
[0005]多壁碳納米管具有大的比表面積，β -環(huán)糊精/多壁碳納米管具有良好的導(dǎo)電性能，以及大的比表面積，能夠很好的固載抗體，能夠加速電子傳遞，對(duì)于提高傳感器靈敏度具有重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)癌胚抗原CEA和甲胎蛋白AFP的的靈敏檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明的目的之一是提供一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備方法。
[0008]本發(fā)明的目的之二是將所制備的一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器，用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案，包括以下步驟:
1.一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備方法，所述的免疫傳感器的制備，步驟如下:
(I)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2Mf6PL、1.0 -3.0 mg/mL的β -環(huán)糊精/多壁碳納米管滴涂在電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6μ?、5 ~ 12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物一抗Ab1溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5 ~ 2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；滴加6 PL、lpg/mL ~10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(5)將6μ?Λ ~ 3 mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器。
[0010]2.所述的一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器，傳感材料的制備方法，包括以下步驟:
(1)β -環(huán)糊精/多壁碳納米管的制備，步驟如下:
將10 ~ 20 mg的多壁碳納米管和300 ~ 600 mg β -環(huán)糊精混合，在研缽中研磨8~12min，并在這過(guò)程中逐滴加入無(wú)水乙醇；然后，再繼續(xù)研磨2 h，獲得均勻的黑色粉末；置于80 0C干燥箱內(nèi)干燥，制得β -環(huán)糊精/多壁碳納米管；
(2)檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs/Ab2溶液的制備，步驟如下:
①二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管AgNPS@Mn02@MWCNTs的制備，步驟如下: 將多壁碳納米管置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65 %的硝酸中，25 0C下攪拌24 h;然后，超純水清洗三次，100 0C干燥；
0.15 ~ 0.3g經(jīng)過(guò)上述酸化過(guò)的多壁碳納米管和80 ~ 160 mL、0.1 mol/L的高錳酸鉀溶液混合，40 0C攪拌2 h;逐滴加入20 ~ 40 mL、0.2 mol/L的硫酸錳溶液，40 0C下繼續(xù)攪拌21 h ;用超純水和無(wú)水乙醇分別清洗三次，放入120 °(:的干燥箱里干燥6 h，制得MnO2OMWCNTs ；
30 ~ 60 mg的MnO2OMWCNTs和30 ~ 60 mg的硝酸銀分散在30~ 60 mL超純水中，室溫下攪拌24 h，離心去掉上清液，在分散在超純水中，逐滴加入50 mmol/L的硼氫化鈉溶液，直至顏色不再變化，離心，干燥，得到AgNPS@Mn02@MWCNTs ；
②檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs/Ab2溶液的制備，步驟如下:
在2 mL、2 ~ 4 mg/mL的檢測(cè)抗體標(biāo)記物AgNPS@Mn02@MWCNTs溶液中，加入I ~ 3 mL、8-12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)抗體Ab2S液，4°C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩孵化12 h ;離心分離后，加入I mL的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液，得到檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs /Ab2溶液，4°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0011]一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器，用于腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下:
(1)使用電化學(xué)工作站以三電極體系進(jìn)行測(cè)試，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，所制備的傳感器為工作電極，在10 mL、50 mmol/L的pH 5.59- 8.02磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試；
(2)用計(jì)時(shí)電流法對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)，輸入電壓為-0.4 V，取樣間隔0.1 S，運(yùn)行時(shí)間 400 s ； (3)當(dāng)背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液中注入10 yL、5 mol/L的雙氧水溶液，記錄電流變化。
[0012]上述腫瘤標(biāo)志物選自下列之一:AFP、CEA。
[0013]本發(fā)明所用原材料均可在化學(xué)試劑公司或生物制藥公司購(gòu)買(mǎi)。
[0014]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明使用了β-環(huán)糊精/多壁碳納米管為基底材料，β -環(huán)糊精/多壁碳納米管具有大的比表面積，以及良好的導(dǎo)電能力，能夠很好的固載一抗，并能加速電子的傳遞，對(duì)于實(shí)現(xiàn)傳感器的高靈敏度以及低檢測(cè)限具有重要意義；
(2)采用AgNPS@Mn02@MWCNTs作為檢測(cè)抗體標(biāo)記物，多壁碳納米管具有大的比表面積以及良好的導(dǎo)電能力，MnOjP Ag NPS對(duì)過(guò)氧化氫有催化作用，AgNPSOMnO 2iMWCNTs實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的多重協(xié)同放大，因此提高了傳感器的靈敏度，降低了檢測(cè)限；
(3)一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)，其線(xiàn)性范圍I pg/mL?10 ng/mL，檢測(cè)限最低0.3 pg/mL，表明一種基于二氧化猛負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器可以達(dá)到準(zhǔn)確測(cè)定的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6PL、1.0mg/mL的β -環(huán)糊精/多壁碳納米管滴涂在電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6μ?、5 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物一抗Ab1溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；滴加6 PL、lpg/mL~ 10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(5)將6μ?Λ mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器。
[0016]實(shí)施例2—種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、2.0 mg/mL的β -環(huán)糊精/多壁碳納米管滴涂在電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6μ?,8 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物一抗Ab1溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；滴加6 PL、lpg/mL~ 10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥； (5)將6 μ?,2 mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器。
[0017]實(shí)施例3—種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器的制備，步驟如下:
(1)將直徑為4mm的玻碳電極用Al2O3拋光粉打磨，超純水清洗干凈；
(2)將6μ?、3.0 mg/mL的β -環(huán)糊精/多壁碳納米管滴涂在電極表面，晾干，用超純水沖洗，晾干；
(3)繼續(xù)將6μ?, 12 Pg/mL的腫瘤標(biāo)志物一抗Ab1溶液滴加到電極表面，超純水沖洗，
4 °C冰箱中干燥；
(4)繼續(xù)將3PL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到電極表面，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，超純水沖洗，4°C冰箱中晾干；滴加6 PL、lpg/mL ~ 10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標(biāo)志物抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液到電極表面，超純水沖洗，4°C冰箱中干燥；
(5)將6μ?、3 mg/mL的檢測(cè)抗體孵化物AgNPS@Mn02@MWCNTs /Ab2溶液滴涂于電極表面上，置于4°C冰箱中晾干，制得一種基于二氧化錳負(fù)載銀納米粒子多壁碳納米管構(gòu)建的免疫傳感器。
[0018]實(shí)施例4 環(huán)糊精/多壁碳納米管的制備，步驟如下:
將10 mg的多壁碳納米管和600 mg β -環(huán)糊精混合，在研缽中研磨8 min，并在這過(guò)程中逐滴加入無(wú)水乙醇。然后，再繼續(xù)研磨2 h，獲得均勻的黑色粉末；置于80 0C干燥箱內(nèi)干燥，制得環(huán)糊精/多壁碳納米管。
[0019]實(shí)施例5 環(huán)糊精/多壁碳納米管的制備，步驟如下:
將15 mg的多壁碳納米管和450 mg β -環(huán)糊精混合，在研缽中研磨10 min，并在這過(guò)程中逐滴加入無(wú)水乙醇。然后，再繼續(xù)研磨2 h，獲得均勻的黑色粉末；置于80 0C干燥箱內(nèi)干燥，制得環(huán)