心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒及其制備方法；所述試劑盒包括試劑R1、試劑R2及標(biāo)準(zhǔn)品組成；所述試劑R1的組成為：溶劑是pH7.0?7.6的緩沖液、溶質(zhì)為表面活性劑、螯合劑、加速劑、防腐劑和純化水；所述試劑R2為抗人H-FABP抗體膠乳試劑；所述標(biāo)準(zhǔn)品為所述標(biāo)準(zhǔn)品為含有定量H-FABP的重組蛋白。本發(fā)明解決了目前市場(chǎng)上乳膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)試劑盒抗干擾能力差、特異性低、試劑穩(wěn)定性不好和檢測(cè)線性范圍窄等問(wèn)題。另外，本發(fā)明試劑盒試劑在檢測(cè)過(guò)程中具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、靈敏度高等特性，且能夠在全自動(dòng)生化分析儀或者特種蛋白儀以及分光光度計(jì)上使用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒及其制備方法，具體涉及一種 利用乳膠增強(qiáng)免疫比濁法技術(shù)提高心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)靈敏度的檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 急性心肌梗死（acute myocardial infarction,AMI)是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病 之一，近年來(lái)，其發(fā)病率及死亡率逐年上升，且有越來(lái)越年輕化的趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在中國(guó)每年 超過(guò)100萬(wàn)人死于AMI。現(xiàn)代治療學(xué)認(rèn)為，AMI發(fā)病后能迅速得到確診并進(jìn)行再灌注治療， 對(duì)于降低死亡率及改善預(yù)后十分重要。
[0003] 在完全排除急性心肌梗死（AMI)之前，住院患者通常至少要接受6?12小時(shí)的檢 測(cè)，才能考慮出院。因此，許多醫(yī)院承認(rèn)大多數(shù)此類(lèi)患者（74%?88%)，需要進(jìn)一步的檢 測(cè)，這就給臨床檢測(cè)AMI提出了非常巨大的市場(chǎng)和挑戰(zhàn)。迄今為止，臨床應(yīng)用的檢測(cè)指標(biāo)如 肌鈣蛋白I (cTnl)、心肌型肌酸激酶同工酶（CKMB)，在AMI發(fā)病后的早期（2h?4h)陽(yáng)性 率不高；肌紅蛋白（MB)雖出現(xiàn)較早，但特異性較差。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（heart fatty acid binding protein, H-FABP)是近些年推出的心肌標(biāo)志物，受到業(yè)界重視。
[0004] 脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP)是一種小分子蛋白質(zhì)（相對(duì)分子量為15000)，存在于 機(jī)體多種組織細(xì)胞的胞漿中，主要擔(dān)負(fù)著結(jié)合脂肪酸并調(diào)節(jié)其細(xì)胞內(nèi)代謝的功能。按照 組織特異性不同可以分為心臟型（Η-FABP)、小腸型（Ι-FABP)、肝臟型（L-FABP)、脂肪細(xì) 胞型（A-FABP)、腦細(xì)胞型（B-FABP)、腎臟型（K-FABP)、骨骼肌型（S-FABP)、牛皮癬相關(guān)性 (PA-FABP)、表皮型（E-FABP)9種亞型。它們分布于哺乳動(dòng)物的心臟、小腸、肝臟、脂肪組織、 腦、表皮等組織細(xì)胞中，在蛋白質(zhì)序列上顯示有很大的同源性。9種FABPs都有不同的表達(dá) 模式，這些蛋白有多種功能，包括促進(jìn)細(xì)胞攝取和運(yùn)輸脂肪酸，尋找參與特殊新陳代謝途徑 的脂肪酸，參與基因表達(dá)和細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)。
[0005] Η-FABP在心肌損傷后6?8小時(shí)左右達(dá)到濃度峰值，然后在24?30小時(shí)左右恢 復(fù)至正常水平。如此迅速恢復(fù)至正常水平得益于高腎清除率，這意味著Η-FABP不僅能夠用 作AMI早期標(biāo)志物，還是理想的心肌梗死復(fù)發(fā)診斷標(biāo)志物。
[0006] 早期診斷AMI及評(píng)估心肌梗死面積大小新的心肌標(biāo)記物必須在病人胸痛開(kāi)始1? 2h內(nèi)有較高的敏感度，也即在心肌發(fā)生不可逆損傷前。有研究表明，在急性心肌梗死患者 發(fā)病極早期，胞漿中的Η-FABP會(huì)迅速釋放到血漿中，能夠直接提示心臟患者的發(fā)病情況， 故可作為早期診斷心肌梗死程度的有效標(biāo)志物，且因?yàn)槠錅?zhǔn)確性、敏感性和特異性的原因， 目前還沒(méi)有更優(yōu)越的AMI標(biāo)志物以取代它的位置。Η-FABP與其他心肌標(biāo)志物在急性心肌梗 死中的價(jià)值比較很有意義。Η-FABP能及早發(fā)現(xiàn)超急期AMI患者。對(duì)于鑒別出需急診住院、 冠狀動(dòng)脈造影、介入治療的患者有很高的敏感性，尤其那些胸痛發(fā)病6h內(nèi)的患者的早期診 斷和預(yù)后判斷有很大幫助。Η-FABP如與傳統(tǒng)的標(biāo)記物cTnl、CK-MB結(jié)合起來(lái)一起檢測(cè)，早 期檢測(cè)H-FABP，恢復(fù)期檢測(cè)cTnl，有利于篩選出有心臟疾患高風(fēng)險(xiǎn)的患者，不僅方便采取 積極的治療策略，還可節(jié)約患者開(kāi)支和實(shí)驗(yàn)室資源，Η-FABP與cTnl合理互補(bǔ)監(jiān)測(cè)也許是將 來(lái)一種臨床診治缺血性心臟病的理想選擇。
[0007] 本方法是膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法：將抗體結(jié)合到膠乳顆粒上，病人血清（或標(biāo) 準(zhǔn)品）中的被測(cè)抗原在緩沖液中與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合，使膠乳顆粒彼此交聯(lián)，致使 溶液濁度增加。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液濁度與被測(cè)抗原的量呈線性相關(guān)。乳膠增強(qiáng)免疫比 濁法是測(cè)定血清中H-FABP濃度的常用方法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、線性范圍寬、無(wú)污染、應(yīng) 用范圍廣等顯著的特點(diǎn)。因此，膠乳免疫比濁法有著極大的研究?jī)r(jià)值，但是目前市場(chǎng)上的乳 膠增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)試劑盒抗干擾能力差、特異性低、試劑穩(wěn)定性不好或檢測(cè)線性范圍 窄等問(wèn)題，有待改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試 劑盒及其制備方法，建立一種通過(guò)抗人的心型脂肪酸結(jié)合蛋白抗體（或者單抗）與膠乳顆 粒偶聯(lián)、采用膠乳增強(qiáng)比濁法來(lái)測(cè)定人體血清中H-FABP的含量的方法，運(yùn)用該方法的試劑 盒具有操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，靈敏度高，且能夠在全自動(dòng)生化分析儀或者特種蛋 白儀以及分光光度計(jì)上使用。
[0009] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0010] 第一方面，本發(fā)明提供一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，包括試劑R1、試劑 R2和標(biāo)準(zhǔn)品；
[0011] 所述試劑R1包括組分及含量如下：
[0012] 緩沖液 pH7.0?7.6 80?150mmol./L， 表面活ft劑 5?15ml/U
[0013] 蝥+fbW 30 ?80mmol/L, 加速劑 150 ?250mraol/L， 防腐劑 0. 5?2. 5%;
[0014] 所述試劑R2包括組分及含量如下：
[0015] 鼠抗人Η-ΡΛΒΡ膠乳顆粒 1?5%, 緩沖液 pll 6· 5?8. 5 30?80mM， 穩(wěn)定劑 0. 1?1 rag/m 1? 無(wú)機(jī) ft 100?20()mmol /1., 防腐劑 0. 5?2. 594;
[0016] 所述標(biāo)準(zhǔn)品包括6支不同濃度H-FABP重組蛋白、溶質(zhì)含量均相同的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑R1、試劑R2中的緩沖液包括M0PS0緩沖液、巴比妥緩沖液、DIPSO 緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、鹽酸溶液、甘氨酸緩沖液中的一種或幾種。
[0018] 優(yōu)選地，所述試劑R1、試劑R2中的防腐劑包括疊氮化鈉、硫柳汞、Proclin-300、苯 酚中的一種或幾種。
[0019] 優(yōu)選地，所述試劑R1中的表面活性劑包括非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性 齊IJ、陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑中的一種或幾種；
[0020] 優(yōu)選地，所述表面活性劑為非離子表面活性劑；
[0021] 優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑為T(mén)ween20。
[0022] 優(yōu)選地，所述試劑R1中的螯合劑包括乙二胺四乙酸二鈉、氨基三乙酸、二亞乙基 三胺五乙酸、二亞乙基三胺五乙酸鹽中的一種或幾種。
[0023] 優(yōu)選地，所述試劑R1中的加速劑包括葡聚糖4000?12000中的一種或幾種。
[0024] 優(yōu)選地，所述試劑R2中穩(wěn)定劑包括無(wú)關(guān)蛋白、氨基酸、表面活性劑、助懸劑中的一 種或幾種；所述無(wú)關(guān)蛋白包括牛血清白蛋白或明膠；所述表面活性劑包括T Ween20 ;所述助 懸劑包括乙二醇、丙三醇、麥芽糖中的一種或幾種。
[0025] 優(yōu)選地，所述試劑R2中無(wú)機(jī)鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、醋酸鈉、醋酸 鉀中的一種或幾種。
[0026] 優(yōu)選地，所述標(biāo)準(zhǔn)品中不同濃度H-FABP重組蛋白具體是指H-FABP重組蛋白的含 量分別為 〇ng/ml、7. 8ng/ml、15. 5ng/ml、31ng/ml、62ng/ml、124ng/ml ;所述溶質(zhì)及含量為 磷酸氫二鈉1. 5?3g/L、磷酸二氫鈉2. 5?5g/L、氯化鈉30?80mmol/L、乙二胺四乙酸二 鈉30?8Ctamol/L、牛血清白蛋白0. 5?1. 5%、鹿糖1?5%、疊氮化鈉0. 5?1. 5%。，百分 比和千分比表示質(zhì)量分?jǐn)?shù)；
[0027] 第二方面，本發(fā)明提供一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒的制備方法，所述 試劑R2的制備包括如下步驟 ：
[0028] 步驟1 :將抗人H-FABP抗體在pH值為4. 0?6. 0的溶液中進(jìn)行酸化；
[0029] 步驟2 :將步驟1所得抗人H-FABP抗體溶液用堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 4?8. 2,加入 粒徑為100?300nm的聚乙烯基芐基氯膠乳懸浮溶液，在37°C孵育2?4小時(shí)；
[0030] 步驟3 :將步驟2所得懸浮溶液用pH值為7. 0?8. 5的封閉液在37°C封閉5個(gè)小 時(shí)以上；所述封閉液的溶劑為50mmol/L MES緩沖液，溶質(zhì)及其在所述封閉液中的含量為牛 血清白蛋白〇· lmg/ml、氯化鈉150mM ;
[0031] 步驟4 :將步驟3所得懸浮溶液經(jīng)離心或過(guò)濾后，取沉淀用含有穩(wěn)定劑、無(wú)機(jī)鹽和 防腐劑的緩沖液洗滌分散即得；
[0032] 所述洗滌為高速冷凍離心機(jī)離心或者是用孔徑小于100nm的中空纖維管狀進(jìn)行 過(guò)濾。
[0033] 優(yōu)選地，所述步驟1中人H-FABP抗體包括鼠抗人H-FABP抗體、兔抗人H-FABP抗 體、羊抗人H-FABP抗體中的一種或多種；所述溶液包括甘氨酸緩沖液、鹽酸溶液、MES緩沖 液中的一種或多種。
[0034] 優(yōu)選地，所述步驟2中聚乙烯基芐基氯膠乳懸浮溶液中溶劑為pH7. 4?8. 2溶液 為M0PS0緩沖液、DIPSO緩沖液或PBS緩沖液中的一種或多種。
[0035] 優(yōu)選地，所述步驟4中穩(wěn)定劑包括無(wú)關(guān)蛋白、氨基酸、表面活性劑、助懸劑中的一 種或幾種；所述無(wú)關(guān)蛋白包括牛血清白蛋白或明膠；所述表面活性劑包括T Ween20 ;所述助 懸劑包括乙二醇、丙三醇、麥芽糖中的一種或幾種；所述無(wú)機(jī)鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸 鈉、硫酸鉀、醋酸鈉、醋酸鉀中的一種或幾種；
[0036] 所述防腐劑包括疊 氮化鈉、硫柳汞、Proclin-300、苯酚中的一種或幾種；
[0037] 所述緩沖液包括M0PS0緩沖液、巴比妥緩沖液、DIPSO緩沖液、Tris緩沖液、MES緩 沖液、鹽酸溶液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種。
[0038] 本發(fā)明的檢測(cè)原理是是膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法。將抗體結(jié)合到膠乳顆粒上，病 人血清（或標(biāo)準(zhǔn)品）中的被測(cè)抗原在緩沖液中與膠乳顆粒表面的抗體結(jié)合，使膠乳顆粒彼 此交聯(lián)，致使溶液濁度增加。在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)液濁度與被測(cè)抗原的量呈線性相關(guān)。
[0039] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0040] (1)本發(fā)明加入葡聚糖，加快抗原抗體的免疫反應(yīng)速度，明顯縮短檢測(cè)時(shí)間，與現(xiàn) 有其他方法學(xué)技術(shù)相比，檢測(cè)時(shí)間緊需10分鐘；
[0041] (2)本發(fā)明加入懸浮劑和表面活性劑，懸浮劑可以提高溶液的密度和粘度，使膠乳 顆粒能夠長(zhǎng)期懸浮在溶液中不會(huì)沉降而起到很好的穩(wěn)定作用；表面活性劑使膠乳粒子的表 面形成機(jī)械性或電性的保護(hù)膜，可以抑制膠乳顆粒的絮凝；根據(jù)膠乳顆粒的比重，通過(guò)適當(dāng) 助懸劑調(diào)節(jié)緩沖液比重和粘度，能夠使膠乳顆粒穩(wěn)定懸浮而不會(huì)沉降；聚乙烯基芐基氯膠 乳顆粒是一種核殼形式的膠乳顆粒，其膠乳核是甲苯乙烯聚合物，膠乳殼為乙烯基芐基氯 的聚合物，是一種疏水性膠乳。在殼的表面具有高密度的氯甲基基團(tuán)，這些活性表面功能基 團(tuán)能夠在溫和的水溶液中直接與抗體、抗原或其它配體的氨基基團(tuán)反應(yīng)，通過(guò)一步反應(yīng)產(chǎn) 生一種穩(wěn)定的共價(jià)化合物，明顯提高了試劑穩(wěn)定性；
[0042] (3)本發(fā)明檢測(cè)試劑盒，通過(guò)組分及含量的優(yōu)化，使得檢測(cè)線性范圍寬，可在 3. 00ng/ml?120. 00ng/ml線性范圍內(nèi)保持良好相關(guān)性，而市售試劑（如安徽拓特生物工程 有限公司劑盒）的檢測(cè)范圍只有5. 00?100ng/ml ;
[0043] (4)本發(fā)明檢測(cè)試劑盒在制備中，將抗體經(jīng)酸處理，使得更多可利用的H-FABP抗 原結(jié)合位點(diǎn)暴露，提高膠乳抗體的反應(yīng)活性，從而可以減少膠乳試劑制備中抗體的用量，降 低成本，同時(shí)也提高分析靈敏度。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0044] 通過(guò)閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0045] 圖1為顯示6種不同含量的H-FABP參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0046] 其中，每個(gè)點(diǎn)代表不同含量H-FABP的參考標(biāo)準(zhǔn)，X軸表示H-FABP的含量，Y軸表示 吸光度；
[0047] 圖2為采用日立全自動(dòng)生化分析儀對(duì)50份人血清（包含正常和異常標(biāo)本）按各自 參數(shù)同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，對(duì)測(cè)定值進(jìn)行相關(guān)分析，以本發(fā)明檢測(cè)試劑盒與試劑市售H-FABP(英 國(guó)朗道公司試劑盒）的乳膠增強(qiáng)免疫比濁法試劑進(jìn)行比較；
[0048] 其中X軸表示的是本發(fā)明試劑測(cè)定的病人血清結(jié)果，Y軸表示的是英國(guó)朗道公司 試劑盒測(cè)定的病人血清結(jié)果，相關(guān)系數(shù)R 2 = 0. 9947,回歸方程為y = 0. 9854X+0. 3527 ;
[0049] 圖3為對(duì)本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的線性范圍進(jìn)行驗(yàn)證；
[0050] 其中，X軸表示的是本發(fā)明檢測(cè)試劑盒試劑實(shí)際測(cè)試結(jié)果，Y軸表示的是稀釋理論 濃度，相關(guān)系數(shù)為R 2 = 〇. 9966,回歸方程為y = 1. 0002X+1. 5965。

【具體實(shí)施方式】
[0051] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù) 人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明 的保護(hù)范圍。
[0052] 實(shí)施例1
[0053] 本實(shí)施例涉及一種H-FABP檢測(cè)試劑盒的配制，包括組分及含量如下：
[0054] 試劑 R1 :
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括試劑R1、試劑R2和標(biāo)準(zhǔn) 品； 所述試劑R1包括組分及含量如下： 緩沖液 pH7, 0?7. 6 80 ?150麵〇 I /1,， 表_'活性劑 5?15ml/U 整 ft 劑 3 0 ?8 Oramo I / 丨.， 加速劑 150 ?2 5 Oramo 1 /L， 防腐劑 0, 5?2. 5%〇; 所述試劑R2包括組分及含量如下： 抗人H-FABP膠乳顆粒 〗?51, 緩沖液 pH 6· 5?8. 5 30?80minol/L, 穩(wěn)定劑 0. 1?Img/nil， 無(wú)機(jī) --? 100 ?20 Ommo 1 /L? P方腐劑 0. 5?2. 5%n 所述標(biāo)準(zhǔn)品包括6支不同濃度Η-FABP重組蛋白、溶質(zhì)及含量均相同的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑 R1、試劑R2中的緩沖液包括M0PS0緩沖液、巴比妥緩沖液、DIPS0緩沖液、Tris緩沖液、MES 緩沖液、鹽酸溶液、甘氨酸緩沖液中的一種或多種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑 R1、試劑R2中的防腐劑包括疊氮化鈉、硫柳汞、Proclin-300、苯酚中的一種或幾種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于，試劑R1中， 所述表面活性劑為非離子表面活性劑、陽(yáng)離子表面活性劑、陰離子表面活性劑或兩性表面 活性劑； 所述螯合劑包括乙二胺四乙酸二鈉、氨基三乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、二亞乙基三胺 五乙酸鹽中的一種或幾種； 所述加速劑包括葡聚糖4000?12000中的一種或幾種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑 R2中穩(wěn)定劑包括無(wú)關(guān)蛋白、氨基酸、表面活性劑、助懸劑中的一種或幾種；所述無(wú)關(guān)蛋白包 括牛血清白蛋白或明膠；所述表面活性劑包括T Ween20 ;所述助懸劑包括乙二醇、丙三醇、 麥芽糖中的一種或幾種； 所述無(wú)機(jī)鹽包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、醋酸鈉、醋酸鉀中的一種或幾種。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn) 品中不同濃度Η-FABP重組蛋白具體是指Η-FABP重組蛋白的含量分別為0ng/ml、7. 8ng/ml、 15. 5ng/ml、31ng/ml、62ng/ml、124ng/ml ;所述溶質(zhì)及含量為磷酸氫二鈉1· 5?3g/L、磷酸 二氫鈉2. 5?5g/L、氯化鈉30?80mmol/L、乙二胺四乙酸二鈉30?80mmol/L、牛血清白蛋 白0· 5?1. 5%、鹿糖1?5%、疊氮化鈉0· 5?1. 5%〇。
7. -種根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒的制備 方法，其特征在于，所述試劑R2的制備包括如下步驟 ： 步驟1 :將抗人H-FABP抗體在pH值為4. 0?6. 0的溶液中進(jìn)行酸化； 步驟2 :將步驟1所得抗人H-FABP抗體溶液用堿溶液調(diào)節(jié)pH至7. 4?8. 2,加入粒徑 為100?300nm的聚乙烯基芐基氯膠乳懸浮溶液，在37°C孵育2?4小時(shí)； 步驟3 :將步驟2所得懸浮溶液用pH為7. 0?8. 5的封閉液在37°C封閉5個(gè)小時(shí)以 上；所述封閉液的溶劑為50mmol/L MES緩沖液，溶質(zhì)及其在所述封閉液中的含量為牛血清 白蛋白0· lmg/ml、氯化鈉150mM ; 步驟4 :將步驟3所得懸浮溶液經(jīng)離心或過(guò)濾后，取沉淀用含有穩(wěn)定劑、無(wú)機(jī)鹽、防腐劑 的緩沖液洗滌分散即得；所述洗滌為高速冷凍離心機(jī)離心或者是用孔徑小于l〇〇nm的中空 纖維管狀進(jìn)行過(guò)濾。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟1中抗人H-FABP抗體包括鼠抗人H-FABP抗體、兔抗人H-FABP抗體、羊抗人 H-FABP抗體中的一種或多種；所述溶液包括甘氨酸緩沖液、鹽酸溶液、MES緩沖液中的一種 或多種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟2中聚乙烯基芐基氯膠乳懸浮溶液中溶劑為pH7. 4?8. 2的M0PS0緩沖液、 DIPSO緩沖液或PBS緩沖液中的一種或多種。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在 于，所述步驟4中穩(wěn)定劑包括無(wú)關(guān)蛋白、氨基酸、表面活性劑、助懸劑中的一種或幾種；所述 防腐劑包括疊氮化鈉、硫柳汞、Proclin-300、苯酚中的一種或幾種；所述緩沖液包括M0PS0 緩沖液、巴比妥緩沖液、DIPSO緩沖液、Tris緩沖液、MES緩沖液、鹽酸溶液、甘氨酸緩沖液中 的一種或多種。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104215772SQ201410401484
【公開(kāi)日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月14日
【發(fā)明者】李偉奇, 趙小鳳, 房君江, 張秀文, 林清玉 申請(qǐng)人:上海睿康生物科技有限公司