本發(fā)明涉及用于從乳樣品中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，以及這一產(chǎn)品作為食品添加劑、營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品或者用于制備治療性組合物的應用。

背景技術(shù)：

血管生成素是一種14kDa的非糖基化多肽，其由數(shù)種生長細胞類型產(chǎn)生，例如血管內(nèi)皮細胞、主動脈平滑肌細胞、成纖維細胞以及某些腫瘤如結(jié)腸癌、卵巢癌和乳腺癌。血管生成素已從多種來源分離，包括正常人血漿、牛血漿、牛乳以及小鼠、兔和豬血清。血管生成素在這每一種來源中均以低水平存在(在牛乳中小于12mg/L，在人血漿中小于150μL/L)。

除了作為血管生成的強效刺激素以外，血管生成素還被證明具有多種其他活性。這些活性包括除去皮膚缺陷例如色素斑的能力、調(diào)節(jié)免疫反應、保護多形核白細胞免于自發(fā)降解和抗系統(tǒng)性細菌和真菌病原體的殺微生物活性?；谠摰鞍椎囊阎砉δ埽深A測血管生成素在醫(yī)藥、飲食食品添加劑和化妝品中的多種用途。

血管生成素在這些用途中的應用需要一種以商業(yè)規(guī)模從合適來源制備該蛋白的有效方法。提供這一方法是本發(fā)明一個優(yōu)選實施方案的目標。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

雖然牛乳是一種高度豐富的商品時，但其用作血管生成素來源并不有利，因為血管生成素僅以低水平存在于牛乳中，而且乳中存在的某些蛋白(例如免疫球蛋白、乳鐵蛋白和乳酸過氧化物酶)掩蓋血管生成素并阻礙其純化。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)數(shù)種富集乳級分的血管生成素的方法，如下面第一至第五方面和本發(fā)明人以WO2008/055310公布的申請中所述，所述每種方法均能夠從乳中生產(chǎn)血管生成素富集產(chǎn)品。

本發(fā)明的第一方面提供一種從乳樣品中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，所述方法包括：

(a)將所述乳樣品與一種與血管生成素相互作用的捕獲劑接觸，從而使所述乳樣品中存在的血管生成素與所述捕獲劑相互作用形成一種血管生成素-捕獲劑復合物；

(b)將所述復合物從所述乳樣品中分離出來；

(c)將血管生成素從所述復合物的捕獲劑中釋放出來；和

(d)收集步驟(c)的血管生成素，從而獲得血管生成素富集產(chǎn)品。在

一個實施方案中，所述捕獲劑固定于一種支持物。

在另一個實施方案中，所述捕獲劑是一種抗體。

本發(fā)明的第二方面提供一種從乳樣品中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，所述方法包括：

(a)將所述乳樣品加至其上面固定有與血管生成素相互作用的抗體的支持物，其中所述乳樣品中存在的血管生成素與所述支持物上的抗體相互作用形成一種血管生成素-抗體復合物；

(b)從所述支持物上洗去所述乳樣品中存在的不與所述抗體相互作用的組分以將所述復合物從所述乳樣品中分離出來；

(c)將血管生成素從所述復合物的抗體中釋放出來；和

(d)收集步驟(c)的血管生成素，從而獲得血管生成素富集產(chǎn)品。

在第一方面或第二方面的一個實施方案中，所述方法涉及免疫親和色譜法。

第三方面提供一種從乳樣品中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，所述方法包括：

(a)將液相乳樣品加至第二相，所述第二相使得可基于所述乳樣品組分的尺寸分離組分；和

(b)收集與所述乳樣品的其他組分分離的血管生成素，從而獲得血管生成素富集產(chǎn)品，其中在步驟(a)之前，不對所述乳樣品進行凝乳或酸沉淀處理，或者所述乳樣品不是乳清或乳清級分。

在第三方面的一個實施方案中，所述第二相為半滲透相。

在第三方面的其他實施方案中，所述半滲透相允許尺寸小于20kDa、甚至尺寸小于50kDa的組分作為滲透物通過所述半滲透相。在一個優(yōu)選實施方案中，所述半滲透相允許尺寸小于30kDa的組分作為滲透物通過所述半滲透相。在這些實施方案中，血管生成素作為滲透物通過所述半滲透相。

在第三方面的又一實施方案中，所述半滲透相允許尺寸小于10kDa的組分作為滲透物通過所述半滲透相。在這一方案中，血管生成素作為保留物為所述半滲透相所保留。

在第三方面的另一實施方案中，迫使所述乳樣品通過所述半滲透相。

在第三方面的一個實施方案中，借助于由注射器、壓縮氣體、泵、離心力或其組合施加的力迫使所述乳樣品通過所述半滲透相。

在第三方面的一個實施方案中，所述第二相為半滲透膜。

在第三方面的另一個實施方案中，所述方法涉及超濾。

本發(fā)明的第四方面提供一種從乳樣品中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，所述方法包括：

(a)將液相乳樣品加至第二相，所述第二相使得可基于所述乳樣品組分的尺寸將所述組分分離為級分；

(b)鑒定那些含有血管生成素的級分并收集所述級分以獲得血管生成素富集產(chǎn)品。

在第四方面的一個實施方案中，所述方法涉及尺寸排阻色譜法。

在第四方面的另一個實施方案中，所述第二相為尺寸排阻樹脂。

在第四方面的一個實施方案中，所述樹脂分離分子量為約10-20kDa的蛋白。

本發(fā)明的第五方面提供一種從乳樣品中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，所述方法包括：

(a)將電場在橫于流動的水性乳樣品的方向上施加于所述乳流；

(b)回收被施加所述電場的乳流級分；并

(c)鑒定那些血管生成素富集的級分并收集所述級分，從而獲得血管生成素富集產(chǎn)品。

在第五方面的一個實施方案中，所述方法涉及自由流動電泳。自由流動電泳可選自等電點聚焦、區(qū)帶電泳、等速電泳、場分布電泳(field step electrophoresis)和場流分級分離。此外，自由流動電泳可為連續(xù)自由流動電泳或間歇自由流動電泳。

在另一個實施方案中，所述方法在變性條件下進行。

在第五方面的又一實施方案中，水性乳的流動在提供pH梯度的緩沖介質(zhì)中進行。在一個實施方案中，所述梯度在8-11的pH范圍內(nèi)。

在第一至第五任一方面的另一個實施方案中，對所述血管生成素富集產(chǎn)品進行一個或多個其他血管生成素富集步驟。所述一個或多個其他血管生成素富集步驟可選自陽離子交換色譜法、電泳包括自由流動電泳、尺寸排阻色譜法和超濾。這尤其是對于血管生成素級分的純度很重要的情況，例如血管生成素的醫(yī)藥應用。然而可期望的是，第一和第二方面的方法能夠提供較高純度——取決于所述捕獲劑的特異性——的血管生成素富集產(chǎn)品。當所述捕獲劑為對血管生成素特異的抗體時，可期望較高的純度。

第六方面提供一種通過第一至第五任一方面的方法制備的血管生成素富集產(chǎn)品。

第七方面提供本發(fā)明第六方面的血管生成素富集產(chǎn)品在制備食品物質(zhì)、營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品中的應用。

第八方面提供包含第六方面的血管生成素富集產(chǎn)品的食品物質(zhì)、營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品。

在第七或第八方面的一個實施方案中，所述食品物質(zhì)是一種運動營養(yǎng)素或食品添加劑，特別是針對嬰兒、運動員尤其是優(yōu)秀運動員、老年人或體弱者的食品添加劑。

第九方面提供包含第六方面的血管生成素富集產(chǎn)品的醫(yī)藥組合物或獸藥組合物。

第十方面提供第六方面的血管生成素富集產(chǎn)品在制備用于治療和/或預防由病毒、細菌或真菌及其毒素引起的疾病，或者需要血管生成素的刺激作用的疾病的藥劑中的應用。

第十一方面提供第六方面的血管生成素富集產(chǎn)品作為可靶向引起黏膜表面感染的病原體的營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品的成分的應用。

第十二方面提供一種靶向引起黏膜表面感染的病原體的方法，包括給予受試者有效量的本發(fā)明第八方面的營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品或者第九方面的組合物的步驟。

在本發(fā)明第十一或第十二方面的一個實施方案中，所述黏膜表面可包括鼻、眼、耳、肺、胸和陰道的黏膜表面。

第十三方面提供一種治療和/或預防由病毒、細菌或真菌及其毒素引起的疾病，或者需要血管生成素的刺激作用的疾病的方法，包括給予受試者有效量的本發(fā)明第八方面的營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品或者第九方面的組合物的步驟。

附圖說明

圖1示出了以Sypro Ruby(Molecular Probes)染色并在ProXpress(Perkin Elmer)成像系統(tǒng)上使用5秒曝光而成像的一維SDS聚丙烯酰胺凝膠。泳道1、2和3是：1)分子量標準，2)乳衍生級分，和3)在與所述乳衍生級分孵育后從抗血管生成素IgG標記的Protein G Dynabead上洗脫的洗脫液。

圖2示出了免疫親和純化后的血管生成素的蛋白質(zhì)印跡分析。血管生成素使用0.5μg小鼠抗牛單克隆抗體(克隆1B14D4)檢測，第二抗體為IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG(Licor)并且在Odyssey紅外成像儀(Licor)上成像。泳道是：1)分子量標準，2)乳衍生級分，3)在與所述乳衍生級分孵育后從抗血管生成素IgG標記的Protein G Dynabead上洗脫的洗脫液。

圖3示出了比較借助通過30kDa膜的超濾制備的不含血管生成素的保留物與血管生成素富集的滲透物的電泳分離。泳道內(nèi)含物：1，分子量標準；2，保留物的2D PAGE分析；3，保留物的1D PAGE分析；4，血管生成素富集的滲透物的1D PAGE分析；5，分子量標準；6，血管生成素富集的滲透物的2D PAGE分析。血管生成素的位置由圓圈標示。

圖4示出了一個Tris-tricine PAGE凝膠，其顯示對WGFE以及通過對WGFE的UF分離或?qū)GFE的熱致沉淀獲得的級分的分離(泳道內(nèi)含物：1，分子量標準；2，加熱的WGFE；3，加熱的WGFE；4，空白；5，100kDa滲透物；6，50kDa滲透物；7，30kDa滲透物；8，10kDa滲透物；9，空白；10，未分級分離的WGFE)。血管生成素的位置被標示

圖5示出了為了分離血管生成素而對WGFE的Sephacryl S-100HR分離(-在280nm處的吸光度信號，-級分收集器信號，|合并開始/結(jié)束)。

圖6示出了為了分離血管生成素而對WGFE的Sephacryl S-300HR分離(-在280nm處的吸光度信號，-級分收集器信號，|合并開始/結(jié)束)。

圖7示出了為了分離血管生成素而對WGFE的Superose 12分離(-在280nm處的吸光度信號，-級分收集器信號，|合并開始/結(jié)束)。

圖8是一個Tris-tricine PAGE凝膠，其顯示對WGFE和通過對WGFE的SEC分離獲得的級分的分離(泳道內(nèi)含物：1，未分級分離的WGFE；2，空白；3，S-100HR合并液A；4，S-100HR合并液B；5，S-100HR合并液C；6，S-100HR合并液D；7，空白；8，S-100HR合并液E；9，空白；10，分子量標準。)血管生成素的位置被標示

圖9是一個Tris-tricine PAGE凝膠，其顯示對WGFE和通過對WGFE的SEC分離獲得的級分的分離(泳道內(nèi)含物：1，空白；2，S-300HR合并液A；3，S-300HR合并液B；4，S-300HR合并液C；5，空白；6，Superose 12合并液A；7，Superose 12合并液B；8，空白；9，未分級分離的WGFE；10，分子量標準)。血管生成素的位置被標示

圖10示出了溶液內(nèi)等電點聚焦實驗中的蛋白質(zhì)分離的2維凝膠電泳分析，其中乳衍生蛋白溶液被分級分離為pH 3-5、pH 5-6.5、pH 6.5-8和pH 8-11的級分。pH 8-11的級分中大約80％的蛋白被鑒定為血管生成素。

具體實施方式

發(fā)明人已經(jīng)認識到對使得可從容易獲得的起始材料乳(特別是牛乳)中以有效方式富集和分離血管生成素的方法的需要。這些方法中的一些在研究規(guī)模上提供高度純化的血管生成素級分，其他提供商業(yè)可行的富集方法。

第一和第二方面提供一種方法，其中通過與血管生成素蛋白相互作用的捕獲劑將在乳樣品中存在的血管生成素蛋白與所述樣品中存在的其他蛋白和物質(zhì)分離。

在第一或第二面的另一個實施方案中，先將所述乳樣品加至不存在所述捕獲劑或抗體的預備的不同支持物，然后將所述乳樣品與所述接觸劑接觸，其中將所述乳樣品中存在的與所述支持物非特異性相互作用的物質(zhì)從所述乳樣品中除去。

在第一或第二方面的一個實施方案中，所述支持物基于聚合物和/或基于瓊脂糖。例如所述支持物可為Dynabeads Protein G。

在第一或第二方面的另一個實施方案中，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。所述抗體優(yōu)選為單克隆抗體。一種合適的抗牛血管生成素抗體為得自Department of Biochemistry，Chungbuk National University，Cheongju，Chungbuk，Korea的克隆號為1B14D4的單克隆抗體。

在第一或第二方面的又一實施方案中，所述捕獲劑或抗體通過與所述支持物的共價連接而固定于所述支持物。

本文所用的術(shù)語“捕獲劑”是指能夠與血管生成素蛋白“相互作用”形成血管生成素-捕獲劑復合物的實體。所述相互作用優(yōu)選地使血管生成素蛋白固定化。理想地，所述捕獲劑只對所述乳樣品中存在的血管生成素蛋白具有特異性；然而，本領域技術(shù)人員應理解，所述乳樣品中的其他組分也可與所述捕獲劑非特異性地相互作用。因此首選的捕獲劑是呈現(xiàn)最小非特異性結(jié)合的捕獲劑。

合適的捕獲劑可包括但不限于：血管生成素的抗體、肽或蛋白(包括結(jié)合血管生成素的蛋白，例如卵泡抑素)、化學實體、受體、配體、適體、多糖、脂質(zhì)、激素等。所述捕獲劑優(yōu)選為抗體或其功能性片段。

在一個實施方案中，所述捕獲劑能夠區(qū)分核糖核酸酶4和血管生成素，盡管其具有30％的序列同一性。

所述捕獲劑與血管生成素之間的相互作用應是可逆的從而使得血管生成素可最終與所述捕獲劑分離。所述相互作用可以是直接的，也可以是間接的從而使得所述捕獲劑與血管生成素的相互作用為使所述捕獲劑與血管生成素接觸的第三種(或更多)試劑所介導，例如接頭分子、肽等。

在一個實施方案中，所述捕獲劑連接或“固定”于支持物。本文所用的術(shù)語“支持物”是指其上面連接有所述捕獲劑的材料。所述支持物可為固體支持物。合適支持物的實例包括基于聚合物和/或瓊脂糖的基質(zhì)支持物，例如瓊脂糖凝膠、硝酸纖維素、尼龍、聚偏氟乙烯(PVDF)、玻璃、塑料、凝膠、溶膠(sols)、陶瓷、金屬以及任何這些材料的衍生物。

捕獲劑可直接或間接地連接于支持物。捕獲劑可直接或間接地以高密度沉積在所述支持物上。例如，可將蛋白A或G印在支持物上。然后可將捕獲劑(例如血管生成素的抗體)通過其與蛋白A或G的相互作用偶聯(lián)于所述支持物。此方法的優(yōu)點在于通過使抗體的恒定區(qū)接合于蛋白A或G，該抗體的可變區(qū)(血管生成素結(jié)合結(jié)構(gòu)域)會完全暴露以與血管生成素相互作用。

捕獲劑也可連接于如下支持物：由聚合物、彈性體或其他合適的膜材料制成的膜。這些材料的實例包括但不限于PVDF、硝酸纖維素、尼龍或其改性變體。本發(fā)明涵蓋任何這種材料(例如本領域技術(shù)人員已知的用于RNA印跡、DNA印跡或蛋白質(zhì)印跡的那些材料)的應用。就本發(fā)明的目的而言，所需的膜的具體方面包括結(jié)合大量血管生成素蛋白的能力、在最小變性的情況下結(jié)合血管生成素蛋白的能力以及最小化所述乳樣品中存在的非血管生成素組分結(jié)合的能力。

所述第一和第二方面倚賴血管生成素與用作所述捕獲劑的血管生成素抗體之間的可逆親和相互作用。

本發(fā)明以此方式使用抗體的一種方法通常稱為免疫親和色譜法。在這點上，將對血管生成素具有特異性的抗體固定于支持物上，以產(chǎn)生活性免疫吸附劑。然后將所述活性免疫吸附劑裝入準備接收要純化的混雜蛋白樣品的柱子中。將一種含有蛋白復雜混合物的乳樣品加至或使其通過所述免疫吸附劑，藉此使所述樣品中存在的血管生成素蛋白與所述抗體相互作用形成血管生成素-抗體復合物，并將所述樣品中存在的其他蛋白和材料洗去至柱穿流液(flow-through)中。然后破壞所述抗體與血管生成素之間的可逆相互作用以生成血管生成素富集的柱洗脫液形式的高度純化的產(chǎn)品。

本文所用的術(shù)語“血管生成素抗體”或“抗體”包括多克隆和單克隆抗體類型。此外，術(shù)語“抗體”是指完整的免疫球蛋白、嵌合免疫球蛋白分子或Fab或F(ab′)₂片段。本文定義的抗體還包括單鏈抗體(ScFv)，其包括相連的V_H和V_L結(jié)構(gòu)域并且保留所述抗體的天然個體決定簇的構(gòu)象和特異性結(jié)合活性。這種單鏈抗體是本領域公知的并且可通過標準方法生產(chǎn)。所述抗體可為任何同種型，IgG、IgA、IgD、IgE和IgM?？汕宄乩斫?，所述抗體或其片段包括目前已知或?qū)砜芍哪切?/p>

多克隆血管生成素抗體可通過本領域已知的技術(shù)獲得。例如多克隆血管生成素抗體可通過免疫兔或山羊并從得到的血清中純化免疫球蛋白級分而獲得。所獲得的抗體是一種抗體混合物，其具有能夠結(jié)合用作免疫原的血管生成素蛋白的不同部分的不同特異性。

血管生成素的多克隆抗體也可商業(yè)購得(例如購自Calbiochem，USA；Lifespan Biosciences，USA；R&D Systems，USA)。

盡管多克隆抗體易于生產(chǎn)，然而它們用于免疫親和色譜法具有多個缺點。例如，它們的表位特異性和結(jié)合性質(zhì)各異，必須使用非常純的抗原以避免在蛋白制備中產(chǎn)生針對少量雜質(zhì)的不想要的抗體。此外，所述抗體制備在一只免疫動物與另一只免疫動物之間不是完全可重復的，導致難以獲得大量相同材料。因此盡管血管生成素多克隆抗體可用于本發(fā)明方法，然而它們不是首選的抗體。

可使用血管生成素的單克隆抗體。血管生成素的單克隆抗體可使用任何用于通過培養(yǎng)的連續(xù)細胞系生產(chǎn)抗體分子的技術(shù)制備。這些包括但不限于本領域技術(shù)人員已知的雜交瘤技術(shù)、人B細胞交瘤技術(shù)和EBV雜交瘤技術(shù)。血管生成素的單克隆抗體也可商購(例如購自Abeam，UK；GeneTex，USA；BACHEM，USA)。

單克隆抗體可用較少量的血管生成素作為免疫原生產(chǎn)，所述血管生成素不必是純的。一旦建立雜交瘤細胞系，則其可用于生產(chǎn)可能無限的抗體供應，具有可重復性。此外，所述單克隆抗體會結(jié)合于單個表位并會具有同質(zhì)的結(jié)合和洗脫性質(zhì)。

免疫吸附劑性能取決于其上面固定有抗體的支持物的性質(zhì)。本領域技術(shù)人員會理解，有效的免疫吸附劑應理想地具有機械和物理穩(wěn)定性、合適的流動性、可接受的壓力下降、最小非特異性結(jié)合、用于蛋白-抗體相互作用的大表面積和化學穩(wěn)定性。

在這點上，基于聚合物和/或瓊脂糖的基質(zhì)支持物例如瓊脂糖凝膠是常用并且是市售的。將用于本發(fā)明親和色譜方法中的支持物的合適基質(zhì)的實例包括CNBr-活化的Sepharose(GE Healthcare)、Emphaze^TM活化的色譜樹脂(Pierce Chemical)、CM Bio-Gel A凝膠(Bio-Rad)、ECH Sepharose 4B(GE Healthcare)、Reacti-Gel 6X(Pierce Chemical)、蛋白A和G Sepharose CL 4B Beads(Pierce Chemical)、HiTrap NHS-Activated(GE Healthcare)和AffiPrep 10(Bio-Rad)。

所述免疫吸附柱的有效功能倚賴用于使所述抗體偶聯(lián)于所述基質(zhì)藉此固定所述抗體的活化化學。通常采用共價偶聯(lián)。如會為本領域技術(shù)人員所知的，存在多種不同的用于使抗體共價結(jié)合于固相基質(zhì)的方案；然而，最容易的是使抗體偶聯(lián)于蛋白A或蛋白G小珠。蛋白A或G基質(zhì)特異性地結(jié)合于抗體的F_c結(jié)構(gòu)域。抗體結(jié)合后，通過用雙官能偶聯(lián)劑將抗體與蛋白A或G共價交聯(lián)而穩(wěn)定相互作用。

另一方法是使抗體與已被化學改性以含有活性基團的基質(zhì)小珠偶聯(lián)。將活化小珠與抗體混合，所述抗體與活性位點相互作用以形成共價鍵。此方法優(yōu)于使用蛋白A或G基質(zhì)的方法的優(yōu)點在于：所述小珠可在比蛋白可承受的條件嚴苛得多的條件下活化，從而允許使用多種本領域已知的活化方案(也參見Porath and Axen，1976，Methods Enzymol.44：19to45；Scouten WH，1987，Methods Enzymol.135：30to65)。此方法的其他優(yōu)點包括如上所述存在多種市售活化小珠，以及這些偶聯(lián)方法中的許多都可產(chǎn)生對大范圍變性條件穩(wěn)定的鍵。

可通過多種方法實現(xiàn)對所述基質(zhì)小珠進行化學改性以產(chǎn)生活性基團，包括以羰基二咪唑、溴化氰、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、氯化碘乙酸和三氟代乙烷磺酰氯處理。

所述活化小珠與血管生成素抗體之間的偶聯(lián)主要是通過所述抗體上存在的伯氨基基團或巰基基團介導的。例如，可以以如下方式實現(xiàn)抗體(通過氨基基團)與NHS-活化的基質(zhì)(例如AffiPrep)偶聯(lián)以產(chǎn)生功能免疫吸附劑。將以懸浮于乙醇中的小珠(50％v/v)的漿體形式提供的合適量的活化AffiPrep基質(zhì)倒入燒結(jié)的玻璃漏斗中并且通過溫和真空吸取所述液體。用玻棒攪拌剩余的懸浮液并一直保持潮濕。用冰冷的蒸餾水洗滌所述活化小珠以確保除去全部乙醇。用溫和真空使所述小珠排盡水，將濕潤的小珠轉(zhuǎn)移至一個含有溶于偶聯(lián)緩沖液(0.1M 4-嗎啉基丙磺酸(MOPS)、0.1M NaCl，pH 7.2)的3-5mg/ml血管生成素抗體溶液的燒瓶中。然后在冷室中將該燒瓶中的內(nèi)容物低速混合過夜或在室溫下混合4小時。所述偶聯(lián)涉及小珠上的活化酯與抗體上的活性胺之間的反應，這最終導致穩(wěn)定酰胺(共價)鍵的形成。在偶聯(lián)步驟完成后，可使所述小珠在室溫下沉降，然后通過抽取或傾析除去上清液。然后將封閉溶液(1M乙醇胺，pH 8.0)至所述免疫吸附劑并在室溫下低速混合1小時。該封閉步驟完成后，再使所述小珠沉降并除去上清液。為確保未使用活化位點的完全封閉，將該封閉步驟再重復兩次。

然后將配體偶聯(lián)緩沖液(10mM Tris HCl，50mM NaCl，pH 6.8)加入抗體偶聯(lián)的小珠中，在室溫下將內(nèi)容物低速混合1小時。優(yōu)選地，將此步驟再重復4-5次以確保從小珠除去全部封閉溶液。然后將所述免疫吸附劑重懸浮于合適量的配體偶聯(lián)緩沖液中并保存在4℃待用。因此所述免疫吸附劑即可使用并可通過重力裝入柱中用于血管生成素結(jié)合。

可將所述柱用合適的洗滌緩沖液“平衡”，然后將乳樣品加入準備好小珠的柱中。合適的洗滌緩沖液的實例包括但不限于含有10mM Tris HCl和50mM NaCl，pH為7.0的那些；含有10mM Tris HCl、140mM NaCl、0.5％Triton X-100和0.5％脫氧膽酸鈉，pH為8.0的那些；含有10mM Tris HCl、140mM NaCl和0.5％Triton X-100，pH為8.0的那些；含有10mM Tris HCl、140mM NaCl和0.5％Triton X-100，pH為9.0的那些；以及含有150mM NaCl、0.1％Triton X-100和50mM三乙醇胺的那些。所述柱可用一種或多種上述洗滌緩沖液平衡。

通常實行但不必需的是，先使樣品通過含有與免疫吸附柱相同支持物但不含連接于所述支持物的抗體的預備的不同“前置柱”，然后將所述乳樣品加入經(jīng)平衡的免疫吸附(含有抗體)柱中。這將進一步確保所述樣品不含可能與所述免疫吸附柱非特異性結(jié)合的物質(zhì)。在加入乳樣品之前，使用如上所述的洗滌緩沖液以與平衡所述免疫吸附柱相同的方式平衡所述前置柱。

更優(yōu)選地，先從所述乳樣品中除去脂肪(通常稱為去脂)，然后再將所述乳樣品加入經(jīng)平衡的免疫吸附柱和前置柱(如果使用的話)中。然而這不是必需的。脂肪可以以本領域已知的任何常規(guī)方法除去，包括低速離心、分離或微濾。任選地，也可例如通過1微米膜的微濾、凝乳或酸沉淀除去酪蛋白，然后再進行免疫親和色譜法。如果選擇微濾，酪蛋白會被膜保留而乳清蛋白包括血管生成素會進入滲透物。

如果通過微濾或其他膜方法除去酪蛋白，那么將滲透物直接施加于經(jīng)平衡的免疫吸附柱和前置柱(如果使用的話)，或者任選地將所述滲透物濃縮后再施加。合適的濃縮方法包括過濾(例如用0.5-10kDa膜的超濾、用150-500Da膜的納米過濾，或只允許水透過膜的逆滲透)，或冷凍干燥，然后重懸浮于上述洗滌緩沖液。

通常以每小時0.2-2倍柱體積的流速將所述乳樣品(粗品或經(jīng)預處理的)加入前置柱和/或預處理(primed)的免疫吸附柱(即所述固體支持物)中。然而，最快至每小時5倍柱體積的流速也是合適的。一旦加入全部樣品，則使用上面公開的任意一種或多種洗滌緩沖液進行一系列洗滌步驟。施加所述洗滌緩沖液直至通過所述柱的洗滌緩沖液在280nm處于基線吸光度。這表明不再有未結(jié)合蛋白從柱上被洗脫。

對通過抗原(捕獲劑)結(jié)合于所述固體支持物的血管生成素的分離可以倚賴所用固體支持物的性質(zhì)以多種方式實現(xiàn)。重要的是避免可能使所述血管生成素變性的分離條件。如會為本領域技術(shù)人員所理解的，當選擇合適的分離方案時可考慮多種可用的分離策略。這些策略可包括酸分離、堿分離和使用離液劑(chaotropic agent)。

酸分離是最廣泛使用的方法并且通常是非常有效的。廣泛使用的酸包括甘氨酸-鹽酸(pH 2.5)、0.02M HCl和檸檬酸鈉(pH 2.5)。然而，為避免酸引起的變性，分離后必須將所分離樣品的pH用2M Tris堿(pH 8.5)迅速中和至pH 7.0。堿分離通常倚賴由1M NH₄OH、50mM二乙胺(pH 11.5)或含有150mM NaCl和0.1％Triton X-100的50mM三乙醇胺溶液構(gòu)成的分離劑。

離液劑破壞蛋白的三級結(jié)構(gòu)并因此可用于打斷血管生成素：抗體復合物?？墒褂秒x液劑是因為其打斷離子相互作用、氫鍵并有時打斷疏水相互作用。有效的離液序列高的陰離子包括SCN^-、ClO₄^-、I^-、Br^-和Cl^-。有效的離液序列高的陽離子包括Mg、K和Na。分離劑例如8M脲、6M鹽酸胍和4M NaSCN可有效地打斷大多數(shù)抗體：抗原相互作用。然而，為最小化離液鹽引起的蛋白變性，建議對分離劑進行快速脫鹽或透析。

收集從固體支持物分離出來的樣品并分析血管生成素的存在情況，從而確定血管生成素富集的程度。合適的分析步驟包括對染色SDS-PAGE的密度計分析以比較血管生成素特異蛋白與任何存在的污染蛋白的條帶豐度；質(zhì)譜例如MALDI-TOF/TOF MS；免疫親和檢測例如蛋白質(zhì)印跡或ELISA；氨基酸分析和測序；陽離子交換色譜法和反相色譜法。這些技術(shù)的每一種都可為本領域技術(shù)人員所知。

第三方面提供一種方法，其中將(以液相形式提供的)乳樣品的組分(包括血管生成素)加至能夠基于所述乳樣品組分的尺寸使組分相互分離開的第二相。然后可收集所分離的血管生成素，基本上提供血管生成素富集產(chǎn)品。

當在本文中使用時，對于乳的組分——包括血管生成素——所提及的“尺寸”應認為是指該組分的“流體力學直徑”或“流體力學體積”。組分的“流體力學直徑”或“流體力學體積”是指當所述組分以液體形式運動時表現(xiàn)出的直徑或體積。

在本發(fā)明的上下文中“第二相”是指可基于所述乳樣品的每一組分的尺寸分離各個組分的任何機構(gòu)。

在一個實施方案中，所述第二相是半滲透相?！鞍霛B透相”是指一種非水相，所述乳樣品的組分可與該半滲透相相互作用，并且可通過該半滲透相或被該半滲透相所保留。

術(shù)語“滲透物”是指所述乳樣品通過或透過所述第二相的組分。

術(shù)語“保留物”是指所述乳樣品被所述第二相所保留的組分。

例如所述半滲透相可為膜或過濾器等，其可基于該相的相對孔隙度根據(jù)尺寸分離乳組分從而起到分子篩的作用。

在本發(fā)明的上下文中，被所述第二相所“保留”的組分基本上被所述第二相捕獲或無法通過所述第二相。被所述第二相所“保留”的組分是可從第二相除去的保留物的一部分，其只是不能通過所述第二相。收集通過所述第二相的組分作為滲透物。

在一個實施方案中，所述第二相是半滲透膜。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“膜”與術(shù)語“網(wǎng)”和“過濾器”等同義。所述膜可由使所述膜具有半滲透性或“多孔性”的任何材料制成，即所述材料能夠基于膜上孔、洞等的尺寸允許或阻止分子通過所述材料。例如，合適的材料包括但不限于熱塑性塑料例如聚砜(PSU)、聚醚砜(PES)、醋酸纖維素、尼龍、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚碳酸酯、聚醚酰亞胺和聚丙烯腈。這些膜可從例如Millipore、Sartorius、GE Healthcare(Osmonics)、Koch Membrane Systems商購。

對于第三方面的方法，可選擇一種第二相，使得血管生成素可通過所述第二相，但阻止比血管生成素大的分子通過。例如，分子量截止值在20kDa和50kDa之間的任何第二相都可接受。

術(shù)語“分子量截止值”用于表明能通過所述第二相的組分的最大分子尺寸。在一個優(yōu)選實施方案中，最佳第二相的分子量截止值為30kDa。

應理解，可使用本發(fā)明方法進行另外一輪或多輪純化。所述一輪或多輪純化的目的是進一步濃縮初步純化獲得的血管生成素并降低不想要雜質(zhì)的濃度。在此點上，所述另外一輪或多輪純化可使用分子量截止值小于血管生成素尺寸的第二相，例如可選擇分子量截止值為5kDa或10kDa的第二相。這樣，血管生成素會被阻止通過所述第二相并被所述第二相所保留。然后，如果需要的話，可使用諸如冷凍干燥或噴霧干燥的方法干燥被所述第二相所保留的純化血管生成素。

在將乳樣品加至所述第二相后可對所述樣品施加壓力從而基本上迫使其通過所述第二相。力可通過提供不超過290psi(20Bar)、更優(yōu)選218psi(15Bar)、甚至更優(yōu)選145psi(10Bar)壓力的任何機構(gòu)施加。

例如，所述力可以是通過注射器、壓縮氣體(即攪拌式超濾裝置(stirred cell))、泵、離心機或其任何實用組合施加的力。理想地，所述力是以壓力為70psi(5Bar)的壓縮氮氣氣瓶施加。

所述第三方面方法的變型還可利用對血管生成素蛋白特異的粘合劑。原理是血管生成素與所述粘合劑的結(jié)合物的尺寸會比血管生成素自身更大。因此，當血管生成素與所述粘合劑復合時，可使用所述第三方面方法使血管生成素與尺寸相似的乳組分分離。在此點上，可選擇一種第二相，其保留所述血管生成素-粘合劑復合物并允許尺寸小于所述復合物的乳樣品其他組分通過所述第二相。

所述粘合劑與血管生成素之間的相互作用應該是可逆的，從而可使用本發(fā)明方法使血管生成素最終與所述粘合劑分離。在此實例中，可選擇一種第二相，其使得可進行這種根據(jù)粘合劑與血管生成素的相對尺寸的分離。因此，血管生成素可被所述第二相保留或可通過所述第二相，反過來對于所述粘合劑也是這樣。

所述第三方面方法的任何其他變型也被考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，可首先使用所述第三方面方法，其中無粘合劑存在。然而，包含血管生成素的產(chǎn)品可與粘合劑結(jié)合從而形成血管生成素-粘合劑復合物。然后可將所述產(chǎn)品加入另一第二相以除去所述產(chǎn)品中存在的非血管生成素組分。此后，可逆轉(zhuǎn)所述粘合劑與血管生成素之間的相互作用并通過將所述組分施加于另一第二相而使其分離。

當在本文中用于第三方面時，術(shù)語“粘合劑”是一種能夠與血管生成素蛋白相互作用或與其形成復合物并使其保留的實體。在此上下文中術(shù)語“保留”或“保持”是指保持或結(jié)合血管生成素蛋白。理想地，所述粘合劑只對所述乳樣品中存在的血管生成素蛋白具有特異性；然而，本領域技術(shù)人員應理解所述乳樣品中的其他組分也可能會與所述粘合劑非特異性地相互作用。因此，首選的粘合劑是呈現(xiàn)最小非特異性結(jié)合的粘合劑。

合適的粘合劑可包括但不限于：血管生成素的抗體、肽或蛋白(包括結(jié)合血管生成素的蛋白，例如卵泡抑素)、化學實體、受體、配體、多糖、脂質(zhì)、聚合物例如DEAE葡聚糖、激素等。所述粘合劑優(yōu)選為抗體或其功能性片段。

所述相互作用可以是直接的，也可以是間接的從而使得所述捕獲劑與血管生成素的相互作用為使所述捕獲劑與血管生成素接觸的第三種(或更多)試劑所介導，例如接頭分子、肽等。

術(shù)語“血管生成素的抗體”或“抗體”包括用于第三方面時意義與如上所述用于第一和第二方面時意義相同的多克隆和單克隆抗體類型。

可分析在第三方面方法的分離步驟后收集的滲透物或保留物中血管生成素的存在情況并從而確定血管生成素富集的程度。

第四方面提供另一種方法，其中使所述乳樣品的組分(包括血管生成素)基于其尺寸而相互分離。一種依照第四方面所述的方法通常稱作尺寸排阻色譜法。

當用于第四方面時，術(shù)語“尺寸”具有與如上所述用于第三方面時相同的意義。

術(shù)語“尺寸排阻色譜法”包括稱為凝膠滲透、凝膠滲透色譜法、凝膠過濾或凝膠過濾色譜法的方法。以下，任何提及“尺寸排阻色譜法”之處都應認為包括任何上述術(shù)語，或者基于其尺寸來分離蛋白與其他蛋白或其他生物分子的任何其他類似色譜方法。

第四方面方法的原理是其提供一種方法，其中使得乳樣品溶液中的組分可與第二相接觸，其中所述第二相影響產(chǎn)物組分的流速，因為所述組分與所述第二相相互作用和/或基于所述組分的尺寸通過所述第二相。所述產(chǎn)物組分分離開，因為所述樣品中存在的各種組分的運動因其被所述第二相“俘獲”而減慢，并隨后被釋放。

在本發(fā)明的上下文中“第二相”是指可基于所述乳樣品的每一組分的尺寸控制各個組分的運動的任何機構(gòu)。

對于第四方面，所述第二相可為固相。“固相”是指一種非水基質(zhì)，所述乳樣品的組分可與所述基質(zhì)相互作用和/或通過所述基質(zhì)。所述固相可為純化柱、離散顆粒的非連續(xù)相、樹脂、膜或過濾器等。用于形成所述固相的材料的實例包括多糖(例如瓊脂糖和纖維素)；以及其他機械穩(wěn)定的基質(zhì)例如二氧化硅(例如受控孔隙的玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷顆粒以及上面任何材料的衍生物。

在第四方面的一個實施方案中，所述第二相為可裝入色譜柱的樹脂。在這點上，所述俘獲可通過組分進入所述樹脂中存在的孔而進行。大于所述孔直徑的分子不能進入那些孔并迅速從所述柱中流出，而較小的分子進入所述樹脂的孔，花費更長的時間才能通過所述柱。俘獲速度及隨后釋放的速度隨組分不同而變動，從而出現(xiàn)利用尺寸排阻而分離的現(xiàn)象。

如果所述第二相由多孔樹脂構(gòu)成，那么所述多孔結(jié)構(gòu)理想地必須界限明確并具有批次間的可重復性，并且孔尺寸的分布和形狀應盡可能窄。此外，含有所述樹脂的柱的總孔體積(pore volume)與空體積(void volume)的比例應盡可能高以拓寬分離窗口，從而提高峰容量。如果所述樹脂尺寸較小(例如5μm或更小)并規(guī)則，那么可進一步提高分離效率。最后，所述樹脂柱理想地應具有大于5mm的直徑，其應較長(任何大于100mm的長度)并應被樹脂緊密填充。

所述樹脂可由聚丙烯酰胺、葡聚糖、瓊脂糖、二氧化硅或交聯(lián)聚苯乙烯構(gòu)成。適于尺寸排阻色譜法的樹脂的實例可包括但不限于Superose(GE Healthcare)、Sephadex(GE Healthcare)、Sephacryl(GE Healthcare)、H_HR(Tosoh Biosciences)、Toyopearl HW(Tosoh Biosciences)和TSK-GEL PW(Tosoh Biosciences)、AcA(IBF Biotechnics、Inc)以及Bio-Gel A(Bio-Rad)。最合適的樹脂應為可將分子量為10kDa到20kDa的蛋白進行良好分離的那些。合適樹脂的實例包括Superose 12、Sephadex 75、Sephacryl S-100HR、Toyopearl HW-50、TSK-GEL PW-50、AcA 54和Bio-Gel A 1.5M。最優(yōu)選地，所述樹脂將為Sephacryl S-100HR。

對于分離樹脂的制備(“平衡”)以及所述分離方法自身，待使用的理想緩沖液應具有低的摩爾滲透壓濃度并具有中性pH。理想地，合適的緩沖液包括水、磷酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水，但也可使用具有類似性質(zhì)的其他緩沖液。

然而，由于血管生成素是一種非常穩(wěn)定的蛋白并可在變性后重折疊，因此合適的緩沖液也可具有非常低或非常高的pH，具有高摩爾滲透壓濃度或含有變性劑(例如十二烷基硫酸鈉、脲或胍)，所述變性劑可后來除去而不影響血管生成素的生物活性。

理想地，使大于2倍柱體積(CV)的緩沖液通過所述色譜柱以平衡所述柱，然后再施加所述乳樣品。平衡過程中的流速為0.1-3CV/h。優(yōu)選地，所述流速為0.66CV/h，但如果壓力不超過所述樹脂可耐受的壓力那么1CV/h也可接受。分離過程中的流速也為0.1-3CV/h。優(yōu)選地，所述流速為0.375CV/h，但可接受的分離可通過最快至0.66CV/h的流速實現(xiàn)。

施加于經(jīng)平衡柱的樣品體積可為0.005-0.2CV，理想地為0.015-最高至0.05CV。所施加樣品中存在的蛋白量可為0.001-0.2克蛋白/mL CV，理想地為0.0016g蛋白/mL CV-最高至0.05克蛋白/mL CV。

分離一般在上述條件下進行約1-2小時。理想地，用UV分光光度計在280nm監(jiān)測流出所述柱的分離樣品級分。血管生成素在免疫球蛋白、乳鐵蛋白和乳酸過氧化物酶后，但在大多數(shù)生長因子之前洗脫出來。應收集各級分以確保血管生成素被捕獲。重疊的乳鐵蛋白和乳酸過氧化物酶的峰會顯示為棕綠色帶，因此在棕綠色帶流出之前不需進行收集。如果全部β-乳球蛋白已被所述柱除去，那么下個峰會是血管生成素。

第五方面提供一種從乳中獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法，在該方法中，當所述乳樣品流過電場時，根據(jù)血管生成素的電荷和電泳遷移率將所述乳樣品中存在的血管生成素蛋白與所述樣品中存在的其他蛋白分離或分級分離。因此所述乳樣品作為“水性乳流”提供。

回收被施加所述電場的乳流級分，并鑒定那些血管生成素富集的級分。

第五方面的方法倚賴使用電場根據(jù)蛋白的電泳遷移率或等電點來分離混雜蛋白群。所述技術(shù)還倚賴在無載體介質(zhì)即無固定相(或固體支持材料)的液體(水性)介質(zhì)中分離蛋白，以最小化由吸收造成的樣品損失。這一技術(shù)通常稱為自由流動電泳。

第五方面的一種方法可在由相互平行且間隔狹窄的兩塊板構(gòu)成的電泳箱中進行。所述板的側(cè)面有兩個電極(陽極和陰極)，所述電極在所述兩塊板之間產(chǎn)生高壓電場。一種通常稱為“分離緩沖液”的緩沖介質(zhì)勻速流過所述箱，其中所述電場的施加方向橫于緩沖介質(zhì)和待純化乳樣品兩者的流動方向。

在第五方面的上下文中，“橫于”是指以一個角度(即不平行)或在一個與其不同的平面上將電流施加在所述緩沖介質(zhì)和乳樣品流。

將待分析的樣品施加于所述電場，并在通風櫥下將所述樣品輸送到兩塊板之間的緩沖介質(zhì)中。帶電顆粒因它們的電荷性質(zhì)而被偏轉(zhuǎn)，從而允許隨后的分離。由于每種蛋白都具有不同的電荷量，因此它們在電場中的電泳遷移率也不同。因此，每種蛋白在所述分離緩沖液中流過所述電泳箱時都結(jié)合所述分離緩沖液的流速發(fā)生偏轉(zhuǎn)并被分離。此方法可用于連續(xù)分離蛋白并因此可用于血管生成素在工業(yè)規(guī)模上的有效分離與純化。

本領域已知多種自由流動電泳技術(shù)，每一種的物類分離模式都是獨特的。例如，物類可根據(jù)它們的PI(等電點聚焦)、凈電荷密度(區(qū)帶電泳)和電泳遷移率(等速電泳、場分布電泳和場流分離)而被分離。

自由流動電泳技術(shù)可以多種模式進行，包括例如連續(xù)模式或短暫停止(間歇)模式。在連續(xù)施加模式中，所述乳樣品被連續(xù)施加于所述箱中，藉此，在整個分離過程中在緩沖介質(zhì)(分離緩沖液)連續(xù)流動并在電場被不間斷施加的情況下，血管生成素與樣品中的其他組分分離。在間歇模式中，所述乳樣品和分離緩沖液被引入所述箱的分離空間或“區(qū)帶”中，然后進行分離過程，其中在施加電場時包括所述樣品的介質(zhì)總體流動被停止從而實現(xiàn)分離。在分離/分級分離所述樣品后，將電場關閉或減小至不起作用，并重新開始總體流動從而驅(qū)動所分級樣品通過所述箱并繼而被收集。

所述自由流動電泳技術(shù)還可在變性條件下進行，例如通過加入脲或本領域已知的合適洗滌劑。本領域技術(shù)人員會理解血管生成素的PI會與其天然狀態(tài)下的PI相似。

第五方面的一種方法可包括上述自由流動電泳技術(shù)中的每一種。優(yōu)選地，血管生成素根據(jù)其PI以連續(xù)模式從所述乳樣品中被分離。

在這點上，如會為本領域技術(shù)人員所理解的，合適的緩沖介質(zhì)即分離緩沖液可包括但不限于：二元緩沖系統(tǒng)(A/B介質(zhì))、市售兩性電解質(zhì)例如(Serva，Germany)、互補多對緩沖系統(tǒng)例如Prolyte分離緩沖液I和II(Becton Dickinson Diagnostics，Germany)以及揮發(fā)性緩沖液系統(tǒng)。此外，由K.Hanning和K.H.Heidrich出版的書籍″Free-flow Electrophoresis″(ISBN 3-921956-88-9)提供了一個適用于自由流動電泳的分離介質(zhì)的列表。

為根據(jù)其PI分離血管生成素，所選擇的緩沖介質(zhì)將適于在所述箱的分離空間中形成pH梯度。在這點上，優(yōu)選Prolyte分離緩沖液I和II。分離緩沖液I含有29％的IEF Prolyte緩沖液2，分離緩沖液II含有17％的Prolyte緩沖液2、50mM HEPES和42mM 6-氨基己酸。

術(shù)語“pH梯度”意指未觀察到分明的pH邊界。在此定義下，對于目的部分，等電點聚焦裝置中的pH梯度圖會顯示為無尖銳轉(zhuǎn)折的較平滑曲線。對于血管生成素的分離，所述梯度優(yōu)選8-11的pH范圍。

第五方面的方法可通過加入穩(wěn)定介質(zhì)和逆流介質(zhì)而改進。例如，可將一種逆流介質(zhì)與在所述電極之間移動的總體分離緩沖液和樣品的連續(xù)流動方向相反的方向加入所述分離空間。

穩(wěn)定介質(zhì)可用于穩(wěn)定由例如合適的二元緩沖系統(tǒng)形成的分離空間內(nèi)的條件。因此一種合適的穩(wěn)定介質(zhì)也用作提供或替換分離空間中離子的“貯庫”。

本文所用的術(shù)語“穩(wěn)定介質(zhì)”是指一種由兩種組分組成的介質(zhì)。第一種組分是一種陰極穩(wěn)定介質(zhì)，第二種組分是一種陽極穩(wěn)定介質(zhì)。所述陰極或陽極穩(wěn)定介質(zhì)可包括一元酸和/或一元堿。本領域技術(shù)人員會理解在所述穩(wěn)定介質(zhì)中形成的離子具有非常低的電泳遷移率。

對于血管生成素的有效分離和純化，一種合適的陽極穩(wěn)定介質(zhì)由100mM硫酸、50mM乙酸、100mM DL-2-氨基丁酸和30mM甘氨酰-甘氨酸組成，而一種合適的陰極穩(wěn)定介質(zhì)由100mM氫氧化鈉、30mM乙醇胺和300mMβ-丙氨酸組成。

進行本發(fā)明的自由流動電泳方法的合適裝置是市售的。例如Becton Dickinson FFE System(BD Diagnostics，Germany)。

優(yōu)選從所述乳樣品中除去脂肪(通常稱為去脂)，然后再將所述乳樣品加至電場；但這種去脂并不是必需的。去脂方法是本領域已知的并且這些方法的實例在下文中有記載。任選地，也可使用本領域已知的方法除去酪蛋白，然后再進行自由流動電泳方法，這些除去酪蛋白方法的實例也在下文有記載。

如果通過微濾或其他膜方法除去酪蛋白，那么將滲透物直接施加于所述自由流動電泳裝置，或者任選地將所述滲透物濃縮后再施加。合適的濃縮方法包括過濾(例如用0.5-10kDa膜的超濾、用150-500Da膜的納米過濾，或只允許水透過膜的逆滲透)，或冷凍干燥，然后重懸浮于可用于自由流動電泳的緩沖液。

優(yōu)選地，先從所述乳樣品中除去脂肪(通常稱為去脂)，然后再進行第三、第四或第五方面的方法。然而這不是必需的。脂肪可以以本領域已知的任何常規(guī)方法除去，包括低速離心、分離或微濾。

可任選地對去脂乳樣品進行另一“處理”步驟，然后再進行第三、第四或第五方面的方法。這一步驟可包括使所述樣品通過陰離子交換柱。這些方法是本領域已知的。例如，陰離子交換柱可填充官能團例如DEAE(二乙胺基乙基)、Q(季銨)、QAE(二乙基-(2-羥丙基)氨基乙基)連接于合適的支持物(例如纖維素、聚丙烯酰胺、葡聚糖、瓊脂糖、二氧化硅或交聯(lián)聚苯乙烯)的樹脂。所述去脂乳樣品可以10CV/h(盡管可使用最快至1000CV/h)的流速通過所述柱直至施加10CV的去脂乳(盡管可使用0.1CV至50CV)?？深A期的是，蛋白例如β-乳球蛋白、α-乳白蛋白和牛血清白蛋白會被除去。色譜樣品中保留的蛋白主要會是乳鐵蛋白(LF)、乳酸過氧化物酶(LP)和免疫球蛋白；然而，血管生成素也會以＜1％w/w蛋白的濃度存在并可被進一步純化。

在第一到第五方面的每個方面的另一實施方案中，先將乳樣品加熱，然后再進行所述方法。加熱乳樣品可降低樣品中乳酸過氧化物酶和其他變性溫度低于血管生成素的蛋白的量并因此提高血管生成素的量。

可分析從第一到第五方面的方法獲得的級分中血管生成素的存在情況并從而確定血管生成素富集的程度。合適的分析步驟包括染色SDS-PAGE的密度計分析以比較血管生成素特異蛋白與任何存在的污染蛋白的條帶豐度；質(zhì)譜例如MALDI-TOF/TOF MS；免疫親和檢測例如蛋白質(zhì)印跡或ELISA；氨基酸分析和測序；陽離子交換色譜法和反相色譜法。這些技術(shù)的每一種都可為本領域技術(shù)人員所知。

第一到第五方面的任一方面的方法均可獨立進行以獲得血管生成素富集產(chǎn)品，或可作為聯(lián)合分級分離方法的一部分納入，在該方法中其他所需的乳產(chǎn)品組分也被分級分離。

可對通過第一到第五方面的任一方面的方法獲得的血管生成素富集產(chǎn)品進行進一步處理以除去殘余的非血管生成素蛋白和/或除去鹽。這被認為對于標準化食品或營養(yǎng)品的生產(chǎn)以及對于醫(yī)藥級血管生成素的制備很重要。這些步驟可通過以下方式實現(xiàn)：陽離子交換色譜法、一或多個額外的自由流動電泳步驟、免疫親和色譜法、膜過濾、理想地超濾，或者本領域已知的等同方法例如透析、電透析、尺寸排阻色譜法、固相萃取、納米過濾或其他已知方法。本領域技術(shù)人員會理解，當血管生成素用于生產(chǎn)食品物質(zhì)或營養(yǎng)品時，其純度不需如生產(chǎn)醫(yī)藥或獸藥組合物所需的那么高。例如，純化至60％水平的血管生成素可被認為是可接受的。

由于血管生成素參與多種生理功能，因此使用本發(fā)明方法富集此蛋白提供了隨后可針對這些功能的蛋白的一種理想和經(jīng)濟的來源。例如純化的蛋白可用于制備食品物質(zhì)、營養(yǎng)品、醫(yī)藥或獸藥產(chǎn)品。

在第一到第五方面的任一方面的另一實施方案中，在所述方法進行之前或進行中將酪蛋白從所述乳樣品中除去。也可在所述方法進行之前或進行中濃縮所述乳樣品中的蛋白。

合適的乳樣品可包括全乳、脫脂乳、酪乳、乳清(例如酸或奶酪/凝乳乳清或者乳或脫脂乳的微濾滲透物)或乳清級分(例如乳清蛋白濃縮物或乳清蛋白分離穿流液)以及初乳。

本領域技術(shù)人員會明了，所述乳樣品可從任何泌乳動物獲得，例如反芻類如奶牛、綿羊、水牛、山羊、牦牛和鹿，非反芻動物包括馬和驢，靈長類例如人，以及單胃類如豬。所述動物可為轉(zhuǎn)基因動物，特別是改良以在其乳中表達比同種野生型動物更多的血管生成素的動物。

在第一到第五方面的任一種方法中，優(yōu)選地使用源于全牛乳——任選地來自在其乳中過表達血管生成素的轉(zhuǎn)基因奶?！拿撝樽鳛槿闃悠?。

此外，已經(jīng)證明在牛乳中，血管生成素在哺乳期的首個1-14天內(nèi)以最高或最濃的量(最多至12mg/升)存在。此后，所述濃度下降至約1-2mg/升的基礎水平。因此，在本發(fā)明方法中優(yōu)選使用在哺乳期的首個14天內(nèi)獲得的牛乳?？紤]到哺乳期較晚期的牛乳中剩余的血管生成素水平，其也可用作富集血管生成素的來源。

術(shù)語“血管生成素富集產(chǎn)品”是指所述產(chǎn)品中存在的血管生成素蛋白：總蛋白的比例高于進行所述方法前乳樣品中存在的比例。對于被認為血管生成素富集的產(chǎn)品，應具有至少2％w/w、至少10％w/w、至少20％w/w、至少30％w/w、至少40％w/w、至少50％w/w、至少60％w/w、至少70％w/w、至少80％w/w、至少90％w/w、至少95％w/w或至少99％w/w的血管生成素含量。

在第一到第五方面方法的上下文中，術(shù)語“產(chǎn)品”并非意圖將本發(fā)明限制于血管生成素富集的最終產(chǎn)品的生產(chǎn)。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的血管生成素富集產(chǎn)品可用作其他產(chǎn)品的生產(chǎn)中的起始或中間產(chǎn)品。

本文所用的術(shù)語“級分”是指所述乳樣品經(jīng)部分純化的部分。

術(shù)語“有效的和商業(yè)可行的”的使用是指與目前采用的富集血管生成素的方法相比低廉并且快速的方法。

可受益于存在血管生成素的典型食品物質(zhì)包括運動營養(yǎng)添加劑、嬰兒食品添加劑或者用于體弱者、疾病患者或老年人的食品添加劑。

本文所用的術(shù)語“營養(yǎng)品”是指一種從食物中(在本文中從乳樣品中)分離或純化的可食用產(chǎn)品，所述產(chǎn)品被證明口服時具有生理益處或?qū)毙曰蚵约膊』驌p傷提供保護作用或緩解作用。因此營養(yǎng)品可以以單獨或者與可食用食品或飲料混合的飲食制品或添加劑的形式存在。

所述食品或營養(yǎng)品組合物可為可溶性粉末、液體或即飲制劑的形式。或者，所述食品或營養(yǎng)品組合物可為固體形式例如即食棒或早餐谷類食品的形式。還可存在各種香料、纖維、增甜劑和其他添加劑。

所述食品或營養(yǎng)品優(yōu)選地具有可接受的感官性質(zhì)(例如可接受的氣味、味道和適口性)，并還可包含選自維生素A、Bl、B2、B3、B5、B6、B1l、B12、生物素、C、D、E、H和K以及鈣、鎂、鉀、鋅和鐵中至少一種的維生素和/或礦物質(zhì)。

所述食品或營養(yǎng)品組合物可以以常規(guī)方式生產(chǎn)；例如，所述組合物可通過將所述蛋白和其他添加劑混合在一起而制備。如果使用，所述混合物中也可包括乳化劑。其他維生素和礦物質(zhì)也可在此時加入但通常在以后加入以避免熱降解。

如果需要生產(chǎn)粉末狀食品或營養(yǎng)品組合物，那么可將所述蛋白與粉末形式的其他組分混合。所述粉末的水分含量應小于約5重量％。然后可混入水，優(yōu)選已進行逆滲透的水，以形成液體混合物。

如果所述食品或營養(yǎng)品組合物將以即食液體形式提供，那么可將其加熱以減少細菌負荷。如果需要生產(chǎn)液體食品或營養(yǎng)品組合物，那么優(yōu)選將所述液體混合物無菌地灌裝到合適的容器中。所述容器的無菌灌裝可使用本領域常用的技術(shù)進行。進行這種無菌灌裝的合適裝置是市售的。

通過本發(fā)明方法獲得的血管生成素富集產(chǎn)品也可被制劑為適于對患者給藥的醫(yī)藥組合物或獸藥組合物。

優(yōu)選地，所述組合物還可包括一種或多種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑。這種組合物可包括緩沖液例如中性緩沖鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖；甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化劑；螯合劑例如EDTA；佐劑和防腐劑。本發(fā)明組合物可被制劑用于靜脈內(nèi)給藥、局部涂敷或口服。

本文所用的術(shù)語“受試者”是指患有需要用藥物活性劑治療或預防的疾病的任何動物。所述受試者可為哺乳動物優(yōu)選人，或可為非人靈長類或非靈長類動物，例如用于動物模型試驗的那些。

盡管特別考慮了所述血管生成素富集產(chǎn)品適用于人的醫(yī)學治療，然而其也適于獸醫(yī)學治療，包括對寵物例如狗和貓、家畜例如馬、矮種馬、驢、騾子、美洲駝、羊駝、豬、牛和綿羊，或動物園動物例如非人靈長類、貓科動物、犬科動物、?？苿游锖陀刑泐惖闹委煛?/p>

所述血管生成素富集產(chǎn)品可以以適合待治療和/或預防的疾病的方式對受試者給藥。給藥量和頻率可由諸如受試者的身體情況以及受試者疾病的類型和/或嚴重程度的因素確定。合適的劑量還可通過臨床試驗確定。所述組合物的有效量可由醫(yī)生考慮受試者在年齡、體重、疾病嚴重程度、身體情況的個體差異，給藥途徑以及與受試者的治療有關的任何其他因素而確定?；旧?，所述組合物的“有效量”是足以獲得所需治療效果的量。

在另一方面，本發(fā)明提供用于治療和/或預防疾病的方法。所述治療方法包括給予受試者有效量的上述營養(yǎng)品、醫(yī)藥組合物或獸藥組合物。優(yōu)選地，所述疾病包括由病毒、細菌或真菌以及它們的毒素所導致的那些疾病。然而由于血管生成素在血管發(fā)生中起作用，因此需要血管生成素刺激的疾病也可使用本發(fā)明含血管生成素的組合物治療。這些疾病包括冠狀動脈疾病、中風、肢體缺血疾病和創(chuàng)傷愈合遲緩。

本文所用的術(shù)語“治療”和“療法”是指減輕癥狀的嚴重程度和/或頻率、消除癥狀和/或根本病因、防止癥狀的發(fā)生(預防)和/或其根本病因的發(fā)生，以及改善或矯正損傷。因此，例如，本發(fā)明的“治療”疾病的方法包括在易患個體中預防疾病以及在呈現(xiàn)臨床癥狀的個體中治療疾病。

本文所用的“治療”涵蓋對脊椎動物、哺乳動物特別是人類的病癥的任何治療或預防，并包括：抑制病癥，即中止其發(fā)展；或緩解或改善所述病癥的影響，即，使所述病癥的影響減弱。

本文使用的“預防”或“預防的”或“預防性的”療法包括在易患所述病癥但尚未被診斷為患有該病的受試者中防止所述病癥發(fā)生或改善所述病癥的繼續(xù)發(fā)展。

在整個說明書通篇中，除非上下文另有規(guī)定，否則詞語“包含”或者變化形式例如“包括”或“含有”應理解為意指包括所述元素或整數(shù)或者元素或整數(shù)的集合，但并不排除任何其他元素或整數(shù)或者元素或整數(shù)的集合。

必須指出的是，除非上下文另有清楚的指明，否則本說明書所用的單數(shù)形式(″一″、″一個″和″所述″)也包括復數(shù)方面。

本領域技術(shù)人員會明了，盡管出于清楚和理解的目的已在某些細節(jié)上對本發(fā)明進行了描述，然而可對本文所述實施方案和方法作出各種改變和變化而不背離本說明書公開的本發(fā)明構(gòu)思的范圍。

實施例現(xiàn)在參照以下實施例進一步詳細描述本發(fā)明。除非另有指明，否則提供所述實施例只是出于舉例說明的目的，而非意圖限制。因此，本發(fā)明包括因本文提供的教導而顯而易見的任何和所有變化方案。

實施例1：使用第一和第二方面的方法(免疫親和色譜法)從脫脂乳獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法

現(xiàn)有技術(shù)已對免疫親和色譜方法進行了廣泛地描述，但不是在血管生成素純化的背景下(參見例如Subramanian A，2002，Molecular Biotechnology，20：41-47)。

本發(fā)明申請人已經(jīng)證明，現(xiàn)在血管生成素可使用本文公開的方法從乳樣品中提取。

本實施例中采用的免疫親和色譜方法是使用來自合適來源例如Monash Antibody Technology Facility，Australia的血管生成素單克隆抗體進行的。

用SP Sepharose Big Beads(GE Healthcare)填充10cm深的柱從而使該柱的總床體積為29.7L。向該柱中以331cm/h(每小時每升樹脂34升脫脂乳)的線性流速施加脫脂牛乳流2小時，直至施加的脫脂乳的體積為裝入該柱的樹脂體積的68倍。

通過以147cm/h的流速(每小時每升樹脂15升緩沖液)加入2.5倍柱體積(CV)的水或者以0.25CV/分鐘的流速加水10分鐘而除去該柱中保留的乳。

在本實施例中采用的免疫親和色譜方法是使用血管生成素的單克隆抗體進行的。此處使用的抗牛血管生成素抗體為得自Department of Biochemistry，Chungbuk National University，Cheongju，Chungbuk，Korea的克隆號為1B14D4的單克隆抗體。此處使用的抗人血管生成素抗體為克隆號為14017的單克隆抗體(R&D systems Incorporated)。

所述固體支持物為Dynabeads Protein G(Invitrogen)。使用以下方案使所述血管生成素抗體共價偶聯(lián)于所述小珠。通過簡單震蕩20秒準備所述Protein G Dynabeads用于親和純化。震蕩后，從儲液(Invitrogen)中取出50μL的重懸浮IgG Dynabeads。使用磁性架(magnet stand)使所述Protein G Dynabeads沉淀1分鐘。除去上清液，然后用200μL W&B緩沖液(含有0.01％Tween 20的0.1M磷酸鈉緩沖液，pH 8.2)洗滌。重復此過程。將含有約5μg牛或人抗血管生成素小鼠單克隆抗體的W&B緩沖液(200μL)加入所述Protein G Dynabeads。將此溶液在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育10分鐘。將所述Protein G Dynabeads沉淀，除去上清液。用200μL W&B緩沖液洗滌IgG標記的Protein G Dynabeads。將所述IgG標記的Protein G Dynabeads沉淀，除去上清洗滌緩沖液。重復此洗滌步驟。為洗脫牛血管生成素，使用變性條件。將吸附有牛血管生成素的IgG標記的Protein G Dynabeads重懸浮于20μL 1x NuPAGE LDS樣品緩沖液(Invitrogen；含有2％十二烷基硫酸鋰和2-巰基乙醇)中并在70℃加熱10分鐘。將所述Dynabeads置于磁鐵上，除去樣品并裝入1-D凝膠進行蛋白染色(圖1)和蛋白質(zhì)印跡分析(圖2)。

實施例2a：使用第三方面的方法(超濾)從脫脂乳獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法

將牛脫脂乳施加于填充以SP(磺丙基)Sepharose的柱直至所施加的乳體積為填充到所述柱中的樹脂體積的70倍(可施加最多至1000CV)。用6CV的水(低離子強度緩沖液，＜0.008M NaCl或等價物)洗滌10分鐘以除去所述柱中保留的乳。用6CV含有相當于0.4-0.5M NaCl，最優(yōu)選0.4M NaCl的鈉離子(盡管其他陽離子也適合)的緩沖液從所述柱中洗脫含有乳清生長因子的級分。范圍為5.5-7.5的pH提供最高的WGFE產(chǎn)量。在配有5kDa膜的超濾裝置中通過滲濾將WGFE脫鹽，并通過冷凍干燥干燥。

將WGFE(1g)溶解于50mL含有0.2％Triton X-100的水中。將所述溶液施加于具有30kDa分子量截止值的膜(Viva Spin)上并在20℃下以8000×g離心1.5小時。

滲透物和保留物中的蛋白濃度使用2D-Quant試劑盒(GE Healthcare)測定。使用5倍體積的冰冷的丙酮沉淀蛋白并通過以10,000×g離心20分鐘收集滲透物和保留物的沉淀。將所述沉淀重懸浮于含有7M脲、2M硫脲、1.2％CHAPS、0.4％ASB-14、10mM Tris HCl和0.05％載體兩性電解質(zhì)的2D-電泳緩沖液中。使用三丁膦還原蛋白并用丙烯酰胺單體烷基化。將蛋白(100μg)上樣到24cm、pH 3-11的非線性IPG條(GE Healthcare)并再水化過夜。

等電點聚焦使用100V 2小時，500V 2小時，1000V 2小時，在4小時內(nèi)線性增加至8000V，最后8000V 8小時。將IPG條在含有8M脲、2％SDS的平衡緩沖液中平衡15分鐘，然后使用50V進行SDS PAGE電泳1小時，繼而以150V電泳12小時。將凝膠在乙酸/甲醇/水(1∶3∶6)中固定并用Sypro Ruby(Invitrogen)染色過夜。使用ProXpress成像系統(tǒng)(Perkin Elmer)抓取圖像(圖3)。觀察到所述滲透物富含血管發(fā)生素，如圖3圓圈內(nèi)的條帶所表明的，并且污染蛋白的含量明顯下降。

實施例2b：使用第三方面的方法(超濾)從脫脂乳獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法

含有生長因子的乳清級分以與實施例2a中相同的方法制備。

將含有生長因子的乳清級分(2.5g)加入95g水中并以250rpm搖動30分鐘以得到2.5％w/w的溶液。將所述溶液(15g)置于4個Vivaspin 20(GE Healthcare)離心機驅(qū)動的超濾裝置(10kDa、30kDa、50kDa和100kDa)中。將管以4000×g離心10分鐘，這導致大約2mL滲透物通過所述膜。

通過SDS PAGE分析所述溶液和超濾滲透物。將每個樣品(100μL)與100μL Tris-tricine樣品緩沖液(NuSep，F(xiàn)renchs Forest，Australia)混合。從每個樣品中取蛋白(10μL)施加于Tris-tricine PAGE凝膠(16％丙烯酰胺，NuSep)，以150V分離90分鐘并用Coomassie Blue(NuSep)染色。結(jié)果示于圖4。現(xiàn)有技術(shù)已通過質(zhì)譜表明在未分級分離的WGFE中存在的14kDa峰為血管生成素(PCT/AU2007/001719“制備血管生成素的方法”，圖2)。與血管生成素大小相同的條帶被發(fā)現(xiàn)代表在50kDa滲透物和100kDa滲透物中存在的主要蛋白。10kDa滲透物和30kDa滲透物中不存在血管生成素。現(xiàn)有技術(shù)已證明血管生成素可通過30kDa膜，因此此結(jié)果意料不到并很可能是異常的。

實施例3：根據(jù)第四方面(尺寸排阻色譜法)從脫脂乳獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法

含有生長因子的乳清級分以與實施例2a相同的方法制備。

將乳清生長因子(5g)加入45g水中并以250rpm搖動30分鐘以生產(chǎn)10％w/w溶液。通過離心(15000×g，6分鐘)和過濾(0.45μm注射器驅(qū)動的過濾器)使所述WGFE溶液澄清。以3.5mL/min的流速用50mM Na₂HPO₄(pH7.0)平衡三個尺寸排阻色譜柱(Sephacryl S-100HR 26/60、Sephacryl S-300HR 26/60和Superose 1226mmD×600mmL[全部由GE Healthcare制造])。將蛋白溶液置于50mL Superloop(GE Healthcare)中，然后向每個柱上泵入5mL WGFE溶液。通過以3.5mL/min的流速將50mM Na₂HPO₄(pH 7.0)泵過所述柱而分離所述WGFE溶液。在280nm(藍線)監(jiān)測洗脫液并收集10mL級分(灰線表示每種級分的開始)，如圖5-7所示。

合并相似蛋白的樣品并通過BCA測定法(Pierce，Rockford，IL)估算蛋白濃度。將蛋白濃度不足(＜1mg/mL)的樣品在5kDa Vivaspin 20離心機驅(qū)動的超濾裝置(GE Healthcare)中濃縮直至所述蛋白濃度大于1mg/mL。將每個樣品(100μL)與100μL Tris-tricine樣品緩沖液(NuSep)混合。從每個樣品中取蛋白(0.02mg)施加于Tris-tricine PAGE凝膠(16％丙烯酰胺，NuSep)，以150V分離90分鐘并用Coomassie Blue(NuSep)染色?，F(xiàn)有技術(shù)已通過質(zhì)譜表明在未分級分離的WGFE中存在的14kDa峰為血管生成素(PCT/AU2007/001719“制備血管生成素的方法”，圖2)。在S-100HR合并液D(圖8)、S-300HR合并液C和Superose 12合并液B(圖9)中發(fā)現(xiàn)了與血管生成素大小相同的峰。

樣品還通過陽離子交換HPLC分析。將樣品(100μL)施加于已用緩沖液A(50mM NaH₂PO₄·H₂O和5％[v/v]乙腈[pH7.0])平衡的Mono S 5/50GL柱(GE Healthcare)。然后用逐漸增加量的緩沖液B(50mM NaH₂PO₄·H₂O和2M NaCl[pH 7.0])洗脫樣品(表1)。在220nm、280nm和450nm監(jiān)測洗脫液。當通過此方法分析時，之前已通過HPLC和隨后的質(zhì)譜證明血管生成素的保留時間為5.8±0.1分鐘；因此將保留時間相同的峰推定為血管生成素并對其定量(表2)。

表1.陽離子交換HPLC的HPLC泵方案

表2.通過陽離子交換HPLC確定的以蛋白百分比表示的血管生成素純度

已證明尺寸排阻色譜法是一種從乳清生長因子提取物中分離血管生成素的合適方法。證明了Sephacryl S-100HR、Sephacryl S-300HR和Superose 12是合適的，說明大多數(shù)SEC樹脂是合適的。含有高于55％的血管生成素的血管生成素富集級分可通過SEC獲得。此純度可通過額外的純化步驟進一步提高。

實施例4：根據(jù)第五方面(溶液內(nèi)等電點聚焦)從脫脂乳獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法

現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)廣泛描述了溶液內(nèi)等電點聚焦方法，但不是在血管生成素純化的背景下(參見例如Michel P et al.，2003，Electrophoresis；24，3-11)。

本發(fā)明申請人已經(jīng)證明，現(xiàn)在血管生成素可使用本文公開的方法從乳樣品中提取。

在此實施例中采用的溶液內(nèi)等電點聚焦(ISIEF)方法是使用IsoelectrIQ²(Proteome Systems Limited，Australia)進行的。分級分離在天然(水性)或變性條件下(包括變性劑例如脲)進行。

還加入Prolyte(BD Diagnostics，Germany)或其他電解質(zhì)(酸或堿)以形成pH梯度。分離梯度的一個實例如下：

樣品增溶溶液(sample solubilisation solution，SSS)：7M脲、2M硫脲和1％3-羥丙基二甲基氨基丙磺酸3-(4-庚基)苯酯(C7BzO)。

將乳蛋白稀釋于10倍體積的SSS中并加入5mM三丁膦和5mM乙二胺四乙酸，然后立即進行ISIEF分離。使用pH 3.0、5.0、6.5、8.0和11.0的膜(Proteome Systems Limited，Australia)建立如下樣品分離箱：pH 3.0-5.0、pH 5.0-6.5、pH 6.5-8.0和pH 8.0-11。將電極溶液(5mL，由供應商提供)用于陽極和陰極端，并向pH 5.0-6.5箱中加入5mL的重懸浮于SSS的乳蛋白。向其他箱中加入SSS(5mL)。電泳在14℃下以100V的恒壓進行2小時，在6小時間逐漸升高至1500V，然后以1500V的恒壓進行8小時。收集每箱中的溶液。從分離箱(pH 8.0-11)的陰極端收集血管生成素富集的級分。

通過二維SDS-PAGE并根據(jù)廠商說明以SYPRO Ruby染色來確認血管生成素的存在。例如，用另外的SSS將相當于40μg的每種蛋白級分的40μg的等份試樣稀釋至128μl。向每個樣品中加入兩性電解質(zhì)溶液(0.6μl，pH 3-11)和DeStreak溶液(GE Healthcare)。將稀釋的樣品移液至7cm、pH 3-11的NL IPG條(GE Healthcare)下并使該IPG條重水化過夜。等電點聚焦使用以下方案：500V 1小時、1000V 1小時，在1小時間逐漸升高至5000V，然后5000V 2小時。從等電點聚焦裝置中取出IPG條，并在每10mL EB含有100mg二硫蘇糖醇的平衡緩沖液(EB；6M脲、2％十二烷基硫酸鈉、20％甘油、50mM Tris HCL(pH 8.8)、0.01％溴酚藍)中孵育15分鐘，然后在每10mL EB含有250mg碘代乙酰胺(iodoacetamice)的EB中再孵育15分鐘。將還原的并烷基化的IPG條上樣到SDS PAGE凝膠(可來自供應商，例如Invitrogen Novex的預制Tris HCl凝膠)上，并通過覆蓋以含有1.0％瓊脂糖的熱電泳緩沖液(Tris堿3.03g/L、甘氨酸14.4g/L和SDS 1.0g/L)，然后使其冷卻而將所述IPG條封蓋在所述凝膠上。將所述凝膠置于SDS PAGE裝置中并將電泳緩沖液置于該裝置的底倉和頂倉中。電泳以200V進行1小時。電泳后，使用固定/脫色溶液(10％甲醇和7％乙酸)將蛋白固定在凝膠內(nèi)，然后用Sypro Ruby(Invitrogen)染色至少1小時。將凝膠在固定/脫色溶液中脫色至少1小時，然后在凝膠掃描系統(tǒng)上成像。通過對圖像進行可視分析來確定級分的純度，藉此評估級分中每點的強度和體積。

圖10示出了pH 8-11的含有低分子量(約15kDa)堿性蛋白的級分(pI約10.0)。此蛋白代表此級分中大約80％的總蛋白，現(xiàn)有技術(shù)已將此蛋白確定為血管生成素(PCT/AU2007/001719“制備血管生成素的方法”，圖2)。圖10示出了對pH 8-11級分中的堿性蛋白與該乳級分中的其他蛋白的解析。

實施例5：熱對獲得血管生成素富集產(chǎn)品的方法的作用

含有生長因子的乳清級分以與實施例2a相同的方法制備。

將含有生長因子的乳清級分(2.5g)加入95g水中并以250rpm搖動30分鐘以得到2.5％w/w的溶液。將所述溶液(10g)置于15mL的玻璃試管中并置于加熱至80℃的水浴中。用溫度探針監(jiān)測該試管內(nèi)液體的溫度。所述溶液迅速達到70℃并在所述水浴中再保留1分鐘(最高溫度75℃)。從所述熱水浴中取出該試管并在裝有自來水的燒杯中冷卻。

將所述溶液轉(zhuǎn)移到10mL離心管中，以3000×g離心7分鐘并過濾(0.45μm)上清液。通過SDS PAGE分析濾出液。從每個樣品中取蛋白(0.001mg WGFE，加熱時濾出液少于0.025mg沉淀)施加于Tris-tricine PAGE凝膠(16％丙烯酰胺，NuSep)，以150V分離90分鐘并用Coomassie Blue(NuSep)染色?，F(xiàn)有技術(shù)已通過質(zhì)譜表明在未分級分離的WGFE中存在的14kDa峰為血管生成素(PCT/AU2007/001719“制備血管生成素的方法”，圖2)。發(fā)現(xiàn)在加熱WGFE的濾出液中存在與血管生成素大小相同的條帶。加熱富集了血管生成素。在WGFE(泳道10)中，乳酸過氧化物酶是主要蛋白，而加熱WGFE產(chǎn)生其中血管生成素與乳酸過氧化物酶以相同比例存在的樣品(泳道2和3)，見圖4。本領域技術(shù)人員會理解，先進行加熱步驟再進行第一到第五方面特別是第三到第五方面的任何方法應該會增加所述富集產(chǎn)品中血管生成素的純度。

本領域技術(shù)人員會明了，在每個實施例中描述的血管生成素制備方法可擴大用于商業(yè)目的，并可在進行第一到第五方面的任一方面的方法之前或之后結(jié)合以其他純化步驟以獲得醫(yī)藥級純度的血管生成素。