心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條的制作方法
【專利摘要】一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條，所述試紙條包括底板和在底板上依次搭接粘貼的樣品墊、結(jié)合墊、包被墊及吸水墊，所述結(jié)合墊上同時包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的抗心型脂肪酸結(jié)合蛋白的第一抗體，所述包被墊上包被有相間隔的檢測帶和質(zhì)控帶，所述檢測帶固定有抗心型脂肪酸結(jié)合蛋白的第二抗體，所述質(zhì)控帶固定有抗鼠IgG的抗體。本實(shí)用新型的試紙條兼顧了低值靈敏度和檢測的線性范圍，且可以實(shí)現(xiàn)快速、單人份定量檢測。
【專利說明】心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型涉及臨床免疫檢測裝置領(lǐng)域，具體涉及一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條。

【背景技術(shù)】
[0002]心型脂肪酸結(jié)合蛋白(heartfatty acid binding protein，h-FABP)是一種對心肌損傷的早期診斷極其有用的生物標(biāo)志物。心肌細(xì)胞損傷后I小時之內(nèi)就能夠快速釋放至血液中。h-FABP比肌紅蛋白(Myo)更加具有心臟特異性，心臟中h_FABP濃度比骨骼肌中高2-10倍，但Myo在心臟中的濃度卻比骨骼細(xì)胞中低2倍。相對于其他的急性冠脈綜合癥診斷標(biāo)志物(如CK-MB、cTn1、cTnT及Myo等)，h_FABP更具有時間優(yōu)勢，也有著更好的ROC曲線下分析，體現(xiàn)出更具優(yōu)勢的診斷靈敏度和特異性。
[0003]目前臨床常用的檢測h-FABP的方法包括:膠乳增強(qiáng)免疫比濁法、膠體金免疫層析法、熒光免疫層析法等。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法在全自動生化儀中檢測，可以實(shí)現(xiàn)自動化、并且快速的進(jìn)行單人份檢測，但無法實(shí)現(xiàn)床旁診斷(POCT)。膠體金免疫層析法操作簡單，但只能實(shí)現(xiàn)半定量。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0004]摶術(shù)問題
[0005]熒光免疫層析法既可以實(shí)現(xiàn)快速檢測，又能夠進(jìn)行精確定量，為臨床應(yīng)用帶來了極大的便利。因此，需要一種基于熒光免疫層析法的心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條。
[0006]技術(shù)方案
[0007]一方面，本實(shí)用新型提供了一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條，其特征在于，所述試紙條包括:
[0008]i)底板，和
[0009]ii)在所述底板上依次搭接粘貼以下組件:
[0010]i1-Ι)用于接收樣品的樣品墊，
[0011]i1-2)同時包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的抗h-FABP的第一抗體的結(jié)合墊，
[0012]i1-3)包被有相間隔的檢測帶和質(zhì)控帶的包被墊，其中所述檢測帶固定有抗h-FABP的第二抗體，所述質(zhì)控帶固定有抗鼠IgG的抗體，和
[0013]i1-4)吸水墊。
[0014]在一個實(shí)施方式中，所述抗心型脂肪酸結(jié)合蛋白的第一抗體和第二抗體識別心型脂肪酸結(jié)合蛋白的不同表位。
[0015]在一個實(shí)施方式中，所述焚光微球上具有Cy3焚光素或Cy5焚光素。
[0016]在一個實(shí)施方式中，所述兩種不同粒徑大小的熒光微球的粒徑大小分別為10nm和 300nm。
[0017]在一個實(shí)施方式中，所述檢測帶和所述質(zhì)控帶之間的間隔在0.3cm-0.5cm之間。
[0018]在一個實(shí)施方式中，所述試紙條的長度在8cm至1cm之間。
[0019]在一個實(shí)施方式中，所述試紙條的寬度在0.2cm至0.5cm之間。
[0020]有益效果
[0021]在本實(shí)用新型的試紙條中，獨(dú)立的樣品墊和結(jié)合墊的設(shè)計可以有效避免樣品中雜質(zhì)對檢測靈敏度的影響，有利于提高檢測靈敏度。而且，兩種不同粒徑熒光微球的設(shè)計能夠同時滿足檢測中對高靈敏度和寬檢測線性范圍的要求。此外，試劑條檢測更為方便和廉價，有利于臨床應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1本實(shí)用新型的試紙條的側(cè)視示意圖。
[0023]圖2本實(shí)用新型的試紙條的俯視示意圖。
[0024]附圖標(biāo)記:1_樣品墊、2-結(jié)合墊、3-包被墊、4-吸水墊、5-底板、6-檢測帶、7-質(zhì)控帶。

【具體實(shí)施方式】
[0025]下文中將參照附圖來更詳細(xì)地描述示例性實(shí)施方式。所述附圖用于圖示說明本實(shí)用新型，而非對其進(jìn)行限制。
[0026]圖1是本實(shí)用新型的試紙條的側(cè)視示意圖。
[0027]如圖1所示，本實(shí)用新型的試紙條包括底板5和在底板5上依次搭接粘貼的樣品墊1、結(jié)合墊2、包被墊3和吸水墊4。
[0028]樣品墊I與結(jié)合墊2搭接且用于接收樣品。本實(shí)用新型的試紙條所適合檢測的樣品包括但不限于血清、血漿、尿液。心型脂肪酸結(jié)合蛋白是一種對心肌損傷的早期診斷極其有用的生物標(biāo)志物。心肌缺血性損傷出現(xiàn)后，心型脂肪酸結(jié)合蛋白可以早在胸痛發(fā)作后諸如最早1-3小時在血液中被發(fā)現(xiàn)。樣品墊I可以起到樣品過濾的作用，由此可以提高檢測的靈敏度。例如，當(dāng)待檢測樣品為血漿、血清時，接收層可以過濾樣品中顆粒性不溶物，使得樣品中所含的心型脂肪酸結(jié)合蛋白能夠更準(zhǔn)確地被檢測。樣品墊I的材質(zhì)為玻璃纖維素膜或者聚酯膜。
[0029]結(jié)合墊2位于樣品墊I和包被墊3之間，且分別與樣品墊I和包被墊3搭接。結(jié)合墊2用于布置與待測樣品中特定蛋白反應(yīng)的抗體。本實(shí)用新型的試紙條的結(jié)合墊2上布置有特異性結(jié)合樣品中h-FABP的抗h-FABP的抗體，且此抗體由兩種不同粒徑大小的熒光微球分別標(biāo)記。傳統(tǒng)的熒光免疫層析法所采用的單個熒光微球抗體存在一定的缺陷。在本實(shí)用新型的試紙條中，小粒徑的熒光微球標(biāo)記的抗體使得檢測的線性范圍可覆蓋高值區(qū)域。大粒徑的熒光微球標(biāo)記的抗體有利于低值的檢測以達(dá)到靈敏度的要求。兩種粒徑大小的熒光微球的使用使得本實(shí)用新型的試紙條可同時實(shí)現(xiàn)高靈敏度和寬檢測線性范圍的要求。在一個實(shí)施方式中，所述兩種不同粒徑大小的焚光微球的粒徑大小分別為10nm和300nm。在一個實(shí)施方式中，所述熒光微球上具有Cy3熒光素或Cy5熒光素。
[0030]樣品墊2的材質(zhì)可與樣品墊I相同或不同，其優(yōu)選玻璃纖維素膜。
[0031]包被墊3位于結(jié)合墊2和吸水墊4之間，且分別與結(jié)合墊2和吸水墊4搭接。包被墊3的材質(zhì)優(yōu)選為硝酸纖維素膜。包被墊3用于布置檢測帶和質(zhì)控帶(參見圖2)。
[0032]檢測帶布置有另一種抗h-FABP的抗體。與結(jié)合墊2上布置的抗體相比，檢測帶上布置的抗體特異性結(jié)合不同的h-FABP的抗原表位。由此，通過在結(jié)合墊2和包被墊3上分別布置特異性結(jié)合h-FABP不同抗原表位的兩種抗體，從而實(shí)現(xiàn)用“免疫夾心法”對h-FABP進(jìn)行定量測定，由此進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度。
[0033]質(zhì)控帶布置有抗鼠IgG的抗體，其用于確定反應(yīng)體系是否成立。
[0034]吸水墊4通過毛細(xì)作用提供樣品從樣品墊I至結(jié)合墊2至包被墊3迀移的動力。吸水墊4可由選自由諸如棉絨、玻纖等材料制成，優(yōu)選由棉絨材料制成。
[0035]樣品墊1、結(jié)合墊2、包被墊3和吸水墊4整體依次搭接粘貼被布置于底板5上。
[0036]圖2是本實(shí)用新型的試紙條的俯視示意圖。圖2中與圖1相同的部分不再贅述。
[0037]如圖2所示，包被墊3布置有檢測帶6和質(zhì)控帶7。檢測帶6和質(zhì)控帶7之間的間隔可以在0.05cm至0.8cm之間。在一個實(shí)施方式中，檢測帶6和質(zhì)控帶7之間的間隔在0.2cm至0.5cm之間，更優(yōu)選在0.3cm至0.5cm之間。
[0038]本實(shí)用新型試紙條的整體長度在5cm至15cm之間，優(yōu)選8cm至1cm之間。本實(shí)用新型的試紙條的整體寬度在0.2cm至0.8cm之間，優(yōu)選在0.2cm至0.5cm之間，優(yōu)選在
0.2cm至0.3cm之間，最優(yōu)選為0.3cm。本實(shí)用新型的試紙條在提供靈敏度和檢測線性范圍的同時，通過降低試紙條的長度和/或?qū)挾瓤山档涂贵w的用量，大大節(jié)約了生產(chǎn)成本。
[0039]本實(shí)用新型所提供的應(yīng)用兩種不同粒徑熒光微球定量檢測h-FABP的熒光免疫層析試紙條兼顧了低值靈敏度和檢測的線性范圍，且可以實(shí)現(xiàn)快速、單人份定量檢測，加之體積小、易于攜帶和保存，為臨床使用提供了極大便利。加之其制備方法更加簡單，可以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)，有利于大規(guī)模推廣應(yīng)用，具備廣闊的市場前景。
[0040]實(shí)施例
[0041]下述實(shí)施例中，所述h-FABP第一抗體、h-FABP第二抗體、抗鼠IgG抗體、Cy3熒光素標(biāo)記的熒光微球、Cy5熒光素標(biāo)記的熒光微球、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、海藻糖、玻璃纖維素膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、高強(qiáng)度吸水紙均為市售產(chǎn)品。
[0042]所述應(yīng)用兩種不同粒徑熒光微球檢測h-FABP的熒光免疫層析試紙條的制備方法為:
[0043]I)樣品墊的制備
[0044]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入樣品墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)中浸泡處理3_5小時后，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干3_5小時。
[0045]2)結(jié)合墊的制備
[0046]A、結(jié)合墊的預(yù)處理
[0047]將玻璃纖維素膜或者聚酯膜放入結(jié)合墊處理液(含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.1M，ρΗ8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液或者含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)中浸泡處理3_5小時后，于35_39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干3_5小時。
[0048]B、標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球的制備
[0049]將h-FABP第一抗體以0.1M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液4°C透析過夜，調(diào)整濃度為 2mg/ml-5mg/ml。
[0050]使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌小粒徑焚光微球(選自Cy3焚光素標(biāo)記的焚光微球、Cy5焚光素標(biāo)記的焚光微球中的任意一種)，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過的第一抗體，使第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 8至1: 60，室溫反應(yīng)2小時后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0051]使用0.05M，pH4.5-5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液洗滌大粒徑焚光微球(選自Cy3焚光素標(biāo)記的焚光微球、Cy5焚光素標(biāo)記的焚光微球中的任意一種)，加入碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)使二者終濃度均為15-60mmol，室溫反應(yīng)20-30分鐘，充分洗滌熒光微球，用0.05M，pH8.0-8.6的硼酸-硼砂緩沖液復(fù)溶后加入透析過的第一抗體，使第一抗體與熒光微球的質(zhì)量比為1: 20至1: 80，室溫反應(yīng)2小時后，加入含有10% BSA的0.02M，pH7.2-7.6的磷酸鹽緩沖液室溫封閉30分鐘，充分洗滌熒光微球，用含有I % BSA和0.1 % Tween-20的0.05M，pH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液的保存液復(fù)溶至原體積。
[0052]將上述標(biāo)記第一抗體的兩種不同粒徑的熒光微球按1: 10到10: I的比例進(jìn)行混勻，即制備出標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球。
[0053]C、結(jié)合墊的制備
[0054]將步驟B制備獲得的標(biāo)記抗體的兩種不同粒徑熒光微球混合物使用定量噴膜儀以2 μ l/cm-8 μ 1/cm均勻噴涂于上述步驟A中預(yù)處理過的玻璃纖維素膜或者聚酯膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時，加入干燥劑封存?zhèn)溆谩?br> [0055]3)包被墊的制備
[0056]A、檢測帶的制備:將 h-FABP 第二抗體以 0.01-0.02M,pH7.4-8.2 的 Tris-HCl 緩沖液4°C透析過夜，使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02Μ，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將透析后的h-FABP第二抗體稀釋到0.2mg/ml-4mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以
1.2 μ 1/cm均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2_4小時。
[0057]B、質(zhì)控帶的制備:使用包被液(含有0.1-10%海藻糖的0.01-0.02M，ρΗ7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將抗小鼠IgG稀釋到0.5mg/ml-3mg/ml的濃度，使用定量噴膜儀以0.8 μ 1/cm均勻噴涂于硝酸纖維素膜上，于35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2_4小時。
[0058]C、包被墊的制備:用封閉液(含有1-10% BSA和1-10%海藻糖的0.01-0.02M，PH7.4-8.2的Tris-HCl緩沖液)將含有檢測帶和質(zhì)控帶的硝酸纖維素膜封閉1_2小時，取出后置35-39°C鼓風(fēng)干燥箱中烘干2-4小時，封袋備用。
[0059]4)試紙條及試劑卡的組裝
[0060]在濕度小于30%，溫度20_30°C條件下進(jìn)行試紙條及試劑卡的組裝。底板選用PVC材料，在底板同一面的方向順次連接且相鄰部位部分重疊的樣品墊、結(jié)合墊、包被墊及吸水墊。在包被墊粘覆底板時，檢測帶的位置靠近結(jié)合墊，質(zhì)控帶的位置靠近吸水墊。吸水墊為高強(qiáng)度吸水紙。組裝好后裁剪成試紙條，并組裝入試劑卡中。
[0061]5)校準(zhǔn)品及待檢樣品的測定
[0062]將100 μ I的標(biāo)準(zhǔn)品或者待檢樣品加入到試劑卡的加樣孔，進(jìn)行免疫層析反應(yīng)，10-15分鐘后將試劑卡置于專門的熒光檢測儀中，通過讀取熒光信號的大小進(jìn)行定量測定。
[0063]以上實(shí)施例僅僅是為了清楚地說明所做的舉例，并非對實(shí)施方式的限定。
【權(quán)利要求】
1.一種心型脂肪酸結(jié)合蛋白定量檢測試紙條，其特征在于，所述試紙條包括: i)底板，和 ?)在所述底板上依次搭接粘貼以下組件: ?-1)用于接收樣品的樣品墊， i1-2)同時包被有兩種不同粒徑熒光微球標(biāo)記的抗心型脂肪酸結(jié)合蛋白的第一抗體的結(jié)合墊， ?-3)包被有相間隔的檢測帶和質(zhì)控帶的包被墊，其中所述檢測帶固定有抗心型脂肪酸結(jié)合蛋白的第二抗體，所述質(zhì)控帶固定有抗鼠IgG的抗體，和i1-4)吸水墊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述試紙條，其特征在于，所述抗心型脂肪酸結(jié)合蛋白的第一抗體和第二抗體識別心型脂肪酸結(jié)合蛋白的不同表位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的所述試紙條，其特征在于，所述熒光微球上具有Cy3熒光素或Cy5熒光素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的所述試紙條，其特征在于，所述兩種不同粒徑大小的熒光微球的粒徑大小分別為10nm和300nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的所述試紙條，其特征在于，所述檢測帶和所述質(zhì)控帶之間的間隔在 0.3cm_0.5cm 之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的所述試紙條，其特征在于，所述試紙條的長度在8cm至1cm之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的所述試紙條，其特征在于，所述試紙條的寬度在0.2cm至0.5cm之間。
【文檔編號】G01N33/68GK204228721SQ201420674088
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月13日
【發(fā)明者】程海, 王義娜, 李鼎鋒, 聶聰, 祁雙, 戈軍, 劉勇 申請人:江蘇達(dá)駿生物科技有限公司