本發(fā)明涉及三種環(huán)狀的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3及其抗菌應(yīng)用，具體地說(shuō)是三種合成的衍生自脊尾白蝦抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀多肽及其抗菌應(yīng)用。

背景技術(shù)：

對(duì)蝦的養(yǎng)殖在我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位，近些年來(lái)，對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中的病害問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了其養(yǎng)殖生產(chǎn)的健康發(fā)展，抗生素的濫用與環(huán)境的惡化使海水養(yǎng)殖動(dòng)物的病害難以從根本上得到控制。

抗菌肽(蛋白)被認(rèn)為是魚(yú)、蝦、貝等防御細(xì)菌、病毒等外源病原感染的重要效應(yīng)分子，在動(dòng)物的先天免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前從甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的抗菌肽種類(lèi)繁多，抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)就是其中一種重要的抗菌肽。1982年，Tanaka等首次從中國(guó)鱟(Tachypleus tridentatus)和北美鱟(Limulus polyphemus)的血細(xì)胞中分離得到ALF，并發(fā)現(xiàn)其能抑制LPS介導(dǎo)的凝血反應(yīng)的激活。1985年，Morita等發(fā)現(xiàn)ALF還具有很強(qiáng)的抗革蘭氏陰性菌活性。之后，人們相繼在斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)、日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicus)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)、桃紅對(duì)蝦(Farfantepenaeus duorarum)等多種甲殼動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)ALF基因的存在，并證實(shí)ALF的重組蛋白具有抑制革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)的活性。另外，研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)預(yù)先與重組表達(dá)的ALF蛋白一起孵育后再注射入蝦體中，能抑制注入蝦體中WSSV的復(fù)制。

與傳統(tǒng)抗生素的作用機(jī)理不同，ALF直接中和細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖，溶解細(xì)菌，因此不易產(chǎn)生細(xì)菌的耐藥性。ALF對(duì)病毒的作用機(jī)理目前仍不清楚。隨著抗生素的應(yīng)用，許多病原菌對(duì)現(xiàn)有抗生素逐步產(chǎn)生耐藥性，而新型抗生素的發(fā)現(xiàn)又極其困難，因此，ALF的研究為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物開(kāi)辟了新的思路。

研究發(fā)現(xiàn)，ALF氨基酸序列中的兩個(gè)保守半胱氨酸之間形成二硫鍵，兩個(gè)半胱氨酸之間的氨基酸共同形成一段陰離子多肽，具有與LPS結(jié)合的能力，這段保守的結(jié)構(gòu)域被命名為L(zhǎng)PS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是ALF降解革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖的功能域。2011年，Sachin Sharma等研究了根據(jù)鋸緣青蟹(Scylla serrata)ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域合成的具24個(gè)氨基酸殘基的多肽在抗菌免疫過(guò)程中的作用，發(fā)現(xiàn)合成多肽SsALF24具有結(jié)合LPS的活性并且對(duì)大腸桿菌都具有明顯的抑制作用，其最小抑制濃度為16.16-32.32uM(Sharma S，Yedery RD，Patgaonkar MS，Selvaakumar C，Reddy KV.Antibacterial activity of a synthetic peptide that mimics the LPS binding domain of Indian mud crab，Scylla serrata anti-lipopolysaccharide factor(SsALF)also involved in the modulation of vaginal immune functions through NF-kB signaling.Microbial pathogenesis 2011；50：179-191.)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)明對(duì)蝦中ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有不同的抗菌抗病毒作用，通過(guò)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦ALF的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域改造獲得的LBDv多肽分子表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌抗病毒作用(Yang H，Li SH，Li FH，Xiang JH.Structure and bioactivity of a modified peptide derived from the LPS-binding domain of an anti-lipopolysaccharide factor(alf)of shrimp.Mar.Drugs 2016，14，96；doi：10.3390/md14050096.)。在脊尾白蝦中也發(fā)現(xiàn)多種抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3，基于EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列信息，本發(fā)明利用化學(xué)合成的方法獲得了環(huán)狀多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，它們顯示出明顯的抗菌生物學(xué)活性，具有重要的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供三種環(huán)狀合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，它們具有明顯的抗菌活性。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

利用化學(xué)合成的方法獲得了環(huán)狀的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，分別具有SEQ ID No.1、2、3所示的氨基酸序列，其序列特征分別為：

SEQ ID No.1：Ac-Qc(CNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWC)P-NH₂；

SEQ ID No.2：Ac-Vc(CTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYC)P-NH₂；

SEQ ID No.3：Ac-Vc(CSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYC)P-NH₂。

所述的環(huán)狀的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3序列具有二硫鍵結(jié)構(gòu)。其結(jié)構(gòu)特征在于：合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3序列氨基端第二個(gè)半胱氨酸(C)和羧基端第二個(gè)半胱氨酸(C)之間具有二硫鍵結(jié)構(gòu)；多肽的氨基端C的氨基被乙?；?Ac-)，羧基端C的羧基被酰胺化(-NH₂)。

所述的環(huán)狀的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3衍生自脊尾白蝦抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域，EcALF1、EcALF2、EcALF3分別具有序列列表中SEQ ID No.4、5、6所示的氨基酸序列。

所述的環(huán)狀的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3具有明顯的抗菌活性。具體為：對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)或增殖具有明顯的抑制作用。

所述環(huán)狀的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3可作為抗菌的活性成份，可用于制備抗菌的藥物或制劑中。

本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明確定了三種衍生自脊尾白蝦抗脂多糖因子EcALF1、EcALF2、EcALF3的LPS結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗菌多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3及其結(jié)構(gòu)特征。

2、通過(guò)本發(fā)明可開(kāi)發(fā)有效的細(xì)菌類(lèi)疾病的防治藥物。

附圖說(shuō)明

圖1合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的空間結(jié)構(gòu)圖；

圖2中，(a)(b)(c)分別為合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的HPLC純度檢測(cè)圖；

圖3中，(a)(b)(c)分別為合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的MS質(zhì)譜鑒定圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

三種化學(xué)合成的具有明顯抗菌活性的脊尾白蝦環(huán)狀多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3，它們的序列及來(lái)源序列信息如下：

(1)SEQ ID No.1、2、3的信息

(a)序列特征

*長(zhǎng)度：24氨基酸

*類(lèi)型：氨基酸

*鏈型：?jiǎn)捂?/p>

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：環(huán)形，兩個(gè)半胱氨酸之間形成二硫鍵

*空間結(jié)構(gòu)：兩個(gè)半胱氨酸之間通過(guò)二硫鍵相連接，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有1)圖1所示空間結(jié)構(gòu)：多肽序列形成兩個(gè)相連的β折疊結(jié)構(gòu)。

(b)分子類(lèi)型：蛋白

序列描述：

SEQ ID No.1

Ac-Qc(CNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWC)P-NH₂

SEQ ID No.2

Ac-Vc(CTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYC)P-NH₂

SEQ ID No.3

Ac-Vc(CSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYC)P-NH₂

其中括號(hào)內(nèi)的氨基酸為成環(huán)的氨基酸，括號(hào)外左側(cè)的小寫(xiě)c表示括號(hào)內(nèi)的氨基酸為形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)氨基酸；Ac-表示氨基酸C的氨基被乙?；?；-NH₂表示氨基酸C的羧基被酰胺化。

(2)SEQ ID No.4的信息

(a)序列特征

*長(zhǎng)度：125氨基酸

*類(lèi)型：氨基酸

*鏈型：?jiǎn)捂?/p>

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線(xiàn)性

(b)分子類(lèi)型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.4

MKLSLLLGIVLVGVMTSSLFPTCEAQAWQAVAAAVAEKIAGLWVNDEMELLGHTCNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWCPGWTPIRGEAETRSRSGVVGKTTSDFVTKAFKSGLISEDDARAWLNSKK

(3)SEQ ID No.5的信息

(a)序列特征

*長(zhǎng)度：134氨基酸

*類(lèi)型：氨基酸

*鏈型：?jiǎn)捂?/p>

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線(xiàn)性

(b)分子類(lèi)型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.5

MRPSTCFFVLAGFILLSCSVFDKAEGQGLTDLLGGLSGDSILDAVEAELNGLWSTSDIEFLGHVCTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYCPIWTTIRGTSETTSRTNVVHLASADFVRNAVAAELITEEQGKEWLKYN

(2)SEQ ID No.6的信息

(a)序列特征

*長(zhǎng)度：134氨基酸

*類(lèi)型：氨基酸

*鏈型：?jiǎn)捂?/p>

*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)：線(xiàn)性

(b)分子類(lèi)型：蛋白

序列描述：SEQ ID No.6

MRPSTCFFVLAGFILLSCSVFDKAEGQGLTDLLGGLSGESLVDAVASQIVGLWGSGDIEFLDHVCSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYCPGWTPIRGTSETRSRTNVVNLATADFVRKAIGEGLITEEQAREWLRHQ

所述抗菌多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的合成、環(huán)化、純化、鑒定及生物活性分析：

通過(guò)人工化學(xué)合成途徑，利用固相合成方法獲得粗品多肽，經(jīng)固相環(huán)化、質(zhì)譜鑒定和液相色譜純化獲得含有二硫鍵的合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3。具體為：

1)多肽合成

采用9-芴甲氧羰基(Fmoc)合成策略，從C端向N端方向合成。用10mg Rink-Amide-Resin樹(shù)脂(AAPPTec，貨號(hào)RRZ001)作為載體，依靠載體本身的活性基團(tuán)與5mg被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的第一個(gè)氨基酸(Fmoc-Pro-NH₂)的羧基相連(詳細(xì)方法參考文獻(xiàn)：Panagiotis Stathopoulos，Serafim Papas.Vassilios Tsikaris.C-terminal N-alkylated peptide amides resulting from the linker decomposition of the Rink amide resin.A new cleavage mixture prevents their formation.Journal of Peptide Science 2006；12：227-232.)。

用N-甲基毗咯皖酣(NMP)沖洗樹(shù)脂除去多余保護(hù)氨基酸，向反應(yīng)器(固相合成器)中加入20％哌啶/NMP溶液(體積分?jǐn)?shù))脫除Fmoc基團(tuán)，反應(yīng)20min，排空反應(yīng)器，用5mL NMP振蕩沖洗樹(shù)脂，重復(fù)3次，脫除第一個(gè)氨基酸殘基的Fmoc保護(hù)；裸露出的活性氨基基團(tuán)與下一個(gè)被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的氨基酸(5mg)的羧基相連，形成第一個(gè)肽鍵(Pro-Cys)。此段的以上步驟循環(huán)進(jìn)行(不同之處在于：只是每次需采用對(duì)應(yīng)的被Fmoc進(jìn)行氨基保護(hù)的氨基酸)直至多肽序列Ac-Qc(CNYRVDPKIKRFQLYFKGRMWC)P-NH₂合成完畢，得約20mg線(xiàn)性多肽。通過(guò)相同方法合成多肽序列Ac-Vc(CTVDVKPTLRRFKLIFIGTMYC)P-NH₂和Ac-Vc(CSFQVKPKIKRWQLYFIGTMYC)P-NH₂，分別獲得約20mg線(xiàn)性多肽。

2)多肽環(huán)化

20mg線(xiàn)性多肽偶聯(lián)完最后一個(gè)氨基酸后，配置0.1mol/L的I₂溶液(I₂溶于體積比1∶1的甲醇∶DMF混合溶液中)，加入10mL至固相合成器中，氮?dú)獯捣鞣磻?yīng)，約6小時(shí)。

3)多肽純化和鑒定

用50mL切肽試劑三氟乙酸∶苯甲硫醚∶苯酚∶乙二硫醇∶雙蒸水(體積比82.5∶5∶5∶2.5∶5)將20mg環(huán)化后的多肽從載體樹(shù)脂上裂解下來(lái)，2小時(shí)后，加入4℃預(yù)冷的乙醚100ml使多肽沉淀，離心收集沉淀物，并用乙醚洗滌3遍，真空抽干，得到的多肽粗品經(jīng)反向液相色譜純化，純化后的多肽凍干后進(jìn)行HPLC純度檢測(cè)(圖2)和質(zhì)譜鑒定(圖3)。檢測(cè)HPLC色譜柱為250*4.6mm，Kromasil-C18-5μm；流動(dòng)相A：0.1％TFA/乙腈，流動(dòng)相B：0.1％TFA/H₂O；線(xiàn)性洗脫梯度：15％A-100％A；流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm；一次進(jìn)樣量為10μl。HPLC和MS檢測(cè)結(jié)果顯示，合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的純度分別為95.87％、95.42％、95.24％，分子量分別為3116.76、2840.54、2975.66，與預(yù)測(cè)分子量(分別為3116.75、2840.53、2975.66)基本一致。

4)抑菌試驗(yàn)

合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3分別用50mmol/LpH7.4的PBS溶解至濃度為640μmol/L的溶液，同時(shí)以50mmol/LpH7.4的PBS為陰性對(duì)照。采用最低抑菌濃度(MIC)方法檢測(cè)合成多肽對(duì)革蘭氏陰性菌包括哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus、美人魚(yú)發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae subsp.piscicida)和革蘭氏陽(yáng)性菌包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)等細(xì)菌的抑菌活性。即：將待測(cè)表皮葡萄球菌、藤黃微球菌分別在37℃，200r/min培養(yǎng)條件下于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至1×10⁸cells/mL，哈維氏弧菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌、溶藻弧菌分別在30℃，200r/min培養(yǎng)條件下于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至1×10⁸cells/mL；培養(yǎng)的細(xì)菌分別加入到48孔培養(yǎng)板中，用新鮮的LB或TSB培養(yǎng)基將待測(cè)菌液稀釋至終濃度1×10⁶cells/mL；向48孔培養(yǎng)板中分別加入梯度稀釋的多肽溶液至終體積為200μl，多肽H終濃度依次為64μmol/L、32μmol/L、16μmol/L、8μmol/L、4μmol/L、2μmol/L和1μmol/L；用PBS作為陰性對(duì)照，終濃度58μmol/L的氨芐青霉素(表皮葡萄球菌、藤黃微球菌)或88μmol/L的卡那霉素(哈維氏弧菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌、溶藻弧菌)分別作為陽(yáng)性對(duì)照；在37℃或28℃條件下培養(yǎng)3h后，分別加入300μl新鮮LB或TSB培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18h，測(cè)定每孔中細(xì)菌的OD600吸光值，計(jì)算細(xì)菌濃度。

結(jié)果表明，8-16μmol/L的合成多肽EcLBD1、4-8μmol/L的合成多肽EcLBD2和16-32μmol/L的合成多肽EcLBD3都能夠有效抑制哈維氏弧菌的生長(zhǎng)，32-64μmol/L的合成多肽EcLBD1能夠有效抑制美人魚(yú)發(fā)光桿菌的生長(zhǎng)，8-16μmol/L的合成多肽EcLBD2和2-4μmol/L的合成多肽EcLBD3都能夠有效抑制溶藻弧菌的生長(zhǎng)，32-64μmol/L的合成多肽EcLBD1、8-16μmol/L的合成多肽EcLBD2和4-8μmol/L的合成多肽EcLBD3都能夠有效抑制藤黃微球菌的生長(zhǎng)，16-32μmol/L的合成多肽EcLBD2能夠有效抑制表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)。結(jié)果說(shuō)明合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3具有明顯的抗革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的活性。

合成多肽EcLBD1、EcLBD2、EcLBD3的發(fā)現(xiàn)及生物活性鑒定，在新型抗菌藥物的開(kāi)發(fā)上具有重要的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所

<120> 三種來(lái)源于脊尾白蝦ALF的環(huán)狀多肽及其應(yīng)用和抗菌劑

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和23位C的氨基被乙?；Ⅳ然货０坊?/p>

<400> 1

Gln Cys Asn Tyr Arg Val Asp Pro Lys Ile Lys Arg Phe Gln Leu Tyr

1 5 10 15

Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro

20

<210> 2

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和位位氨基酸C的氨基被乙?；?、羧基被酰胺化

<400> 2

Val Cys Thr Val Asp Val Lys Pro Thr Leu Arg Arg Phe Lys Leu Ile

1 5 10 15

Phe Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro

20

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(24)

<223> 2和23位氨基酸C的氨基被乙?；Ⅳ然货０坊?/p>

<400> 3

Val Cys Ser Phe Gln Val Lys Pro Lys Ile Lys Arg Trp Gln Leu Tyr

1 5 10 15

Phe Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro

20

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(125)

<400> 4

Met Lys Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ile Val Leu Val Gly Val Met Thr

1 5 10 15

Ser Ser Leu Phe Pro Thr Cys Glu Ala Gln Ala Trp Gln Ala Val Ala

20 25 30

Ala Ala Val Ala Glu Lys Ile Ala Gly Leu Trp Val Asn Asp Glu Met

35 40 45

Glu Leu Leu Gly His Thr Cys Asn Tyr Arg Val Asp Pro Lys Ile Lys

50 55 60

Arg Phe Gln Leu Tyr Phe Lys Gly Arg Met Trp Cys Pro Gly Trp Thr

65 70 75 80

Pro Ile Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Ser Arg Ser Gly Val Val Gly

85 90 95

Lys Thr Thr Ser Asp Phe Val Thr Lys Ala Phe Lys Ser Gly Leu Ile

100 105 110

Ser Glu Asp Asp Ala Arg Ala Trp Leu Asn Ser Lys Lys

115 120 125

<210> 5

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(134)

<400> 5

Met Arg Pro Ser Thr Cys Phe Phe Val Leu Ala Gly Phe Ile Leu Leu

1 5 10 15

Ser Cys Ser Val Phe Asp Lys Ala Glu Gly Gln Gly Leu Thr Asp Leu

20 25 30

Leu Gly Gly Leu Ser Gly Asp Ser Ile Leu Asp Ala Val Glu Ala Glu

35 40 45

Leu Asn Gly Leu Trp Ser Thr Ser Asp Ile Glu Phe Leu Gly His Val

50 55 60

Cys Thr Val Asp Val Lys Pro Thr Leu Arg Arg Phe Lys Leu Ile Phe

65 70 75 80

Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro Ile Trp Thr Thr Ile Arg Gly Thr Ser

85 90 95

Glu Thr Thr Ser Arg Thr Asn Val Val His Leu Ala Ser Ala Asp Phe

100 105 110

Val Arg Asn Ala Val Ala Ala Glu Leu Ile Thr Glu Glu Gln Gly Lys

115 120 125

Glu Trp Leu Lys Tyr Asn

130

<210> 6

<211> 134

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> PRT

<222> (1)..(134)

<400> 6

Met Arg Pro Ser Thr Cys Phe Phe Val Leu Ala Gly Phe Ile Leu Leu

1 5 10 15

Ser Cys Ser Val Phe Asp Lys Ala Glu Gly Gln Gly Leu Thr Asp Leu

20 25 30

Leu Gly Gly Leu Ser Gly Glu Ser Leu Val Asp Ala Val Ala Ser Gln

35 40 45

Ile Val Gly Leu Trp Gly Ser Gly Asp Ile Glu Phe Leu Asp His Val

50 55 60

Cys Ser Phe Gln Val Lys Pro Lys Ile Lys Arg Trp Gln Leu Tyr Phe

65 70 75 80

Ile Gly Thr Met Tyr Cys Pro Gly Trp Thr Pro Ile Arg Gly Thr Ser

85 90 95

Glu Thr Arg Ser Arg Thr Asn Val Val Asn Leu Ala Thr Ala Asp Phe

100 105 110

Val Arg Lys Ala Ile Gly Glu Gly Leu Ile Thr Glu Glu Gln Ala Arg

115 120 125

Glu Trp Leu Arg His Gln

130