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一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白、原核表達(dá)及其純化方法與流程

文檔序號(hào):12054515閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白,其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

2.一種雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

3.權(quán)利要求1所述的雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及純化方法,步驟為:

提取雞脛骨生長(zhǎng)板組織或雞紅細(xì)胞的總RNA,以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA,并以此為模板,設(shè)計(jì)一對(duì)上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,與pGEM-T Easy載體連接,得到pGEM-T-Ex-FABP重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,然后經(jīng)過(guò)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá),通過(guò)Ni-NTA親和層析柱純化;

所述上游引物:5’-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCCGGACA-3’,

下游引物:5’-AGCTCTCGAGCTACACTTCATCAACGCTGCATTCC-3’,

在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn),在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及純化方法,其特征在于,所述的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞為E. coli DH5α或E. coli BL21(DE3)。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞細(xì)胞外脂肪酸結(jié)合蛋白的原核表達(dá)及純化方法,其特征在于,步驟為:

(1)目的基因的擴(kuò)增:提取雞脛骨生長(zhǎng)板組織,添加液氮并研磨直至粉末狀,Trizol法提取雞脛骨生長(zhǎng)板組織或雞紅細(xì)胞的總RNA,以O(shè)ligo dT為引物合成cDNA,并以此為模板,用合成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR條件為:95℃預(yù)變性3 min;98℃變性10 sec,54℃退火5 sec,72℃延伸1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán);最后72℃終延伸5 min;PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,用凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果;

所述上游引物:5’-CGGAATTCGCGGCCACAGTGCCGGACA-3’,

下游引物:5’-AGCTCTCGAGCTACACTTCATCAACGCTGCATTCC-3’,

在上游引物5’端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn),在下游引物5’端引入XhoⅠ酶切位點(diǎn);

(2)重組質(zhì)粒的構(gòu)建:上述的PCR擴(kuò)增用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收,與pGEM-T Easy載體連接,得到pGEM-T-Ex-FABP重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEM-T-Ex-FABP經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切,所釋放的Ex-FABP基因片段與經(jīng)同樣雙酶切的原核表達(dá)載體pET28a連接,獲得pET-28a-Ex-FABP重組表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,命名為pET-28a-Ex-FABP-BL21,于含100 mg/L卡那霉素抗性的固體LB培養(yǎng)基上挑取單個(gè)菌落,用PCR和酶切鑒定;

(3)Ex-FABP的誘導(dǎo)表達(dá):挑取單菌落,接種于含100 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜,再按1:100的比例接種于含100 mg/L卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5~0.8;加濃度為1.0mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷,繼續(xù)振蕩培養(yǎng),于誘導(dǎo)后收集菌液,加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液,煮沸5min,取10μl進(jìn)行SDS-PAGE鑒定,并用轉(zhuǎn)空載體pET28a的BL21菌液作為對(duì)照;

(4)Ex-FABP的純化:將pET-28a-Ex-FABP-BL21菌液于37℃振搖培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.5~0.8,在30℃、1.0mmol/L的IPTG條件下振搖培養(yǎng)21h,誘導(dǎo)培養(yǎng)物再經(jīng)4℃、12000 rpm離心10min,收獲pET-28a-Ex-FABP-BL21菌體沉淀;用含50mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl、1.0g/L的溶菌酶、1mmol/L的PMSF,pH8.0的細(xì)菌裂解液20ml重懸菌體,冰上放置20min,超聲裂解后,4℃、12000rpm離心10min,收集上清并用0.45μm孔徑濾膜過(guò)濾,于上清中加入咪唑至終濃度為20mmol/L后,過(guò)Ni-NTA親和層析柱,用含有10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L和40mmol/L咪唑的20 mmol/L的NaH2PO4、500mmol/L的NaCl,pH7.4的洗脫緩沖液洗脫雜質(zhì),最后用500mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。

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