一種用于生物標(biāo)記物篩選的抗體芯片試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于生物標(biāo)記物篩選的抗體芯片試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞因子（cytokines)是機(jī)體的免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞合成和分泌的具有免疫調(diào) 節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多膚。
[0003] 細(xì)胞因子具有非常廣泛的生物學(xué)活性，能夠促進(jìn)祀細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)或抑 制其它細(xì)胞因子和膜表面分子的表達(dá)，增強(qiáng)抗感染和細(xì)胞殺傷效應(yīng)，促進(jìn)炎癥過程，影響細(xì) 胞代謝等。細(xì)胞因子可被分為白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子超家族、集落刺激因子、趨 化因子、生長因子等。眾多細(xì)胞因子在體內(nèi)通過旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式發(fā)揮作用， 具有多效性、重疊性、枯抗性、協(xié)同性等多種生理特性，形成了十分復(fù)雜的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng) 絡(luò)，參與人體多種重要的生理功能。
[0004] 細(xì)胞因子是通過與祀細(xì)胞表面的細(xì)胞因子受體特異結(jié)合后發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的， 促進(jìn)祀細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)抗感染和殺腫瘤細(xì)胞效應(yīng)，促進(jìn)或抑制其他細(xì)胞因子的合 成，促進(jìn)炎癥過程，影響細(xì)胞代謝等。每種細(xì)胞因子可作用于多種細(xì)胞，可受多種細(xì)胞因子 的調(diào)節(jié)，具有網(wǎng)絡(luò)性的特點(diǎn)；不同細(xì)胞因子之間具有相互協(xié)同或相互制約的作用，由此構(gòu)成 了復(fù)雜的細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。
[0005] 因此，細(xì)胞因子研究及檢測具有非常重要的理論和實(shí)用意義，利用細(xì)胞因子抗體 芯片檢測病人標(biāo)本，可篩選出此疾病的生物標(biāo)記物，有助于闡明分子水平的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理， 有助于疾病的預(yù)防、診斷和治療。
[0006] 目前常用的細(xì)胞因子的檢測方法主要包括：酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，放 射免疫分析（radio immunoassay, RIA)，免疫印績法（western blot),流式細(xì)胞儀 (Flow-切tometar)，液相磁珠法（LUMI肥X)和96-孔化ISA板法等。其中，酶聯(lián)免疫吸附法 是最普遍的方法，具靈敏度高、特異性較好、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)。但一次試驗(yàn)只能檢測單一指 標(biāo)，通量低、成本高，在具有多指標(biāo)特性的細(xì)胞因子檢測中，該方法存在明顯的不足；放射免 疫分析（RIA)雖然靈敏度高，是由于具有放射性污染，現(xiàn)在已很少采用；免疫印跡法能測定 分子的大小，且無非特異的反應(yīng)，但操作繁瑣，靈敏度低，且只能檢測單一指標(biāo)，不適合運(yùn)用 于細(xì)胞因子的檢測；流式細(xì)胞儀能在細(xì)胞水平上檢測細(xì)胞因子的水平，但卻存在低靈敏、低 通量、高成本等缺點(diǎn)，且采用的設(shè)備結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易推廣。液相磁珠法（LUffl肥幻容易出現(xiàn) 交叉干擾，W至于同時(shí)檢測因子的數(shù)目有限。96孔化ISA板法是把不同的捕獲抗體W微陣 列的方式固定在96孔酶標(biāo)板底，然后通過類似化ISA的操作來達(dá)到多因子的聯(lián)合檢測。但 由于96孔酶標(biāo)板受孔徑大小限制，在一個(gè)孔內(nèi)點(diǎn)的數(shù)目有限，重復(fù)性也差。
[0007] 因此，有必要開發(fā)一種新型的多細(xì)胞因子聯(lián)合檢測試劑盒，W克服現(xiàn)有技術(shù)中亟 待解決的問題，實(shí)現(xiàn)多細(xì)胞因子的高通量、高靈敏度、高特異性和低成本檢測，實(shí)現(xiàn)疾病的 生物標(biāo)記物的高通量篩選。在本發(fā)明中，我們選用沒有空間限制的底膜作為載體，將60種 細(xì)胞因子的捕獲抗體點(diǎn)不受空間的限制，具有獨(dú)立位點(diǎn)地點(diǎn)在底膜上，減少捕獲抗體彼此 干擾的因素，使得細(xì)胞因子高通量篩選成為可能，所檢測的細(xì)胞因子靈敏度可達(dá)單因子的 ELISA檢測靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種高通量、高靈敏 度、高特異性和低成本的細(xì)胞因子檢測試劑盒，采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)，能夠同時(shí)檢測六十項(xiàng) 細(xì)胞因子，克服了現(xiàn)有技術(shù)操作繁瑣、檢測指標(biāo)單一、需有費(fèi)儀器、靈敏度低等缺陷，具有廉 價(jià)、便利、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、標(biāo)本用量少、能在普通實(shí)驗(yàn)室推廣和規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)。
[0009] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的一種檢測多種細(xì)胞因子用于篩選生物標(biāo)記 物的抗體芯片試劑盒，包括：抗體芯片，包括底膜和在底膜表面上固定的60種細(xì)胞因子的 特異性抗體、H種陽性對照；生物素標(biāo)記的細(xì)胞因子檢測抗體混合物；和辣根過氧化物酶 標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述底膜為硝酸纖維素膜、聚偏氣己帰 膜或者尼龍膜，采用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀完成點(diǎn)樣操作，各特異性抗體點(diǎn)陣排布于所述底膜。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述60種細(xì)胞因子的特異性抗體是通 過W下方法固定在所述底膜上的：將所述特異性抗體混合溶解于含有0. Ol-lOg/lOOml牛 白蛋白的Tris緩沖液中，配制濃度為0. 5-l(K)ng/100ml的抗體溶液，取50-500nl點(diǎn)樣于底 膜上，將點(diǎn)樣好的底膜放于室溫條件下靜置5分鐘到8分鐘，于2C到8C保存?zhèn)溆谩?br>[0012] 根據(jù)本發(fā)明所述的蛋白聯(lián)合檢測芯片的進(jìn)一步特征，種不同濃度的生物素標(biāo) 記的小牛IgG作為陽性對照，作為不同微陣列間的標(biāo)準(zhǔn)化參照系。
[0013] 可采用全自動(dòng)點(diǎn)樣儀完成點(diǎn)樣操作。每種抗體和H種不同濃度的陽性對照在每個(gè) 芯片中都有兩次的重復(fù)。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明所述的試劑盒的進(jìn)一步特征，所述特異性抗體為選自針對如下細(xì)胞因 子的抗體；血管生成素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、B-淋己細(xì)胞趨化因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6、CK目8-1、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子、表皮生長因子、趨化因子、趨化因子-2、 趨化因子-3、成纖維細(xì)胞生長因子-6、成纖維細(xì)胞生長因子-7、FMS樣酪氨酸激酶3配體、 趨化因子CX3化1、趨化因子（C-C基序）配體6、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、粒細(xì)胞集落 刺激因子、趨化因子（C-C基序）配體1、Y-干擾素、膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1、膜島 素樣生長因子結(jié)合蛋白-2、膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白-4、膜島素樣生長因子1、白細(xì)胞 介素-10、白細(xì)胞介素-13、白細(xì)胞介素-15、白細(xì)胞介素-16、白細(xì)胞介素-1 a、白細(xì)胞介 素-1目、IL-1受體枯抗劑、白細(xì)胞介素-2、白細(xì)胞介素-3、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-5、 白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-7、瘦素、LIGHT蛋白、單核細(xì)胞趨化蛋白1、單核細(xì)胞趨化蛋白 2、單核細(xì)胞趨化蛋白3、單核細(xì)胞趨化蛋白4、巨瞻細(xì)胞集落刺激因子、巨瞻細(xì)胞衍生的細(xì) 胞因子、單核因子誘導(dǎo)干擾素Y、巨瞻細(xì)胞炎性蛋白-1 5、巨瞻細(xì)胞炎性蛋白-3 a、中性粒 細(xì)胞激活蛋白-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子3、巨瞻細(xì)胞炎性蛋白-4、血小板衍生生長因子-BB、趨化因 子（C-C基序）配體5、干細(xì)胞因子、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、趨化因子（C-C基序）配體17、轉(zhuǎn) 化生長因子目1、轉(zhuǎn)化生長因子目3、腫瘤壞死因子-a、腫瘤壞死因子-目。
[00巧]在本發(fā)明就的一個(gè)實(shí)施例中，采用Bio-Rad公司或化rkin Elmer公司生產(chǎn)的全自 動(dòng)點(diǎn)樣儀器，而用于固定特異性抗體的底膜則采用