專(zhuān)利名稱(chēng)：：治療癌癥的促血管生成素-2拮抗劑和VEGF-A、KDR和/或FIt1的拮抗劑的組合的制作方法治療癌癥的^iii管生成素-2拮抗劑和VEGF-A、KDR和/或Fltl拮抗劑的組合本發(fā)明涉及具有抗血管生成活性并因此可用于治療與動(dòng)物或人體中的血管發(fā)生有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法的組合物。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑的組合，以及這種拮抗劑的用途。這種組合還可用于治療與促血管生成素-2及VEGF-A和/或KDR和/或Fltl的活性有關(guān)的疾病。血管發(fā)生，即從現(xiàn)有血管系統(tǒng)形成新血管，是幾乎所有的器官的形成和生理功能所需的復(fù)雜生物過(guò)程。它是胚胎發(fā)生、正常生理生長(zhǎng)、修復(fù)和病理過(guò)程如腫瘤擴(kuò)展的必需要素。通常，血管發(fā)生受到涉及內(nèi)皮細(xì)胞所致的血管萌發(fā)、分支和小管形成(涉及到諸如內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的激活、血管去穩(wěn)定化、降解酶的合成和釋放、EC遷移、EC增殖、EC組織化和分化及血管成熟的過(guò)程)的多步驟過(guò)程中的血管發(fā)生因子和血管發(fā)生抑制因子的局部平衡的嚴(yán)密調(diào)節(jié)。在成人中，生理性血管發(fā)生主要限于創(chuàng)傷愈合和女性生殖功能和胚胎發(fā)育的幾種情形(component)。在疾病相關(guān)性血管發(fā)生中，包括任何異常的、不需要的或病理性的血管發(fā)生，血管發(fā)生因子和血管發(fā)生抑制因子的局部平衡受到異常調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)暮?或結(jié)構(gòu)上異常的血管形成。已將病理性血管發(fā)生與包括糖尿病性牙見(jiàn)網(wǎng)膜病、牛皮癬、癌癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣化、卡波濟(jì)氏肉瘤和血管瘤在內(nèi)的疾病狀態(tài)關(guān)聯(lián)起來(lái)(Fanetal，1995,TrendsPharmacology.Science.16:57-66;Folkman,1995，NatureMedicine1:27-31)。在癌癥中，大于1-2mm3的原發(fā)性和繼發(fā)性腫瘤需要血管發(fā)生(Folkman,J.NewEnglandJournalofMedicine1995;33，1757-1763)。已有許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被指牽涉到血管發(fā)生的調(diào)節(jié)，有多種因子是體外EC應(yīng)答和體內(nèi)血管生長(zhǎng)的已知調(diào)節(jié)劑。受體酪氨酸激酶(RTKs)是將生化信號(hào)跨細(xì)胞的質(zhì)膜傳輸?shù)闹匾f質(zhì)。這些跨膜分子特征性地由胞外配體結(jié)合域通過(guò)質(zhì)膜中的區(qū)段(segment)與胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域連接而組成。配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體相關(guān)酪氨酸激酶活性受到刺激，而這又導(dǎo)致受體和其它胞內(nèi)分子上的酪氨酸殘基被磷酸化。這些酪氨酸磷酸化方面的變化引發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，從而導(dǎo)致多種細(xì)胞應(yīng)答。到目前為止，已鑒定出至少19個(gè)由氨基酸序列同源性確定的獨(dú)特RTK亞家族。VEGF被認(rèn)為是正常血管發(fā)生和疾病相關(guān)性血管發(fā)生(Jakeman，etal.1993Endocrinology:133,848-859;Kolch,etal.1995BreastCancerResearchandTreatment:36，139國(guó)155)和血管通透性(Connolly,etal.1989J.Biol.Chem:264,20017-20024)的重要刺激劑。通過(guò)用抗體隔絕VEGF來(lái)拮抗VEGF作用，能導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)受到抑制(Kim，etal.1993Nature:362,841-844)。VEGF基因的雜合破壞(heterozygousdisruption)導(dǎo)致致命性的血管形成(vascularisation)不足(Carmeliet，etal.1996Nature380:435-439;Ferrara，etal.1996Nature380:439-442)。VEGF是已知最強(qiáng)效和普遍的血管生長(zhǎng)因子。在VEGF的角色被鑒定為分泌的針對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的促細(xì)胞分裂原之前，它被鑒定為血管通透性因子，突出了VEGF控制內(nèi)皮細(xì)胞行為的許多獨(dú)特方面(包括增殖、遷移、特化和存活)的能力(Ruhrberg,2003BioEssays25:1052-1060)。VEGF也稱(chēng)VEGF-A,是屬于待鑒定的血小板衍生生長(zhǎng)因子超家族的結(jié)構(gòu)相關(guān)二聚糖蛋白的VEGF家族的第一個(gè)成員。除了這個(gè)開(kāi)創(chuàng)性成員(foundingmember)外，VEGF家族還包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PIGF)和內(nèi)分泌腺"f汙生的VEGF(EG-VEGF)'。VEGF的活性形式是作為同型二聚體合成，或者作為與其它VEGF家族成員的異型二聚體合成。VEGF-A以交替剪接所產(chǎn)生的六種同種型存在VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF則和VEGF206。這些同種型主要差別在于它們的生物利用度，其中VEGFi65是最主要的同種型(Podar,etal.2005Blood105(4):1383-1395)。在胚胎發(fā)生過(guò)程中剪接受到調(diào)節(jié)從而產(chǎn)生出階段和組織特異性比例的各種同種型，這為內(nèi)皮細(xì)胞響應(yīng)VEGF的獨(dú)特和背景依賴(lài)性(contextdependent)行為創(chuàng)造了巨大的潛力。VEGF家族的成員已知能以不同的親和力結(jié)合三種相關(guān)的受體酪氨酸激酶VEGFR1(fms樣酪氨酸激酶受體，F(xiàn)it或Fltl)、VEGFR2(含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體，KDR(也稱(chēng)Flk-l))和VEGFR3(另一種fms樣酪氨酸激酶受體，F(xiàn)lt4)。這些相關(guān)RTKs中的兩種即Fltl和KDR已被證實(shí)能以高親和力結(jié)合VEGF(DeVriesetal,1992,Science255:989-991;Te醒netal，1992，Biochem.Biophys.Res.Comm.1992,187:1579-1586)。已將VEGF與異源細(xì)胞中表達(dá)的這些受體的結(jié)合與細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化狀態(tài)和鉤運(yùn)轉(zhuǎn)的變化關(guān)聯(lián)起來(lái)。敲除小鼠研究已證實(shí)，F(xiàn)ltl或KDR的破壞會(huì)導(dǎo)致急性血管缺陷所致的孕中期死亡。但是，表現(xiàn)型卻是不同的；KDR的不足會(huì)導(dǎo)致EC和發(fā)育中的造血系統(tǒng)的缺乏(Shalaby，etal.1995Nature376:62-66),Fltl的不足不會(huì)影響造血祖細(xì)胞和EC,但這些細(xì)胞不能裝配成功能性血管(Fong,etal.1995Nature376:66-70)。Flt4在胚胎中得到廣泛表達(dá)，之后在成人中局限于淋巴血管。Flt4敲除小鼠證實(shí)Flt4在心血管系統(tǒng)的早期發(fā)育中、在初級(jí)血管網(wǎng)絡(luò)重塑和成熟為更大血管中的必要角色(Dumont,etal.1998Science282:946-949)。除了VEGF家族外，促血管生成素也^皮認(rèn)為涉及血管發(fā)育和出生后血管發(fā)生。促血管生成素包括天然激動(dòng)劑即促血管生成素-l及天然拮抗劑即促血管生成素-2。促血管生成素-1的角色據(jù)認(rèn)為在成人中是保守的，在成人中促血管生成素-1得到廣泛地和組成型地表達(dá)(Hanahan,^SWe,，277:48-50(1997);Zagzag,"a/.,~A^wra/o^,159:391-400(1999))。相反，促血管生成素-2表達(dá)主要限于血管重塑部位，促血管生成素-2被認(rèn)為在該部位能阻斷促血管生成素-1的組成型穩(wěn)定化或成熟化功能，讓血管回復(fù)到和保持在可能對(duì)萌發(fā)信號(hào)更具響應(yīng)性的塑性狀態(tài)(Hanahan,1997;Holash""/.,O"coge"e18:5356-62(1999);Maisonpierre,1997)。對(duì)疾病相關(guān)血管發(fā)生中的促血管生成素-2表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)了許多腫瘤類(lèi)型能顯示血管促血管生成素-2表達(dá)(MaisonpierreC5We膨277:55-60(1997))。功能研究提示了促血管生成素-2涉及腫瘤血管發(fā)生，并將促血管生成素-2過(guò)量表達(dá)與小鼠異種移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)增加關(guān):^來(lái)(Ahmad，W"/.，及"'，61:1255-1259(2001))。其它的研究也將促血管生成素-2過(guò)量表達(dá)與胂瘤血管過(guò)多性(hypervascularity)關(guān)聯(lián)起來(lái)(Etoh,efa/"61:2145-53(2001);Tanaka"a/.，G3"c^及仏62:7124-29(2002))。Valenzuelaetal.(1999)使用基于同源性的克隆方法鑒定了2種新型促血管生成素小鼠中的促血管生成素-3和人體中的促血管生成素-4。盡管與促血管生成素-1和促血管生成素-2的小鼠和人變型之間的差異相比，促血管生成素-3和促血管生成素-4在結(jié)構(gòu)上相互間差異更大，但它們似乎代表著相同基因座的小鼠和人對(duì)等物(counterpart^對(duì)促血管生成素家族的這些成員的生物學(xué)特性知之甚少。例如，促血管生成素-4只在肺中高水平表達(dá)，但在文獻(xiàn)中見(jiàn)不到促血管生成素-4所激活的生物作用或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Tsigkos，etal.,ExpertOpin.Investig.Drugs12(6):933-941(2003);Valenzuela,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.96:1904-1909(1999))。促血管生成素-4表達(dá)水平已知能響應(yīng)低氧而增力口，且內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子會(huì)導(dǎo)致成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系和內(nèi)皮細(xì)胞中的促血管生成素-4表達(dá)水平提高。但是，表達(dá)調(diào)節(jié)的機(jī)制以及所產(chǎn)生的對(duì)生理性和疾病相關(guān)性血管發(fā)生的作用未知(Lee，etal.,FASEBJ.18:1200-1208(2004)。促血管生成素最初是作為在血管內(nèi)皮當(dāng)中選擇性表達(dá)的Tie受體酪氨酸激酶家族的配體被發(fā)現(xiàn)(Yancopoulos&"/.,A^we4(K7:242-48(2000)。促血管生成素-1、促血管生成素-2、促血管生成素-3和促血管生成素-4主要結(jié)合Tie-2受體，因此也稱(chēng)為T(mén)ie-2配體。促血管生成素-1與Tie-2的結(jié)合，會(huì)引發(fā)通過(guò)自身磷酸化進(jìn)行的受體的酪氨酸磷酸化和隨后的通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行的對(duì)其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化(Maisonpierre,P.etal.1997Science:277，55-60)。促血管生成素-2是促血管生成素-1的天然拮抗劑，通過(guò)對(duì)促血管生成素-1誘導(dǎo)的Tie-2受體的激酶激活的竟?fàn)幮砸种破鹱饔?Hanahan,1997;DavisWa/.,Ce〃87:1161-69(1996);Maisonpierre&a/"5We"ce277:55-60(1997))。對(duì)Tie-2和促血管生成素-1進(jìn)行的敲除小鼠研究證實(shí)了類(lèi)似的表現(xiàn)型，提示促血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化能介導(dǎo)發(fā)育中的血管的重塑和穩(wěn)定化，從而促進(jìn)血管發(fā)生過(guò)程中的血管成熟和內(nèi)皮細(xì)月包支持細(xì)胞黏附的維持(Dumont&(ewas<§:Deve/o/wewf,8:1897-1909(1994);Sato，A^wre,376:70-74(1995);(Thurston,G.etal.,2000NatureMedicine:6,460-463))。在最近幾年，已將促血管生成素-l、促血管生成素-2和/或Tie-2提i義為可能的抗癌治療靶標(biāo)。例如，US6166185、US5650490和US5814464各自公開(kāi)了抗Tie-2配體和受體的抗體。用可溶性Tie-2進(jìn)行的研究據(jù)報(bào)道降低了嚙齒動(dòng)物中的腫瘤數(shù)量和大小(Lin,1997;Lin1998)。Siemesteretal.(1999)產(chǎn)生了表達(dá)Tie-2的胞外結(jié)構(gòu)域的人黑素瘤細(xì)胞系，并將這些細(xì)胞系注射到棵鼠中，報(bào)道說(shuō)可溶性Tie-2導(dǎo)致了腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤血管發(fā)生受到顯著抑制。鑒于促血管生成素-1和促血管生成素-2都能結(jié)合Tie-2，從這些研究并不清楚促血管生成素-1、促血管生成素-2和/或Tie-2是否會(huì)成為引人注目的抗癌療法靶標(biāo)。但是，有效的抗^i管生成素-2療法被認(rèn)為在治療諸如癌癥的疾病上是有益的，這些疾病的*依賴(lài)于異常血管發(fā)生，阻斷這個(gè)過(guò)程能阻止疾病發(fā)展(Folkman,J.，iVafweMecfc/"e.1:27-31(1995)。另外，一些研究小組報(bào)道了使用能結(jié)合促血管生成素-2的抗體，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,166,185和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)說(shuō)明書(shū)2003/0124129Al。對(duì)促血管生成素-2的局灶表達(dá)(focalexpression)的作用的研究證實(shí)，拮抗促血管生成素-l/Tie-2信號(hào)能松開(kāi)緊密的血管結(jié)構(gòu)，從而使EC暴露于來(lái)自血管發(fā)生誘導(dǎo)物如VEGF的激活信號(hào)(Hanahan,1997)。這一由對(duì)促血管生成素-1的抑制產(chǎn)生的促血管發(fā)生作用表明抗促血管生成素-1療法不會(huì)成為有效的抗癌治療法。國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO200197850描述了對(duì)VEGF/VEGF受體系統(tǒng)和促血管生成素/Tie受體系統(tǒng)進(jìn)行組合功能干擾，以抑制血管形成和抑制腫瘤生長(zhǎng)。該申請(qǐng)范圍廣泛，包括對(duì)VEGF八^EGF受體系統(tǒng)和促血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的任何組分(component)的功能干擾的任何可以想到的組合；也就是說(shuō)'Fltl、KDR、Flt4、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF或EG-VEGF中的任何一個(gè)與對(duì)促血管生成素-1、促血管生成素-2、促血管生成素-3、促血管生成素-4或Tie-2中的任何一個(gè)的功能干擾的組合。該申請(qǐng)?zhí)岢?，功能干擾可通過(guò)以下方面來(lái)實(shí)現(xiàn)i)能抑制受體酪氨酸激酶活性的化合物，ii)能抑制配體與受體的結(jié)合的化合物，m)能抑制受體的胞內(nèi)途徑的激活的化合物，iv)能抑制或激活配體的表達(dá)或者VEGF或Tie受體系統(tǒng)的受體的表達(dá)的化合物，v)能通過(guò)識(shí)別VEGF/VEGF受體系統(tǒng)或促血管生成素/Tie受體系統(tǒng)將細(xì)胞毒性劑或凝結(jié)誘導(dǎo)劑靶向內(nèi)皮的遞送系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和力結(jié)合寡核苷酸或寡肽或者脂質(zhì)體5或vi)^皮耙向內(nèi)皮并誘導(dǎo)壞死或凋亡的遞送系統(tǒng)，如抗體、配體、高親和力結(jié)合寡核苷酸或寡肽或者脂質(zhì)體。為進(jìn)一步擴(kuò)大提出本申請(qǐng)的保護(hù)范圍，該申請(qǐng)還規(guī)定，被該發(fā)明的各個(gè)組合所包含的化合物可以是小分子量物質(zhì)、寡核苷酸、寡肽、重組蛋白質(zhì)、抗體或者它們的綴合物或融合蛋白。盡管包括眾多的任選組合，但并沒(méi)有教導(dǎo)具體組合的用途/選擇。盡管WO200197850對(duì)很大的范圍提出了權(quán)利要求，但該發(fā)明的例證卻限于人Tie-2受體酪氨酸激酶(sTie-2)的胞外配體中和性結(jié)構(gòu)域和A或B的組合。后者可以是A.VEGF受體酪氨酸激酶抑制劑(4-氯苯基)[4-(4-吡咬基曱基)-酞溱-l-基]琥珀酸氫銨(Woodetal"CancerRes.602178-2189，2000),或B.抗VEGF抗體；為VEGF-A中和性單克隆抗體4301-42-35(Schlaeppietal.,J.CancerRes.Clin.Oncol.125,336-342,1999)或特異性識(shí)別人VEGF-A/VEGF受體I復(fù)合物的單鏈抗體(scFv)(W09919361)。該申請(qǐng)的廣泛范圍的其余部分沒(méi)有例證。具體的說(shuō)，沒(méi)有除了sTie-2用于實(shí)現(xiàn)對(duì)促血管生成素/Tie受體系統(tǒng)的功能干擾的用途之外的例證。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員并不清楚乂人很大范圍的可能排列(permutation)中還有什么其它組合會(huì)在治療上有效。本發(fā)明涉及促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑的組合以及這種組合的用途。本發(fā)明的一個(gè)方面提供促血管生成素-2生物活性拮抗劑和以下物質(zhì)的生物活性拮抗劑的組合i.VEGF-A，.和/或ii.KDR,和/或iii.Fltl。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中促血管生成素-2生物活性拮抗劑是抗體。優(yōu)選地，促血管生成素-2的拮抗劑是單克隆抗體。更優(yōu)選地，促血管生成素-2的拮抗劑是完全人單克隆抗體。更優(yōu)選地，該完全人單克隆抗體結(jié)合的表位與以下任何一個(gè)完全人單克隆抗體相同:3.31.2、5,16.3、5.86.1、5.88.3、3.3.2、5.103.1、5.101.1、3.19.3、5.28.1、5.78.3。最優(yōu)選地，該完全人單克隆抗體選自以下4壬何一個(gè)3.31.2或5.16.3或5.86.1或5.88.3或3.3.2或5.103.1或5.101.1或3.19.3或5.28.1或5.78.3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中促血管生成素-2生物活性拮抗劑可能不結(jié)合Tie-2的ATP結(jié)合位點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中促血管生成素-2生物活性拮抗劑不是sTie-2。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中KDR生物活性拮抗劑是抗體。優(yōu)選地，該拮抗劑是單克隆抗體。更優(yōu)選地，該拮抗劑是完全人單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中Fltl生物活性拮抗劑是抗體。優(yōu)選地，該拮抗劑是單克隆抗體。更優(yōu)選地，該拮抗劑是完全人單克隆抗體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中VEGF-A生物活性拮抗劑是抗體。優(yōu)選地，該拮抗劑是單克隆抗體。該單克隆抗體可以是DC101(Imclone)。更優(yōu)選地，該拮抗劑是完全人單克隆抗體。最優(yōu)選地，VEGF-A生物活性拮抗劑是阿瓦斯汀(貝伐單抗)(RosenLS.,CancerControl9(suppl2):36-44，2002)、CDP791(Celltech)或IMC1121b(Imclone)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中KDR生物活性拮抗劑是化合物。在又一個(gè)實(shí)施方案中，提供上述組合，其中Fltl生物活性拮抗劑是化合物。優(yōu)選地，該拮抗劑是酪氨酸激酶抑制劑。更優(yōu)選地，酪氨酸激酶抑制劑選自Zactima(ZD6474(WedgeSRetal.ZD6474inhibitsVEGFsignalling,angiogenesisandtumourgrowthfollowingoraladministration(ZD6474在口服給藥后能抑制VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管發(fā)生和腫瘤生長(zhǎng)).CancerResearch2002;62:4645-4655))、AZD2171(WedgeSRetal.AZD2171:Ahighlypotent，orallybioavailable，vascularendothelialgrowthfactorreceptor-2tyrosinekinaseinhibitorforthetreatmentofcancer(AZD2171:癌癥治療用的強(qiáng)效、口服生物可利用、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2酪氨酸激酶抑制劑).CancerResearch2005;65:4389-4400)、SU11248(Sutent，Pfizer)、SU14813(Pfizer)、Vatalanib(Novartis)、BAY43-9006(sorafenib，Bayer)、XL-647(Exelixis)、XL-999(Exelixis)、AG-013736(Pfizer)、AMG706(Amgen)、BIBF1120(Boehringer)、TSU68(Taiho)、GW786034、AEE788(Novartis)、CP-547632(Pfizer)、KRN951(Kirin)、CHIR258(Chiron)、CEP-7055(Cephalon)、OSI-930(OSIPharmaceuticals)、ABT-869(Abbott)、E7080(Eisai)、ZK-304709(Schering)、BAY57-9352(Bayer)、L-21649(Merck)、BMS582664(BMS)、XL-880(Exelixis)、XL-184(Exdixis)或XL-820(Exelixis)。更優(yōu)選地，酪氨酸激酶抑制劑選自Zactima或AZD2171。為避免疑義，KDR生物活性拮抗劑除了抑制KDR外還可抑制其它酪氨酸激酶，例如Fltl、EGFR或PDGFR。在一個(gè)實(shí)施方案中，KDR生物活性拮抗劑是KDR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，KDR生物活性拮抗劑是KDR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，但不是EGFR的抑制劑。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包含上述組合的藥物組合物。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供上述組合用于制造治療疾病相關(guān)性血管發(fā)生用的藥物的用途。促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或F1U生物活性拮抗劑的組合，可以單獨(dú)給予，或者可以與另外的抗體或化療藥物或放射療法一起組合給予。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供拮抗促血管生成素-2的生物活性和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl中的任何一個(gè)的生物活性的方法，所述方法包括給予上述組合。優(yōu)選地，所述方法包括選擇需要進(jìn)行疾病相關(guān)性血管發(fā)生的治療的動(dòng)物，和給予所述動(dòng)物治療有效劑量生物活性拮抗劑的組合。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療哺乳動(dòng)物中的疾病相關(guān)性血管發(fā)生的方法，所述方法包括給予治療有效量的上述組合。優(yōu)選地，所述方法包括選擇需要進(jìn)行疾病相關(guān)性血管發(fā)生的治療的動(dòng)物，和給予所述動(dòng)物治療有效劑量的促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑的組合。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，所述方法包括給予治療有效量的上述組合。優(yōu)選地，所述方法包括選擇需要進(jìn)行疾病相關(guān)性血管發(fā)生的治療的哺乳動(dòng)物，和給予所述哺乳動(dòng)物治療有效劑量的促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑的組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明特別適用于拮抗患有單獨(dú)地或部分上依賴(lài)于促血管生成素-2和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl的胂瘤的患者中的促血管生成素-2生物活性和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供這樣的本發(fā)明組合，它另外還包含醫(yī)學(xué)胂瘤學(xué)中所用的抗增殖/抗肺瘤藥物和它們的組合，如烷基化劑(例如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑、環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安和亞硝基脲)；抗代謝藥(例如抗葉酸制劑如氟嘧啶類(lèi)如5-氟尿嘧啶和替力口氟、雷替曲塞、吉西他濱、卡培他濱、甲氨喋呤、培美曲塞、胞嘧啶阿拉伯糖苷和羥基脲，或者例如歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?62734中所公開(kāi)的優(yōu)選抗代謝藥中的一種，如(2S)-2-^-氟苯曱酰胺基卜4-(四唑-5-基)丁酸)；包含烷基化劑和抗代謝藥的組合(例如Folfox，其包含氟尿嘧啶、亞葉酸和奧沙利鉑)；抗腫瘤抗生素(例如蒽環(huán)霉素如阿霉素、博來(lái)霉素、多柔比星、道諾霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素-C、放線菌素和光輝霉素)；抗有絲分裂藥(例如長(zhǎng)春花生物堿類(lèi)如長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)^、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱及紫杉類(lèi)化合物如紫杉醇和泰索帝)；和拓樸異構(gòu)酶抑制劑(例如表鬼臼毒素如依托泊苦和替尼泊苷、伊立替康、安吖啶、托泊替康和喜樹(shù)堿)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供另外包含F(xiàn)olfox的本發(fā)明組合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合還包含保護(hù)劑，例如能產(chǎn)生防止貧血或者減少抗增殖/抗胂瘤藥物副作用的效果的藥劑。優(yōu)選地，保護(hù)劑是還原形式的葉酸，優(yōu)選亞葉酸。本發(fā)明的組合預(yù)期能抑制疾病相關(guān)性血管發(fā)生，因此能充當(dāng)各種血管發(fā)生相關(guān)性疾病的強(qiáng)效療法。在包含抗體的本發(fā)明實(shí)施方案中，可將某個(gè)組合給予患者，然后給予清除劑。優(yōu)選地，該清除劑能將過(guò)量的循環(huán)抗體從血液中除去。本發(fā)明還包括制備本發(fā)明的各個(gè)組合的方法。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供包舍促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑的組合的藥盒。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供包含以下物質(zhì)和容器的藥盒a)第一單位劑量形式的促血管生成素-2生物活性拮抗劑；b)第二單位劑量形式的VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑；和c)裝著所述第一和第二劑量形式的容器。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供包含以下物質(zhì)和容器的藥盒a)第一單位劑量形式的促血管生成素-2生物活性拮抗劑及藥物可接受賦形劑或載體；b)第二單位劑量形式的VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑及藥物可接受賦形劑或載體；和c)裝著所述第一和第二劑量形式的容器。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括容器的制造品(articleofmanufacture^該容器裝著促血管生成素-2生物活性拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑的組合以及包裝插頁(yè)或標(biāo)簽，該包裝插頁(yè)或標(biāo)簽說(shuō)明該組合能用來(lái)治療與促血管生成素-2和VEGF-A和/或KDR和/或Fltl的活性和/或過(guò)量表達(dá)有關(guān)的血管發(fā)生相關(guān)性疾病。本發(fā)明的又一個(gè)方面提供治療用組合治療法(therapeuticcombinationtreatment),該組合治療法包括將有效量的促血管生成素-2生物活性拮抗劑或其藥物可接受鹽，任選與藥物可接受賦形劑或載體一起，給予需要這種組合治療法的溫血?jiǎng)游锶缛耍⑼瑫r(shí)地、序貫地或單獨(dú)地給予有效量的VEGF-A和/或KDR和/或Fltl生物活性拮抗劑或其藥物可接受鹽，其中后者可任選與藥物可接受賦形劑或載體一起給予。本文所定義的本發(fā)明組合治療法可通過(guò)同時(shí)地、序貫地或單獨(dú)地給予所述治療法的各個(gè)成分來(lái)實(shí)現(xiàn)。本文所定義的組合治療法可作為單獨(dú)療法施用，或者除了本發(fā)明的組合治療法外還可涉及到另外的手術(shù)或》t射療法或另外的化學(xué)治療劑。組合制劑用于給定患者的劑量，要由主治醫(yī)師在考慮到各種已知會(huì)改變藥物的作用的因素下進(jìn)行確定，這些因素包括疾病的嚴(yán)重程度和類(lèi)型、患者體重、性別、膳食、給藥時(shí)間和途徑、其它藥物和其它相關(guān)臨床因素。治療有效劑量可通過(guò)體外或體內(nèi)方法進(jìn)行確定。待進(jìn)行治療性采用的本文所述組合的有效量，要取決于例如治療目標(biāo)、給藥途徑和患者情況。因此，優(yōu)選的是治療醫(yī)師按需確定(titer)劑量和改變給藥途徑以獲得最佳治療效果。依上述因素而定，典型的日劑量可從約0.001mg/kg直到100mg/kg或更多。通常，臨床醫(yī)師要給予治療性抗體至達(dá)到能實(shí)現(xiàn)所需的效果的劑量為止。這個(gè)療法的進(jìn)程可容易地通過(guò)常規(guī)測(cè)定法或者如本文所述進(jìn)行監(jiān)測(cè)?？贵w給予途徑與已知方法是相合的，所述已知方法例如通過(guò)靜脈內(nèi)、Hi^內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、目艮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)注射或輸注，通過(guò)吸入或傷口內(nèi)(intralesion)途徑，或者通過(guò)下述的IC釋系統(tǒng)?？贵w優(yōu)選通過(guò)輸注連續(xù)給予或通過(guò)推注給予。待進(jìn)行治療性采用的抗體的有效量，要取決于例如治療目標(biāo)、給藥途徑和患者情況。因此，優(yōu)選的是治療醫(yī)師按需確定(titer)劑量和改變給藥途徑以獲得最佳治療效果。通常，臨床醫(yī)師要給予抗體至達(dá)到能實(shí)現(xiàn)所需的效果的劑量為止。這個(gè)療法的進(jìn)程可容易地通過(guò)常規(guī)測(cè)定法或者通過(guò)本文所述的測(cè)定法進(jìn)行監(jiān)測(cè)。本文所述的組合可以為適合口服給藥的形式，例如片劑或膠嚢劑；為適合鼻內(nèi)給藥或吸入給藥的形式，例如散劑或溶液劑；為適合胃腸外注射(包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、血管內(nèi)注射，或輸注)的形式，例如無(wú)菌溶液劑、混懸劑或乳劑；為適合局部給藥的形式，例如軟膏劑或乳膏劑；為適合直腸給藥的形式，例如栓劑，或者給藥途徑可以是通過(guò)直接注射到腫瘤中或通過(guò)區(qū)域遞送(regionalddivery)或通過(guò)局部遞送。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，組合治療法可以以?xún)?nèi)窺鏡、氣管內(nèi)、傷口內(nèi)、經(jīng)皮、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或腫瘤內(nèi)方式進(jìn)行遞送。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合進(jìn)行口服給予。一般來(lái)說(shuō)，本文所述的組合可用常規(guī)賦形劑以常規(guī)方式制備。本發(fā)明的組合有利地以單位劑型呈現(xiàn)。本文所述的抗體可以與藥物可接受載體混合在一起制備。這個(gè)治療性組合物可以靜脈內(nèi)給予或者通過(guò)鼻或肺給予，優(yōu)選作為液體或粉末氣溶膠(凍干)給予。該組合物還可按需進(jìn)行胃腸外或皮下給予。當(dāng)進(jìn)行系統(tǒng)給予時(shí)，治療用組合物應(yīng)無(wú)菌、無(wú)熱原和在胃腸外可接受溶液中，要充分注意溶液的pH、等滲性和穩(wěn)定性。這些條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。簡(jiǎn)單的說(shuō)，本文所述化合物的制劑是通過(guò)將具有所需純度的化合物與生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合來(lái)制備，以進(jìn)行儲(chǔ)藏或給藥。這種材料在所采用的劑量和濃度下對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑如TRISHC1、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽或其它有機(jī)酸鹽；抗氧化劑如抗壞血酸；低分子量(小于約十個(gè)殘基)肽如聚精氨酸、蛋白質(zhì)如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；單糖、雙糖和其它碳水化合物，包括纖維素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；反荷離子如鈉和/或非離子型表面活性劑如TWEEN、PLURONICS或聚乙二醇。本發(fā)明的實(shí)施方案包括可用作疾病治療劑的無(wú)菌抗體藥物制劑。這種制劑會(huì)抑制抗原的生物活性，從而有效治療其中例如血清或組織抗原異常升高的疾病狀況。抗體優(yōu)選具有足夠的親和力，以強(qiáng)效地中和抗原，并優(yōu)選具有足夠的作用時(shí)間，以便不用在人體中頻繁給藥。作用時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使得可以通過(guò)另選的胃腸外途徑如皮下或肌肉內(nèi)注射，進(jìn)行的頻率更少、方便性更高的給藥方案。無(wú)菌制劑可例如通過(guò)在抗體的凍干和復(fù)溶之前或之后濾過(guò)無(wú)菌過(guò)濾膜來(lái)制備?？贵w通常要以?xún)龈尚问交蛘咴谌芤褐袃?chǔ)藏。治療性抗體組合物通常是放入具有無(wú)菌存取口(accessport)的容器中，例如具有能使制劑得以取用的配接器(adapter)的靜脈內(nèi)溶液劑袋子或小瓶，該配接器例如是可被皮下注射針刺穿的塞子(stopper)。注射用無(wú)菌組合物可4姿照77ze5Wewcea"d戶(hù)raWceo/尸Aar顧c少(20ed，LippincottWilliams&WilkensPublishers(2003))中描述的常規(guī)制藥規(guī)范進(jìn)行配制。例如，宜將活性化合物溶解或懸浮于載體中，所述栽體例如水或者天然植物油如芝麻油、花生油或棉籽油或者合成脂肪性載體如油酸乙酯等。緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑等可按照公認(rèn)的制藥規(guī)范來(lái)?yè)饺?。本發(fā)明的組合可作為緩釋制劑進(jìn)行遞送。緩釋制劑的合適實(shí)例包括含有多肽的固體疏水性聚合物的半透性基質(zhì)(matrix),該基質(zhì)為成型物品、膜或微膠嚢的形式。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如Langer"B/owW及仏，(1981)15:167-277和Langer，C7zem.rec/7.，(1982)12:98-105所述的聚(2-幾乙基曱基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國(guó)專(zhuān)利3,773,919、EP58,481)、L國(guó)谷氨酸和L-谷氨酸-y-乙酯共聚物(Sidman&B/opofymers，(1983)22:547-556)、非可降解乙烯-醋酸乙烯酯(LangerW"/.，出處同上)、可降解乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDepotTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙立德組成的可注射微球體)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸(EP133,988)。雖然諸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能使得分子可釋放長(zhǎng)達(dá)100天，但某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)的時(shí)間較短。蛋白質(zhì)當(dāng)進(jìn)行包嚢時(shí)會(huì)在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間保持，他們可能會(huì)因?yàn)楸┞队?7°C潮濕的環(huán)境下而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性損失和可能的免疫原性變化?？筛鶕?jù)所涉及的機(jī)制設(shè)計(jì)出合理的策略進(jìn)行蛋白質(zhì)穩(wěn)定化。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)制是通過(guò)二硫化物互換形成分子間S-S鍵，則可通過(guò)修飾巰基殘基、從酸性溶液凍干、控制水分含量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿┖烷_(kāi)發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組合物來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。緩釋組合物還包括抗體晶體懸浮于能夠?qū)⒕w維持在懸浮液中的合適制劑所成的制品。這些制品當(dāng)皮下或腹膜內(nèi)注射時(shí)能產(chǎn)生緩釋效果。其它組合物還包括脂質(zhì)體包埋抗體。含有這種抗體的脂質(zhì)體是通過(guò)本身7>知的方法來(lái)制備美國(guó)專(zhuān)利DE3,218,121;''『Epstein"a/.,尸亂胸/.^cad腺，(1985)82:3688-3692;Hwang"a/.,Ato/.(1980)77:4030-4034;EP52,322;EP36,676;EP88，046;EP143,949;142，641;日本專(zhuān)利申請(qǐng)83-118008;美國(guó)專(zhuān)利4,485,045和4,544,545;和EP102,324。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，按照本文的組合物和方法進(jìn)行的治療性實(shí)體(therapeuticentity)的給予，要用合適的載體、賦形劑和其它被摻入到制劑中以使轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性得以改進(jìn)的物質(zhì)來(lái)進(jìn)行給予。這些制劑包括例如散劑、糊劑、軟膏劑、凝膠劑、蠟、油、脂質(zhì)、含脂質(zhì)(陽(yáng)離子或陰離子)嚢泡(如Lipofectin1^)、DNA綴合物、無(wú)水吸收糊劑、水包油和油包水乳劑、碳蠟乳劑(各種分子量的聚乙二醇)、半固體凝膠和含碳蠟的半固體混合物。任何前述混合物都可適用于本發(fā)明的治療和療法，條件是制劑中的活性成分不受制劑^/f匕，且制劑在生理上與給藥途徑相容和可耐受。關(guān)于與藥物化學(xué)家公知的制劑、賦形劑和載體有關(guān)的另外信息，另參見(jiàn)BaldrickP."Pharmaceuticalexcipientdevelopment:theneedforpreclinicalguidance(藥物賦形劑開(kāi)發(fā)臨床前指導(dǎo)的需要)."及egw/.7b;dco/.尸/7。maco/.32(2):210-8(2000),WangW."Lyophilizationanddevelopmentofsolidproteinpharmaceuticals(固體蛋白質(zhì)藥4勿的凍干和開(kāi)發(fā))."/"f./尸/wwz.203(l-2):l-60(2000),CharmanWN"Lipids,lipophilicdrugs,andoraldrugdelivery-someemergingconcepts(脂質(zhì)、親脂藥物和口服藥物遞送——一些新出現(xiàn)的概念)."/P/zanw.89(8):967-78(2000)，Powell&a/."Compendiumofexcipientsforparenteralformulations(胃腸外制劑用賦形劑概要)"尸DJJ尸/^wz5Wrec/wo/.52:238-311(1998)和這些文獻(xiàn)中的引文。通過(guò)永久組織培養(yǎng)細(xì)胞系制造具有預(yù)確定特異性的單克隆抗體，這最初描述于1975年(Kohler,G"&Milstein,C"Nature256,495-497,1975)。小鼠骨髓瘤和來(lái)自被免疫供體的小鼠脾細(xì)胞的融合產(chǎn)生出分泌抗綿羊紅細(xì)胞(SRBC)抗體的細(xì)胞系。隨后的發(fā)展意味著現(xiàn)在有可能通過(guò)體外方法^"生人抗體。合適的實(shí)例包括但不限于嗟菌體展示(CAT,Morphosys,Dyax，Biosite/Medarex，Xoma，Symphogen,Alexion(原為Proliferon)，Affimed)、核糖體展示(CAT)、酵母菌展示等。本文所述的抗體是通過(guò)利用下文所述的XenoMouse⑧技術(shù)制備的。這種小鼠因而能夠產(chǎn)生人免疫球蛋白分子和抗體，在鼠免疫球蛋白分子和抗體的產(chǎn)生方面則不足。用以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的技術(shù)在本文給出的專(zhuān)利、申請(qǐng)和參考文獻(xiàn)中有公開(kāi)。不過(guò)具體的說(shuō)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生小鼠和從該小鼠轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生抗體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，公開(kāi)于1996年12月3日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)系列號(hào)08/759,620和1998年6月11日公布的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO98/24893和2000年12月21日公布的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO00/76310中，這些專(zhuān)利的7>開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。另參見(jiàn)Menofeze,。/.A^wreCe"幼'cs15:146-156(1997),該文獻(xiàn)的^^開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。通過(guò)使用這種技術(shù)，已經(jīng)產(chǎn)生出抗多種抗原的完全人單克隆抗體。概要地說(shuō)，用目的抗原免疫XenoMouse⑧系的小鼠，從超免疫小鼠回收淋巴細(xì)胞(如B細(xì)胞)，將回收的淋巴細(xì)胞與骨髓類(lèi)型的細(xì)胞系融合，以制備無(wú)限增殖的雜交瘤細(xì)胞系。對(duì)這些雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行篩選和選擇，以鑒定出產(chǎn)生了對(duì)目的抗原有特異性的抗體的雜交瘤細(xì)胞系。本文提供用以產(chǎn)生多個(gè)能產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞系的方法。此外，本文提供由這種細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體的表征，包括對(duì)這種抗體的重鏈和輕鏈的核苷酸和氨基酸序列分析。或者，可直接對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，而不是將與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤。例如，可從超免疫XenoMoused、鼠分離CD19+B細(xì)胞，并讓它增殖和分化成分泌抗體的漿細(xì)胞。然后通過(guò)ELISA對(duì)細(xì)胞上清液中的抗體進(jìn)4亍對(duì)免疫原的反應(yīng)性方面的篩選。還可對(duì)上清液進(jìn)行對(duì)免疫原片段的免疫反應(yīng)性方面的篩選，以進(jìn)一步對(duì)不同抗體進(jìn)行與免疫原上具有功能意義的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合方面的作圖(map)。還可將抗體進(jìn)行針對(duì)其它相關(guān)人蛋白質(zhì)和針對(duì)大鼠、小鼠和非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物如食蟹猴免疫原直向同源物(orthologue)的篩選，以確定物種交叉反應(yīng)性。來(lái)自含目的抗體的各孔的B細(xì)胞可通過(guò)各種方法無(wú)限增殖化，這些方法包括將各孔B細(xì)胞分別進(jìn)行融合或者將各孔B細(xì)胞合并后進(jìn)行融合以制備雜交瘤，或者是通過(guò)用EpsteinBarr病毒感染或用已知的無(wú)限增殖基因轉(zhuǎn)染，然后接種在合適的培養(yǎng)基中?；蛘?，然后用抗原特異性溶血空斑試-驗(yàn)分離能分泌具有所需特異性的抗體的單一漿細(xì)胞(參見(jiàn)例如Babcook"a/.,A^/.jcadt/W93:7843-48(1996))。被革巴向進(jìn)行裂解的細(xì)胞優(yōu)選是包被有抗原的綿羊血細(xì)胞(SRBCs)。在含有能分泌目的免疫球蛋白的漿細(xì)胞的B細(xì)胞培養(yǎng)物和補(bǔ)體存在下，空斑的形成表明了目的漿細(xì)胞周?chē)木d羊紅細(xì)胞的特異性抗原介導(dǎo)裂解。可將空斑中央的單一抗原特異性漿細(xì)胞分離，并從該單一漿細(xì)胞分離編碼抗體的特異性的遺傳信息。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)行聚合g反應(yīng)(RT-PCR),可克隆出編碼抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA。這種克隆DNA然后可再插入到合適的表達(dá)載體中，優(yōu)選載體盒如pcDNA，更優(yōu)選含有免疫球蛋白重鏈和輕鏈的恒定域的pcDNA載體。然后可將所產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞例如HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞中，在常規(guī)的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(在適當(dāng)情況下進(jìn)行了改進(jìn)以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄)中培養(yǎng)，選擇出轉(zhuǎn)化子，或者擴(kuò)增編碼所需序列的基因。一般來(lái)說(shuō)，融合雜交瘤所產(chǎn)生的抗體是連接有完全人K或人輕鏈的人IgG2重鏈。本文所述的抗體具有人IgG4重鏈及IgG2重鏈?？贵w還可以是其它的人同種型，包括IgGl?？贵w經(jīng)固相和溶液相技術(shù)測(cè)出具有高親和力，通常具有約10"至約10"M或更低的Kd。歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)773288和843961描述了從其中通過(guò)^f效細(xì)胞融合引入了大段染色體或整個(gè)染色體的小鼠產(chǎn)生人抗體，所述專(zhuān)利的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合到本文中。另外，還產(chǎn)生出了KMTM小鼠，這些小鼠是將日本麒麟哞酒公司(Kirin)的Tc小鼠與美國(guó)Medarex公司的微小基因座(Humab)小鼠雜交育種的結(jié)果。這些小鼠具有Kirin小鼠的人IgH轉(zhuǎn)染色體(tmnschromosome)和Genpharm小鼠(Ishida&a/.,CloningStemCells,(2002)4:91-102)的k鏈轉(zhuǎn)基因。要認(rèn)識(shí)到，抗體可以在雜交瘤細(xì)胞系之外的細(xì)胞系中表達(dá)?？捎镁幋a特定抗體的序列轉(zhuǎn)化合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以通過(guò)任何已知的用以將多核苷酸引入到宿主細(xì)胞中的方法來(lái)進(jìn)行，所述方法包括例如將多核苷酸包裝在病毒中(或者包裝到病毒雜體中)并用該病毒(或者栽體)轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞，或者轉(zhuǎn)化可通過(guò)本領(lǐng)域公知的轉(zhuǎn)染程序來(lái)進(jìn)行，所述轉(zhuǎn)染程序例見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455(這些專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。所用的轉(zhuǎn)化程序取決于所要轉(zhuǎn)化的宿主。將異源多核苷酸引入到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的方法是本領(lǐng)域公知的，包括葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀、聚凝胺(polybrene)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、多核苷酸包嚢在脂質(zhì)體中和DNA直接微注射到細(xì)胞核中?？晒┳鳛楸磉_(dá)用宿主的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域^S知的，包括許多可獲自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)的無(wú)限增殖化細(xì)胞，這些細(xì)胞包括但不限于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如HepG2)、人上皮腎293細(xì)胞和多種其它細(xì)胞系。特別優(yōu)選的細(xì)胞系是通過(guò)確定哪些細(xì)胞系具有高表達(dá)水平和能產(chǎn)生具有組成型抗原結(jié)合特性的抗體來(lái)選出。理解的含義，除非另有定義。此外，除非上下文另外要求，否則單數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)含義，復(fù)數(shù)形式的術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)含義。一般來(lái)說(shuō)，在細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)和寡或多核普酸化學(xué)和雜交方面所用的術(shù)語(yǔ)及這些方面的技術(shù)，是本領(lǐng)域公知和常用的那些術(shù)語(yǔ)和技術(shù)。在重組DNA、寡核芬酸合成及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化上使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)(例如電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)按照廠商說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行，或者如本領(lǐng)域通常所執(zhí)行的或如本文所述的來(lái)進(jìn)行。前述技術(shù)和程序通常是按照本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行，和如本說(shuō)明書(shū)當(dāng)中所引述和論述的各種一般和更為具體的參考文獻(xiàn)中所述的來(lái)進(jìn)4亍。參見(jiàn)例^口SambrookWa/.A/o/ecw/arC7om'"g.'^Za6orato7Afowwa/(3rded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2001)),這篇文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文所述的在分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)方面所用的術(shù)語(yǔ)及這些方面的實(shí)^^室程序和技術(shù)，是本領(lǐng)域7>知和常用的那些術(shù)語(yǔ)及程序和技術(shù)。在化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、制劑和遞送及患者的治療上使用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)。以下術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有以下含義，除非另有指明拮抗劑可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、小分子量化合物、寡核苷酸、寡肽、RNA干擾(RNAi)、反義、重組蛋白質(zhì)、抗體或者它們的綴合物或融合蛋白。有關(guān)RNAi的綜述參見(jiàn)MilhavetO,GaryDS，MattsonMP.(PharmacolRev.2003Dec;55(4):629-48.Review.),有關(guān)反義的綜述參見(jiàn)OpalinskaJB，GewirtzAM.(SciSTKE.2003Oct28;2003(206):pe47.)。促血管生成素-2的拮抗劑可以是促血管生成素-2生物活性的任何拮抗劑，包括能拮抗促血管生成素-2和其它促血管生成素(包括促血管生成素-1、促血管生成素-3和/或促血管生成素-4)的生物活性的拮抗劑。促血管生成素-2拮抗劑可以結(jié)合單獨(dú)的配體，或者當(dāng)配體與其受體結(jié)合時(shí)結(jié)合該配體。VEGF-A的拮抗劑可以是VEdF-A生物活性的任何拮抗劑，其中該拮抗劑可以結(jié)合單獨(dú)的配體，或者當(dāng)配體與其受體結(jié)合時(shí)結(jié)合該配體。該拮抗劑可以防止VEGF-A介導(dǎo)的Fltl或KDR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制血管發(fā)生。這一抑制的作用機(jī)制可包括該拮抗劑與VEGF-A結(jié)合和抑制VEGF-A與其受體(Fltl或KDR)的結(jié)合。或者，該拮抗劑可在VEGF-A與受體(Fltl或KDR)締合時(shí)結(jié)合VEGF-A，從而防止VEGF-A介導(dǎo)的Fltl或KDR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)?；蛘撸撧卓箘┛稍鰪?qiáng)對(duì)其中的VEGF-A的清除，從而降低VEGF-A結(jié)合Fltl或KDR的有效濃度。組合物優(yōu)選是包含一種或多種拮抗劑的藥物組合物。組合物的拮抗劑可單獨(dú)地、序貫地或同時(shí)地給予。疾病相關(guān)性血管發(fā)生可以是任何異常的、不需要的或病態(tài)的血管發(fā)生，例如肺瘤相關(guān)性血管發(fā)生。血管發(fā)生相關(guān)性疾病包括但不限于非實(shí)體瘤如白血病、多發(fā)性骨髓瘤、血液惡性肺瘤或淋巴瘤，以及實(shí)體瘤和它們的轉(zhuǎn)移瘤如黑素瘤、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞(肝臟)癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、甲狀腺癌、膽管癌、骨癌、胃癌、腦/CNS癌、頭頸癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、腎癌、睪丸癌、卵巢癌、皮膚癌、宮頸癌、肺癌、肌肉癌、神經(jīng)元癌、食管癌、膀胱癌、肺癌、子宮癌、陰戶(hù)癌、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、胸膜/腹膜癌、唾腺癌和表皮樣嚢腫。過(guò)量的血管生長(zhǎng)還會(huì)促成多種非腫瘤性疾病。這些非腫瘤性血管發(fā)生相關(guān)性疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、血管瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管纖維瘤、血管畸形(例如遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(HHT)或Osler-Weber綜合征)、疣、化膿性肉芽腫、毛發(fā)過(guò)度生長(zhǎng)、Kaposis肉瘤、瘢痕疙瘩、過(guò)^t性水腫、牛皮癬、功能不良性子宮出血、濾泡嚢腫、卵巢過(guò)度刺激、子宮內(nèi)膜異位癥、呼吸窘迫、腹水、透析患者中的腹膜硬化癥、腹部手術(shù)所致的粘連形成、肥胖癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨髓炎、血管翳生長(zhǎng)、骨贅、出血性關(guān)節(jié)、炎癥和感染過(guò)程(例如肝炎、肺炎、血管球性腎炎)、哞喘、鼻息肉、肝再生、肺高壓、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、年齡相關(guān)性黃斑變性、白質(zhì)軟化癥、新生血管性青光眼、角膜移植新血管形成、沙眼、曱狀腺炎、曱狀腺腫大和淋巴增生性疾病。化合物指任何分子量小于2000道爾頓的小分子量化合物。術(shù)語(yǔ)"抗體"指由至少一個(gè)結(jié)合域組成的多肽或多肽群，該結(jié)合域是由多肽鏈的折疊形成，具有三維結(jié)合空間，該空間具有與抗原的抗原決定簇的特征互補(bǔ)的內(nèi)部表面形狀和電荷分布?？贵w通常具有四聚形式，這種形式包含完全相同的兩對(duì)多肽鏈，每對(duì)具有一個(gè)"輕鏈"和一個(gè)"重鏈"。每個(gè)輕鏈/重鏈對(duì)的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)?？贵w可以是單獨(dú)的寡克隆抗體、多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、CDR接枝抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、催化性抗體、嵌合抗體、人源化抗體、完全人抗體、抗獨(dú)特型抗體和能以可溶性或結(jié)合形式被標(biāo)記的抗體以及它們的片段、變體或衍生物，或者這些抗體以及它們的片段、變體或衍生物與公知技術(shù)所提供的其它氨基酸序列的組合?？贵w可來(lái)自任何物種。術(shù)語(yǔ)抗體還包括本發(fā)明抗體的結(jié)合片段，示例性的片段包括Fv、Fab、Fab，、單鏈抗體(svFC)、二聚可變區(qū)(雙抗體)和二硫化物穩(wěn)定的可變區(qū)(dsFv)。術(shù)語(yǔ)"中和性"當(dāng)指抗體時(shí)涉及到抗體消除或顯著降低靶標(biāo)抗原的活性的能力。因此，"中和性"抗促血管生成素-2抗體能夠消除或顯著降低促血管生成素-2的活性。中和性促血管生成素-2抗體可例如通阻斷促血管生成素-2與其受體Tie-2的結(jié)合來(lái)起作用。通過(guò)阻斷這一結(jié)合，Tie-2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被顯著地或完全地消除。理想地，抗促血管生成素-2中和性抗體能抑制血管發(fā)生。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多肽，，作為通稱(chēng)是指多肽序列的天然蛋白質(zhì)、片段或類(lèi)似物。因此，天然蛋白質(zhì)、片段和類(lèi)似物是多肽上位概念(genus)中的下位概念(species)。本發(fā)明的優(yōu)選多肽包含人重鏈免疫球蛋白分子和人k輕鏈免疫球蛋白分子，以及由包含重鏈免疫球蛋白分子與輕鏈免疫球蛋白分子(如k或X輕鏈免疫球蛋白分子)的組合(反之亦然)所形成的抗體分子，以及它們的片段和類(lèi)似物。本發(fā)明的優(yōu)選多肽還可單單包含人重鏈免疫球蛋白分子或其片段。本文所用術(shù)語(yǔ)"天然的"應(yīng)用于物體時(shí)是指該物體能在自然界中找到的這一事實(shí)。例如，存在于可從自然界中的某個(gè)來(lái)源分離的生物(包括病毒)中的、未曾被人類(lèi)在實(shí)驗(yàn)室中或以其它方式有意修飾的多肽或多核苷酸序列，是天然的。本文所提到的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"意指長(zhǎng)度至少10個(gè)堿基的核苷酸聚合形式，該核苷酸是核糖核苦酸或脫氧核苦酸或這兩種類(lèi)型的核苷酸的修飾形式，或者意指RNA-DNA異源雙鏈體。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式的DNA。本文所提到的術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"包括通過(guò)天然的和非天然的連鍵連接在一起的天然的和修飾的核苷酸。寡核苷酸是多核苦酸的子集，多核苷酸通常包含200個(gè)減基或更少的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，寡核苷酸長(zhǎng)10-60個(gè)堿基，最優(yōu)選長(zhǎng)12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個(gè)堿基。寡核苦酸通常是單鏈的，例如對(duì)于探針而言；不過(guò)寡核苷酸也可是雙鏈的，例如供用于基因突變體構(gòu)建的寡核苷酸而言。寡核苷酸可以是有義寡核香酸或反義寡核苦酸。如果兩個(gè)氨基酸序列的序列之間有部分的或完全的同一性，則是"同源的"。例如85%同源性意指當(dāng)將兩個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)以找出最大匹配時(shí)，有85%的氨基酸是相同的。空隙(在進(jìn)行匹配的兩個(gè)序列的任何一個(gè)中)在使匹配最大化中是允許的；優(yōu)選5或以下的空隙長(zhǎng)度，更優(yōu)選2或以下?；蛘咔覂?yōu)選地，兩個(gè)蛋白質(zhì)序列(或者衍自它們的、長(zhǎng)度至少約30個(gè)氨基酸的多肽序列)，如果用ALIGN程序以突變數(shù)據(jù)矩陣和6或更大的空隙罰分得出它們具有超過(guò)5(按標(biāo)準(zhǔn)偏差單位)的比對(duì)分?jǐn)?shù)，則它們是同源的，這是同源這個(gè)術(shù)語(yǔ)在本文用到的意思。參見(jiàn)Dayhoff，M.O.,q/Trato'"^^e"ceaw/5Vracfwe，第101-110頁(yè)(第5巻,NationalBiomedicalResearchFoundation(1972))和這一巻的增刊2第1-10頁(yè)。兩個(gè)序列或它們的部分如果在用ALIGN程序進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)它們的氨基酸大于或等于50%相同，則是更優(yōu)選的同源。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在兩個(gè)直向同源(orthologous)序列當(dāng)中可能會(huì)有同源性有差異的區(qū)域。例如，小鼠和人直向同源物的功能位點(diǎn)可比非功能區(qū)域具有更高程度的同源性。本文用到的20個(gè)常見(jiàn)氨基酸及它們的縮寫(xiě)遵循常規(guī)用法。參見(jiàn)/w扁wo/ogy-」jSy"/Z2e^(2ndEdition,E.S.GolubandD.R.Gren,Eds.,SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))，這篇文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。20個(gè)常見(jiàn)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如D-氨基酸)、非天然氨基酸如ot-，a-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常見(jiàn)氨基酸也可以是本發(fā)明多肽的合適組分。非常見(jiàn)M酸的實(shí)例包括4-羥基脯氨酸、，羧基谷氨酸、s-N,N，N-三曱基賴(lài)氨酸、s-N-乙酰賴(lài)氨酸、O-磷絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-曱酰曱疏氨酸、3-曱基組氨酸、5-羥基賴(lài)氨酸、a-N-曱基精氨酸和其它類(lèi)似的氨基酸和亞氨基酸(例如4-羥基脯氨酸)。在本文所用的多肽符號(hào)中，按照標(biāo)準(zhǔn)的用法和常規(guī)，左手方向是氨基末端方向，右手方向是g末端方向。同樣，除非另有指定，否則單鏈多核苷酸的左手末端是5，末端，雙鏈多核苷酸序列的右手方向稱(chēng)為5'方向。新生RNA轉(zhuǎn)錄物的5'-3，添加的方向稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄方向；DNA鏈上的具有與RNA相同的序列且在RNA轉(zhuǎn)錄物5'末端的上游的序列區(qū)域稱(chēng)為"上游區(qū)域"，DNA鏈上的具有與RNA相同的序列且在RNA轉(zhuǎn)錄物3'末端的下游的序列區(qū)域稱(chēng)為"下游區(qū)域"。本文所論述到的抗體或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的微小變異也認(rèn)為被本發(fā)明所涵蓋，條件是氨基酸序列的變異保持與本文所述抗體或免疫球蛋白分子有至少75%、更優(yōu)選至少80%、90%、95%、更優(yōu)選99%的序列同一性。具體的說(shuō)，構(gòu)思了保守氨基酸氨基酸置換。保守置換是在具有相關(guān)側(cè)鏈的一族氨基酸當(dāng)中發(fā)生的置換。遺傳編碼的氨基酸通常分成以下幾族(1)酸性氨基酸=天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性氨基酸=賴(lài)氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性氨基酸=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸、色氨酸和(4)不帶電極性氨基酸=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的氨基酸族是絲氨酸和蘇氨酸是脂族羥基族氨基酸；天冬酰胺和谷氨酰胺是含酰胺族氨基酸；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸是脂族氨基酸；而苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸是芳族氨基酸。例如，有理由認(rèn)為，用異亮氨酸或纈氨酸單獨(dú)置換亮氨酸、用谷氨酸單獨(dú)置換天冬氨酸、用絲氨酸單獨(dú)置換蘇氨酸或者用結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸進(jìn)行類(lèi)似的氨基酸置換，不會(huì)對(duì)所產(chǎn)生的分子的結(jié)合功能或特性有重大影響，尤其是如果該置換不涉及到構(gòu)架位點(diǎn)當(dāng)中的氨基酸的話。酸變化是否會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生功能肽，這可容易地通過(guò)測(cè)定該多肽^f汙生物的比活性來(lái)確定。測(cè)定法在本文中有詳細(xì)描述。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地制備出抗體或免疫球蛋白分子的片段或類(lèi)似物。片段或類(lèi)似物的優(yōu)選氨基末端和羧基末端出現(xiàn)在功能域的邊界近旁。結(jié)構(gòu)和功能域可通過(guò)將核苷酸和/或氨基酸序列數(shù)據(jù)與公共或私有的序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較來(lái)鑒定。優(yōu)選地，使用計(jì)算機(jī)化比較方法來(lái)鑒定在其它已知結(jié)構(gòu)和/或功能的蛋白質(zhì)中出現(xiàn)的序列基序或被預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)構(gòu)象域。鑒定折疊成已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)序列的方法是^^知的。Bowiee^/.5We"ce253:164(1991)。因此，前述的實(shí)例i正明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能識(shí)別出可用來(lái)確定與本文所述的抗體一致的結(jié)構(gòu)和功能域的序列基序和結(jié)構(gòu)構(gòu)象。優(yōu)選的氨基酸置換是這樣的置換(l)能減少對(duì)蛋白酶解的易感性，(2)能減少對(duì)氧化的易感性，(3)能改變形成蛋白質(zhì)復(fù)合物所需的結(jié)合親和力，(4)能改變結(jié)合親和力和(4)能賦予或修飾這種類(lèi)似物的其它理化或功能特性。類(lèi)似物可包括天然肽序列之外的序列所成的各種突變蛋白質(zhì)。例如，可在天然序列中(優(yōu)選在多肽的位于形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域外部的部分中)作出單個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(優(yōu)選保守氨基酸置換)。保守氨基酸置換不應(yīng)實(shí)質(zhì)上改變母體序列的結(jié)構(gòu)特性(例如置換的氨基酸不應(yīng)趨向于毀壞母體序列中出現(xiàn)的螺旋，或者破壞其它類(lèi)型的表征母體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu))。本領(lǐng)域ziH人的多肽二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的實(shí)例描述于iVoto'm,S^cfw^sMo/ecw/ar/W"")/m(Creighton,Ed"W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));(C.Brandenand丄Tooze,eds,，GarlandPublishing,NewYork，N.Y.(1991))和Thorntonetal.A^wre354:105(1991)，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文所用的術(shù)語(yǔ)"多肽片段"指具有氨基末端和/或羧基末端缺失、但剩余的氨基酸序列與從例如全長(zhǎng)cDNA序列推導(dǎo)的天然序列中的對(duì)應(yīng)位置相同的多肽。片段的長(zhǎng)度通常是至少5、6、8或10個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少14個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸，往往至少50個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少70個(gè)氨基酸。本文所用的術(shù)語(yǔ)"類(lèi)似物"指由至少25個(gè)氨基酸的這樣的區(qū)段所組成的多肽，該區(qū)段與推導(dǎo)的M酸序列的一部分具有實(shí)質(zhì)同一性，且具有至少以下特性之一(1)在合適的結(jié)合條件下能特異性結(jié)合促血管生成素-2，(2)能夠阻斷適當(dāng)?shù)拇傺苌伤?2結(jié)合或(3)能夠抑制促血管生成素-2活性。通常，多肽類(lèi)似物相比于天然序列包含有保守氨基酸置換(或添加或缺失)。類(lèi)似物的長(zhǎng)度通常是至少20個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少50個(gè)氨基酸或更長(zhǎng)，且往往可與全長(zhǎng)天然多肽一樣長(zhǎng)。肽類(lèi)似物常常在制藥工業(yè)中用作其特性類(lèi)似于模板肽的特性的非肽藥物。這些類(lèi)型的非肽化合物稱(chēng)為"肽模擬物"或"模擬肽"。Fauchere,/柚.D，版15:29(1986);VeberandFreidingerp.392(1985)和EvansWa/.JOzew.30:1229(1987)，這些文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這種化合物往往是借助計(jì)算機(jī)化分子建模來(lái)開(kāi)發(fā)的。在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于治療上有用的肽的肽^^莫擬物可用來(lái)產(chǎn)生等同的治療或預(yù)防效果。通常，模擬肽在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于典范多肽(即具有生化特性或藥理活性的多肽)如人抗體，但有一個(gè)或多個(gè)肽鍵任選被以下的鍵用本領(lǐng)域公知方法取代-CH2NH-、-CH2S-、—CH2-CH2—、—CH=CH—(順式和反式)、—COCH2-----CH(OH)CH2—和-CH2SO—?？刹啥謱⒐灿行蛄械囊粋€(gè)或多個(gè)氨基酸用相同類(lèi)型的D-氨基酸進(jìn)行系統(tǒng)性置換(例如D-賴(lài)氨酸替代L-賴(lài)氨酸)，來(lái)產(chǎn)生更加穩(wěn)定的肽。另外，包含共有序列或?qū)嵸|(zhì)上相同的共有序列變異的受約束肽(constrainedpeptide)可用本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生(RizoandGieraschj朋.及ev.所oc/zem.61:387(1992),其通過(guò)引用結(jié)合到本文中)；例如，通過(guò)加入能夠形成將肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫鍵的內(nèi)部半胱氨酸殘基來(lái)產(chǎn)生?？贵w的"結(jié)合片段"通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，或者通過(guò)酶促或化學(xué)切割完整的抗體來(lái)產(chǎn)生。結(jié)合片段包括Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv和單鏈抗體。"雙特異性"或"雙功能性"抗體之外的抗體應(yīng)理解為其每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都相同。當(dāng)某過(guò)量的抗體減少與反受體結(jié)合的受體的量達(dá)至少約20%、40%、60%或80%、更通常超過(guò)約85%(如體外竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定中所測(cè)量)時(shí)，則該抗體實(shí)質(zhì)上抑制該受體與該反受體的黏合。術(shù)語(yǔ)"表位"包括任何能夠特異性結(jié)合免疫球蛋白或T細(xì)胞受體的蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面簇(grouping)如氨基酸或糖側(cè)鏈組成，且可以但不總是具有特異性的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異性的電荷特性。某抗體當(dāng)解離常數(shù)S1^M、優(yōu)選S100nM、最優(yōu)選S10nM時(shí)可稱(chēng)為特異性結(jié)合表位。本文所用的術(shù)語(yǔ)"物質(zhì)(agent)"表示化學(xué)化合物、化學(xué)化合物的混合物、生物大分子或從生物材料制備的提取物。對(duì)促血管生成素-2或促血管生成素-2多肽言的"活性的，，或"活性"是指該多肽的具有天然多肽的生物或免疫活性的部分。本文所用的"生物(的)"是指由天然多肽的活性產(chǎn)生的生物功能。例如，優(yōu)選的促血管生成素-2生物活性包括促血管生成素-2誘導(dǎo)的血管發(fā)生。哺乳動(dòng)物"指所有哺乳動(dòng)物，但優(yōu)選哺乳動(dòng)物是人。用木瓜蛋白酶消化抗體會(huì)產(chǎn)生出兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，也稱(chēng)"Fab"片段和"Fc"片段，它們不具有抗原結(jié)合活性，但具有結(jié)晶的能力。用胃蛋白酶消化抗體會(huì)產(chǎn)生出F(ab，)2片段，其中抗體分子的兩臂保持連接和包含兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。F(ab，)2片段具有交聯(lián)抗原的能力。本文所用的"Fv"是指抗體的保持了抗原識(shí)別位點(diǎn)和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小片段。本文所用的"Fab"是指抗體的包含輕鏈的恒定域和重鏈的CH1域的片段。術(shù)語(yǔ)"mAb"指單克隆抗體。本文所用的"脂質(zhì)體"是指可用來(lái)將藥物遞送給哺乳動(dòng)物的小嚢泡，該藥物可包括本發(fā)明的促血管生成素-2多肽或抗這種促血管生成素-2多肽的抗體。本文所用的"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"是指將可檢測(cè)部分加到多肽上，例如放射標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶促標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的或生物素?；鶊F(tuán)。放射性同位素或放射性核素可包括"H、14C、15N、35S、9QY、"Tc、mIn、125I、13II,焚光標(biāo)記可包括羅丹明、鑭系磷(lanthanidephosphors)或FITC,酶促標(biāo)記可包括辣根過(guò)氧化物酶、P-半乳糖苷酶、螢光素酶、《威性磷酸酶。本文所用的術(shù)語(yǔ)"藥劑或藥物，，是指當(dāng)適當(dāng)給予患者時(shí)能夠引起所需的治療效果的化學(xué)化合物、組合或組合物。本文的其它化學(xué)術(shù)語(yǔ)是按照本領(lǐng)域常規(guī)用法使用，例見(jiàn)7TzeMcGraw-州7/D/cf/0"a7o/C7zemz'ca/!Tems(Parker,S.，Ed.,McGraw-Hill,SanFrancisco(1985))(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。術(shù)語(yǔ)"患者，，包括人和獸醫(yī)對(duì)象?，F(xiàn)通過(guò)以下非限制性實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)施例只是出于說(shuō)明性目的來(lái)提供，并不能被解釋為限制本文的教導(dǎo)內(nèi)容。本文的附圖解釋如下圖la,顯示在荷A431異種移植肺瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制劑(-4-(4-氟-2-曱基吲咪-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉》處理后的組合功效。圖lb.顯示在荷A431異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制劑(-4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉》組合處理后對(duì)宿主體重變化的影響。圖2a,顯示在荷Colo205異種移植胂瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制劑(-4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)會(huì)唑啉))處理后的組合功效。圖2b.顯示在荷Colo205異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和VTKI(VEGF酪氨酸激酶抑制劑(-4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉))組合處理后對(duì)宿主體重變化的影響。圖3a,顯示在荷HT29異種移植胂瘤的小鼠中用mAb3.19.3和AZD2171處理后的組合功效。圖3b.顯示在荷HT29異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和AZD2171組合處理后對(duì)宿主體重變化的影響。圖4a,顯示在荷LoVo異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和Zactima處理后的組合功效。圖4b.顯示在荷LoVo異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和Zactima組合處理后對(duì)宿主體重變化的影響。圖5a,顯示在荷SW620結(jié)腸異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和mAbDC101處理后的組合功效。圖5b.顯示在荷SW620異種移植腫瘤的小鼠中用mAb3.19.3和mAbDC101組合處理后對(duì)宿主體重變化的影響。實(shí)施例1:抗體產(chǎn)生免疫將獲自R&DSystems,Inc.(Minneapolis,MN目錄號(hào)623-AM7CF)的重組人促血管生成素-2用作抗原?？勾傺苌伤?2單克隆抗體是通過(guò)連續(xù)免疫XenoMouse⑧小鼠(XenoMouse品系XMG2和XMG4(3C畫(huà)1品系)，Abgenix，Inc.Fremont,CA)來(lái)開(kāi)發(fā)。XenoMouse動(dòng)物對(duì)于所有注射都是通過(guò)足墊途徑進(jìn)行免疫。每次注射的總量為50^1/小鼠，每個(gè)足墊25pl。第一次注射是每只小鼠注射2.35嗎重組人促血管生成素-2(rh促血管生成素-2,目錄號(hào)623-AM/CF;批號(hào)BN023202A)，該重組人促血管生成素-2是在無(wú)熱原的Dulbecco，sPBS(DPBS)中并與10嗎CpG(15|nl的ImmunEasy小鼠佐劑，目錄號(hào)303101;批號(hào)11553042;Qiagen)1:1v/v混合。后面的6次加強(qiáng)注射是每只小鼠注射2.35(igrh促血管生成素-2和10pgCpG,該rh促血管生成素-2是在無(wú)熱原DPBS中并與25嗎Adju-Phos(磷酸鋁凝膠，目錄號(hào)1452-250,批號(hào)8937，HCIBiosector)混合，最后的加強(qiáng)注射是注射在無(wú)熱原DPBS中、但不加佐劑的2.35(igrh促血管生成素-2。XenoMouse小鼠是在第0、3、6、10、13、17、20和24天進(jìn)行這個(gè)方案的免疫，在第29天進(jìn)行融合。通過(guò)滴度選擇收獲用動(dòng)物被免疫XenoMouse小鼠的血清中的抗促血管生成素-2抗體滴度是通過(guò)ELISA進(jìn)行測(cè)定。筒單的說(shuō)，將重組促血管生成素-2(1昭/ml)在抗原包被緩沖液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6NaHC038.4g/L)中在4°C下過(guò)夜包^皮到CostarLabcoatUniversalBindingPolystyrene96孔板(Corning，Acton,MA)上。第二天，4吏用Biotek洗板機(jī)，用洗滌緩沖液(0.05。/。Tween20,于lxPBS中)將各板洗滌三次。然后將各板用200inl/孔封閉緩沖液(0.5。/。BSA、0.1%Tween20、0.01%硫柳汞，于lxPBS中)封閉，在室溫下溫育l小時(shí)。封閉1小時(shí)后，使用Biotek洗板機(jī)，用洗滌緩沖液洗涂各板三次。將來(lái)自促血管生成素-2免疫的XenoMouse小鼠或首次用于實(shí)驗(yàn)的XenoMouse動(dòng)物的血清在0.5%BSA/PBS緩沖液中重復(fù)兩次滴定，該BSA是進(jìn)行1:100初始稀釋后再進(jìn)行1:3稀釋。最后一個(gè)孔當(dāng)作空白。將這些板在室溫下溫育2小時(shí)，然后使用Biotek洗板機(jī)，用洗滌緩沖液洗滌各板三次。加入山羊抗人IgGFc特異性辣根過(guò)氧化物酶(HRP,Pierce,Rockford，IL)綴合抗體，最終濃度達(dá)1|ug/ml,在室溫下溫育1小時(shí)。然后使用Biotek洗板機(jī)，用洗滌緩沖液洗滌各板三次。洗滌后，加入TMB發(fā)色底物(BioFxBSTP-0100-01)保持10-20分鐘或者直到陰性對(duì)照孔開(kāi)始顯示顏色，對(duì)各板進(jìn)^f亍顯色。然后加入終止溶液(650nMTMB終止試劑(BioFxBSTP-0100-01),每瓶用100mlH20復(fù)溶)終止ELISA。從650nrn處的光密度測(cè)定每只XenoMouse動(dòng)物的比滴度。淋巴細(xì)胞的回收、B細(xì)胞分離、融合和雜交瘤的產(chǎn)生通過(guò)頸推脫位處死被免疫小鼠，將每組的流出淋巴結(jié)收獲并合并。將淋巴樣細(xì)胞通過(guò)在DMEM中研磨進(jìn)行解離，以從組織釋放出細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮于DMEM中。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，將0.9mlDMEM/108個(gè)淋巴細(xì)胞加到細(xì)胞沉淀，輕柔地但完全地使細(xì)胞重懸。用100^1lCD90+磁珠/l()8個(gè)細(xì)胞，通過(guò)將細(xì)胞與磁珠在4。C下溫育15分鐘，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。將含有多達(dá)108個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞(或總共多達(dá)2xl09個(gè)細(xì)胞)的磁性標(biāo)記細(xì)胞懸浮液加到LS+柱上，用DMEM洗滌柱子。收集全部的洗脫液，作為CD卯陰性流分(大多數(shù)這些細(xì)胞被認(rèn)為是B細(xì)胞)。融合是通過(guò)將上述的洗滌富集B細(xì)胞與購(gòu)自ATCC目錄號(hào)CRL1580的非分泌性骨髓瘤P3X63Ag8.653細(xì)胞(Kearneyetal，丄Immunol.123，1979,1548-1550)以1:1比例混合來(lái)進(jìn)行。將細(xì)胞混合物以800xg離心輕柔地進(jìn)行沉淀。完全除去上清液后，用2-4mL的鏈霉蛋白酶溶液(Ca舊iochem,目錄號(hào)53702,0.5mg/ml于PBS中)處理細(xì)胞不超過(guò)2分鐘。然后加入3-5mlFBS終止酶活性，用電細(xì)胞融合溶液(electrocellflisionsolution)(ECFS，0,3M蔗糖，Sigma,目錄號(hào)S7卯3，O.lmM乙酸鎂，Sigma，目錄號(hào)M2545,O.lmM乙酸鉀，Sigma,目錄號(hào)C4705)將懸浮液調(diào)至40ml總體積。離心后除去上清液，將細(xì)胞重懸于40mlECFS。重復(fù)這個(gè)洗涂步驟，將細(xì)胞再重懸于ECFS中至2xl(^個(gè)細(xì)胞/ml的濃度。用融合發(fā)生器(ECM2001型，Genetronic，Inc.,SanDiego，CA)進(jìn)行電細(xì)胞融合。所用的融合室大小為2.0ml,使用以下儀器設(shè)置;f交準(zhǔn)條件電壓50V,時(shí)間50秒膜破裂在電壓3000V,時(shí)間30insec融合后保持時(shí)間3秒。電細(xì)胞融合后，將細(xì)胞懸浮液在無(wú)菌條件下小心地從融合室取出，轉(zhuǎn)移到裝有等體積的補(bǔ)充有L-谷氨酰胺、pen/strep、OPI(草酰乙酸鹽、丙酮酸鹽、牛胰島素)(均自Sigma)和IL-6(BoehringerMannheim)的雜交瘤培養(yǎng)基(DMEM,JRHBiosciences),15%FBS(Hyclone)的無(wú)菌管中。將細(xì)胞在37。C下溫育15-30分鐘，然后以400xg(1000rpm)離心5分鐘。將細(xì)胞輕柔地重懸在少量的雜交瘤選擇培養(yǎng)基(補(bǔ)充有0.5xHA(Sigma目錄號(hào)A9666)的雜交瘤培養(yǎng)基)中，才艮據(jù)每個(gè)96孔板最終總共接種5xl()S個(gè)B細(xì)胞和每孔200pl，用更多的雜交瘤選擇培養(yǎng)基對(duì)體積進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。將細(xì)胞輕柔混合，用移液管轉(zhuǎn)移到96孔板中，讓其生長(zhǎng)。在第7天或第10天，除去一半的培養(yǎng)基，給細(xì)胞再流加雜交瘤選擇培養(yǎng)基。通過(guò)ELISA選擇候選抗體培養(yǎng)14天后，對(duì)雜交瘤上清液進(jìn)行促血管生成素-2特異性單克隆抗體的篩選。將ELISA板(Fisher,目錄號(hào)12-565-136)包被上50j^l/孔的人促血管生成素-2(2jug/ml，于包被緩沖液(O.lM碳酸鹽緩沖液，pHS>.6,NaHC038.4g/L)t),然后在々。C下溫育過(guò)夜。溫育后，用洗滌緩沖液(0.0S。/。Tween20,于PBS中)洗滌各板三次。加入200iul/孔的封閉緩沖液(0.5。/。BSA、0.1%Tween20、0.01%^克柳汞，于lxPBS中)，將各板在室溫下溫育1小時(shí)。溫育后，用洗滌緩沖液洗滌各板三次。加入50pl/孔的雜交瘤上清液及陽(yáng)性和陰性對(duì)照，將各板在室溫下溫育2小時(shí)。所用的陽(yáng)性對(duì)照總是來(lái)自促血管生成素-2免疫的XenoMouse小鼠(XMG2促血管生成素-2組1,足墊(Q))N160-7)的血清，陰性對(duì)照是來(lái)自KLH免疫的XenoMouse小鼠(XMG2KLH組，足墊(fp)L627-6)的血清。溫育后，用洗滌緩沖液洗滌各板三次。加入100^1/孔的檢測(cè)抗體山羊抗huIgGFc-HRP(目錄號(hào)No.H10507),將各板在室溫下溫育1小時(shí)。在第二次篩選中，將第一次篩選的陽(yáng)性者分兩組進(jìn)行篩選，第一組進(jìn)行hlgG檢測(cè)，另一組進(jìn)行hlgK輕鏈檢測(cè)(山羊抗hlgK-HRP(SouthernBiotechnology,目錄號(hào)2060-05),以證明IgG和IgK的完全人組成。溫育后，用洗滌緩沖液洗滌各板三次。加入100nl/孔的TMB(BioFXLab.目錄號(hào)TMSK-0100-01)，讓各板顯色約10分鐘(直到陰性對(duì)照孔剛剛開(kāi)始顯示顏色)。然后加入50p1/孔的終止溶液(TMB終止溶液，(BioFXLab.目錄號(hào)STPR-0100-01),將各板在ELISA讀板器上于450nm處讀數(shù)。有185個(gè)抗促血管生成素-2完全人IgGK抗體。促血管生成素-1的結(jié)合方面的反篩選，以鑒定能與促血管生成素-l交叉反應(yīng)的那些抗體。將ELISA板(Fisher,目錄號(hào)12-565-136)包被上50jul/孔的于包被緩沖液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6，NaHC038.4g/L)中的重組促血管生成素-l(2pg/ml,獲自R&DSystems,目錄號(hào)293-AN-025/CF)，然后在4。C下溫育過(guò)夜?？贵w標(biāo)識(shí)號(hào)和SEOIDNO下表1給出了抗促血管生成素-2抗體的標(biāo)識(shí)號(hào)及相應(yīng)重鏈和輕鏈基因的SEQIDNO。表1<table>complextableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>對(duì)促血管生成素-2與Tie-2的結(jié)合的抑制如上所述，促血管生成素-2是通過(guò)結(jié)合Tie-2受體發(fā)揮其生物作用。抑制促血管生成素-2/Tie-2結(jié)合的單克隆抗體通過(guò)用改進(jìn)的ELISA進(jìn)行竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定得到了鑒定。所用的單克隆抗體是從對(duì)促血管生成素-2有特異性的雜交瘤庫(kù)(hybridomapool)的50ml無(wú)遺漏上清液(exhaustivesupernatant)微量純化得到的產(chǎn)物。將96孔的NuncImmplates很用100pl的4嗎/ml重組人Tie-2/Fc融合蛋白(R&DSystems,Inc.,目錄號(hào)313-TI-100)在4。C下溫育過(guò)夜進(jìn)行包被。使用SkanWasher300station(SKATRON),用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌各板四次。將各孔用100pi的ABX封閉緩沖液(0.5%BSA、0.1%Tween、0.01%石充柳汞，于PBS中)封閉l小時(shí)。將100ng/ml的生物素?；亟M人促血管生成素-2(R&DSystems,Inc.目錄號(hào)BT623)加到每個(gè)孔，同時(shí)加入或不加入100嗎/ml的抗促血管生成素-2mAb。將各板在室溫下溫育兩小時(shí)，然后洗去未結(jié)合的分子。然后將結(jié)合的生物素酰化促血管生成素-2通過(guò)與100nl/孔的鏈霉親和素-HRP綴合物以1:200比例室溫下溫育半小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。洗滌兩次后，通過(guò)HRP底物(R&DSystems,目錄號(hào)DY998)檢測(cè)結(jié)合的鏈霉親和素。將各板溫育30分鐘，然后加入450終止溶液(100ili1/孔，BioFX,目錄號(hào)BSTP-0100-01)終止反應(yīng)。用SpectramaxPlus讀數(shù)器測(cè)定450nm處的吸光度。使用比促血管生成素-2摩爾過(guò)量10倍的可溶性重組Tie-2/Fc融合蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。在這個(gè)濃度下，Tie-2/Fc抑制促血管生成素-2與固定化Tie-2的結(jié)合達(dá)80。/。。以此為判斷標(biāo)準(zhǔn)，175個(gè)結(jié)合mAb的促血管生成素-2中有74個(gè)顯示抑制活性。每個(gè)雜交瘤用有限稀釋方法按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行克隆。從每個(gè)雜交瘤收集三個(gè)姊妹克隆。對(duì)于每個(gè)克隆，如上所述用ELISA對(duì)上清液進(jìn)行與人促血管生成素-2的結(jié)合和與促血管生成素-1的反結(jié)合方面的測(cè)試，以確保每個(gè)抗體只對(duì)促血管生成素-2有特異性。測(cè)定無(wú)遺漏上清液中的IgG濃度，從每個(gè)雜交瘤的三個(gè)姊妹克隆當(dāng)中選出產(chǎn)量最高的一個(gè)克隆進(jìn)行IgG純化。從每個(gè)上清液純化得到0.5-1mg的IgG作進(jìn)一步的表征。為定量mAb對(duì)促血管生成素-2與Tie-2的結(jié)合的抑制活性，用竟?fàn)幮越Y(jié)合測(cè)定法測(cè)定最佳候選者(topcandidate)的純化mAb的滴度。每個(gè)mAb濃度重復(fù)試驗(yàn)兩次。用GraphpadPrismTM圖形軟件進(jìn)行曲線擬合(非線性，S型曲線)，得出濃度-響應(yīng)關(guān)系。由該軟件計(jì)算出最大抑制(功效)和IC50(效應(yīng)強(qiáng)度)。選出了IO個(gè)同時(shí)顯示高功效和效應(yīng)強(qiáng)度的單克隆抗體；這些單克隆抗體的功效和效應(yīng)強(qiáng)度在表2中顯示。表2.抗促血管生成素-l/促血管生成素-2單克隆抗體的功效和效應(yīng)強(qiáng)度<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>*功效以與mAb(30嗎/ml)結(jié)合的促血管生成素-2和不與mAb結(jié)合的促血管生成素-2之比表示。然后通過(guò)測(cè)量mAb3.19.3與促血管生成素-1的親和力研究該mAb與促血管生成素-l的交叉反應(yīng)性。用Biacore分片斤法測(cè)定抗促血管生成素-l抗體親和力通過(guò)測(cè)量單克隆抗體與促血管生成素-1的親和力進(jìn)一步研究該抗體與促血管生成素-1的交叉反應(yīng)性。與如基于ELISA的反結(jié)合中所述的固定化促血管生成素-1不同的是，將單克隆抗體固定化到CM5Biacore芯片，注射促血管生成素-1溶液來(lái)測(cè)定開(kāi)速率(on-rate)和關(guān)速率(off-mte)。試驗(yàn)了以下六個(gè)單克隆抗體3.3.2、3.31.2、5.16.3、5.86,1、5.88.3和3.19.3。中等分辨率篩選利用無(wú)標(biāo)記表面等離子共振(SPR)或Biacore2000儀器，測(cè)量抗體對(duì)促血管生成素-1的親和力。為此目的，用常規(guī)的胺偶聯(lián)在CM5Biacore芯片上制備出高密度山羊oc-人抗體表面。對(duì)于展開(kāi)實(shí)驗(yàn)，將純化的mAbs(克隆3.3.2、3.31.2、5.16.3、5.86.1、5.88.3和3.19.3)在含有100嗎/mlBSA的HBS-P運(yùn)行緩沖液中稀釋至大約2.5-3.5嗎/ml。每個(gè)mAb的捕捉水平大約為150RU。每個(gè)捕捉循環(huán)后進(jìn)行5分鐘洗滌以使mAb基線穩(wěn)定化。將在運(yùn)行緩沖液中稀釋到87.4nM的單一促血管生成素-1樣品注射在所有捕捉表面上1分鐘。發(fā)現(xiàn)促血管生成素-1結(jié)合mAb3.19.3。通過(guò)將mAb捕捉水平提高到完全超過(guò)500-600RU并注射380nM促血管生成素-l持續(xù)l分鐘，重復(fù)進(jìn)行這個(gè)實(shí)驗(yàn)。還是發(fā)現(xiàn)促血管生成素-1結(jié)合mAb3.19.3。實(shí)施例2:組合研究已評(píng)估了mAb3.19.3與小分子VEGF酪氨酸激酶抑制劑的組合的活性。mAb3.19.3與4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氣基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合在A431和Colo2Q5異種移植模型中的治療功歲丈的測(cè)定用A431和Colo205細(xì)胞系分別在人皮膚表皮樣癌異種移植模型中(研究A)和在結(jié)腸直腸癌模型中(研究B)評(píng)估單克隆抗體3,19.3與VTKI4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)全唑啉的組合的抗腫瘤活性。將A431和Colo205細(xì)胞按常規(guī)在燒瓶中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到亞鋪滿(mǎn)。使用免疫缺陷的6-8周齡雌性小鼠(Ncr/nu/nu)。收獲細(xì)胞，懸浮于基質(zhì)凝膠(Matrigel)中。將含有1-5x106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液皮下注射到小鼠側(cè)腹中。各小鼠隨機(jī)分成不同的組，每組10-15只小鼠。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到200mn^時(shí)，將小鼠在每組中隨機(jī)化，開(kāi)始進(jìn)行處理。每周兩次持續(xù)2周腹膜內(nèi)注射mAb3.19.31Omg/kg(鹽水中)。每日經(jīng)口處理4-(4-氟_2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉，劑量為1.5-6mg/kg(于含1°/。Tween80的水中)。每周測(cè)量每個(gè)腫瘤的大小兩次。腫瘤的體積如下計(jì)算體積=長(zhǎng)x(寬)2x0.5(cm3)。研究A:mAb3.19.3與4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氣基)-6-甲氣基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合在A43l人腫瘤異種移植中的治療功效的測(cè)定A431組合異種移植功效研究的結(jié)果在圖la中顯示，圖中證明該組合比單獨(dú)的任一藥劑產(chǎn)生顯著大得多的活性。所實(shí)現(xiàn)的％胂瘤生長(zhǎng)抑制如下3.19.3(10mg/kg2xwk)=46%;(pO.Ol)4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)*唑啉(3mg/kg/天)=69%;(pO.OOl)3.19.3+4-(4-氟-2-甲基口引哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合=89%抑制(組合對(duì)單一藥劑的pO.OOl)。通過(guò)體重變化的測(cè)定，沒(méi)有觀察到該組合與單獨(dú)的單一藥劑處理相比較有另外的毒性(圖lb)。這些結(jié)果證明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3與VTKI4-(4-氟-2-曱基P引哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合處理在臨床前模型中導(dǎo)致功效改進(jìn)而又沒(méi)有增添毒性，為對(duì)這個(gè)組合作進(jìn)一步的臨床研究提供了基礎(chǔ)。研究B:mAb3.19.3與4-(4-氟-2-甲基。引咮-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合在人Colo205結(jié)腸腫瘤異種移植中的治療功效的測(cè)定Colo205組合異種移植功效研究的結(jié)果在圖2a中顯示，圖中證明該組合比單獨(dú)的任一藥劑產(chǎn)生顯箸大得多的活性。所實(shí)現(xiàn)的％抑制如下3.19.3(10mg/kg2xwk)=35%;(p<0.05)4-(4-氟-2-曱基吲哚-5-基氧基)-6-曱氧基-7-(3-哌咬子基丙氧基)喹唑啉(6mg/kg/天)-57。/。；(p<0.01)3.19.3+4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合-87。/。抑制(組合對(duì)單一藥劑的p0.001)。通過(guò)體重變化進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有觀察到該組合與單獨(dú)的單一藥劑處理相比較有另外的毒性(圖2b)。這些結(jié)果證明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3與VTKI4-(4-氟-2-甲基吲咮-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-哌啶子基丙氧基)喹唑啉的組合處理在臨床前模型中導(dǎo)致功效改進(jìn)而又沒(méi)有增添毒性，為對(duì)這個(gè)組合作進(jìn)一步的臨床研究提供了基礎(chǔ)。mAb3.19.3與AZD2171的組合在人HT29結(jié)腸腫瘤異種移植中的治療功效的測(cè)定評(píng)估了mAb3.19.3與AZD2171的組合在人HT29異種移植中的功效。簡(jiǎn)單的i兌，將O.lml無(wú)血清RoswellParkMemorialInstitute(RPMI)-1640培養(yǎng)基中的5xl()S個(gè)HT29肺瘤細(xì)胞皮下注射到60只無(wú)胸腺("w/m/基因型)小鼠的側(cè)腹。當(dāng)腫瘤達(dá)到200-400mn^的體積時(shí)(9_10天)，將小鼠隨機(jī)分組(每組8只)，開(kāi)始處理(第O天)。對(duì)照組(組l)每日口服(經(jīng)口，p.o.)僅僅給予載體，連續(xù)28天(第0-27天)。組2處理是每日經(jīng)口單獨(dú)給予AZD2171,1.5mg/kg/給予，連續(xù)28天(第0-27天)。AZD2171制備成于l。/。聚山梨醇酯80(即聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯在去離子水中的1%(v/v)溶液)中的懸浮液。組3在第0、3、7、10、14、17、21和24天接受八次腹膜內(nèi)(i.p)注射mAb3.19.3,10mg/kg/注射。組4每日經(jīng)口給予AZD2171,1.5mg/kg/給予，連續(xù)28天(第0-27天)，同時(shí)在第O、3、7、10、14、17、21和24天八次腹膜內(nèi)注射mAb3.19.3，10mg/kg/注射。AZD2171的給予體積為10.0ml/kg(即對(duì)于20g小鼠給予200iil)。mAb3.19.3的注射體積為10.0ml/kg(即對(duì)于20g小鼠注射200jal)。表3.劑量方案<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>通過(guò)雙邊游標(biāo)卡尺測(cè)量評(píng)估肺瘤體積(mm3)，每周至少兩次，長(zhǎng)度取跨腫瘤的最長(zhǎng)直徑，寬度取相應(yīng)的垂線，計(jì)算公式(tt/6)x(長(zhǎng)度x寬度)xV(長(zhǎng)度x寬度)。從處理的開(kāi)始算起的生長(zhǎng)抑制，通過(guò)比較對(duì)照組和處理組之間的胂瘤體積差異來(lái)評(píng)估。對(duì)于所有小鼠，研究在28天后停止。對(duì)于所有小鼠，將腫瘤切除，記錄研究終止時(shí)的重量。表4.處理對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>如圖3a和表4所示，mAb3.19.3與AZD2171的組合比單獨(dú)的3.19.3顯示顯著更高的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(組合對(duì)單一藥劑的pO.001:P值得自假設(shè)等方差的單尾兩樣品W企驗(yàn))。通過(guò)體重變化進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有觀察到該組合與單獨(dú)的單一藥劑處理相比較有另外的毒性(圖3b)。這些結(jié)果證明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3與VEGF抑制劑AZD2171的組合處理在臨床前模型中導(dǎo)致功效改進(jìn)而又沒(méi)有增添毒性，為對(duì)這個(gè)組合作進(jìn)一步的臨床研究提供了基礎(chǔ)0mAb3.19.3與Zactima的組合在人LoVo結(jié)腸腫瘤異種移植中的治療功效的測(cè)定在結(jié)腸直腸癌的LoVo異種移植模型中評(píng)估了單克隆抗體3.19.3的抗胂瘤活性。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將LoVo細(xì)胞按常規(guī)在燒瓶中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到亞鋪滿(mǎn)。使用了免疫缺陷的8周齡雄性NCr棵鼠。將含有3x106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液皮下注射到小鼠右側(cè)腹中，腫瘤體積達(dá)到200mn^后，將小鼠隨機(jī)分組，開(kāi)始處理。每周兩次持續(xù)2周腹膜內(nèi)注射mAb3.19.310mg/kg(鹽水中)。每日經(jīng)口處理Zactima,劑量為25-50mg/kg(于含l°/。Tween80的水中)。每周測(cè)量每個(gè)腫瘤的大小兩次。腫瘤的體積如下計(jì)算體積=長(zhǎng)x(寬)2x0.5(cm3)。如圖4a所示，mAb3.19.3和ZactimaTM作為單一藥劑顯著地延遲了LoVo肺瘤的生長(zhǎng)。但是，由以下肺瘤抑制數(shù)值證明，mAb3.19.3和ZD6474的組合比單獨(dú)的單一藥劑具有顯著更大的效果3.19.3(10mg/kg2xwk)=48%;(pO.OOl)Zactima頂(50mg/kg/天)-46。/。；(pO.OOl)3.19.3+ZactimaW組合=83%抑制(組合對(duì)單一藥劑的p〈0連)。通過(guò)體重變化進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有觀察到該組合與單獨(dú)的單一藥劑處理相比較有另外的毒性(圖4b)。這些結(jié)果證明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3與VEGF抑制劑Zactima的組合處理在臨床前模型中導(dǎo)致功效改進(jìn)而又沒(méi)有增添毒性，為對(duì)這個(gè)組合作進(jìn)一步的臨床研究提供了基礎(chǔ)。mAb3.19.3與mAbDC101的組合在人SW620結(jié)腸腫瘤異種移才A中的治療功效的測(cè)定評(píng)估了mAb3.19.3與單克隆抗體DC101(抗VEGFR-2/KDR)的組合在SW620結(jié)腸直腸癌異種移植模型中的抗腫瘤活性。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將SW620細(xì)胞在常規(guī)組織培養(yǎng)條件下在燒瓶中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到亞鋪滿(mǎn)。使用了免疫缺陷的8-10周齡NCr棵鼠，將含有大約lx106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸浮液皮下注射到小鼠右側(cè)腹中。腫瘤體積達(dá)到100miV后，將小鼠隨機(jī)分組，開(kāi)始處理。每周兩次持續(xù)3周腹膜內(nèi)注射mAb3.19.310mg/kg(鹽水中)。還腹膜內(nèi)注射mAbDC10115mg/kg(鹽水中)，同樣是每周兩次持續(xù)3周。每周測(cè)量每個(gè)腫瘤的大小兩次。肺瘤的體積如下計(jì)算體積=長(zhǎng)x(寬)2x0.5(cm3)。如圖5a所示，mAb3.19.3和DC101的組合顯示出比單獨(dú)的單一藥劑顯著更大的活性。以下腫瘤抑制數(shù)值也證明這一點(diǎn)3.19.3(10mg/kg2xwk)=480/0;(p<0.03)DC101(15mg/kg2xwk)=66%;(p<0.01)3.19.3+0(3101組合=93%抑制(組合對(duì)單一藥劑的卩<0.001)。通過(guò)體重變化進(jìn)行測(cè)定，沒(méi)有觀察到該組合與單獨(dú)的單一藥劑處理相比較有另外的毒性(圖5b)。這些結(jié)果證明，抗促血管生成素-2mAb3.19.3和抗VEGFR-2抗體DC101的組合處理在臨床前模型中導(dǎo)致功效顯著改進(jìn)而又沒(méi)有增添毒性。這個(gè)數(shù)據(jù)為對(duì)抗促血管生成素-2mAb3.19.3與其它抗血管生成抗體(包括阿瓦斯汀"^)的處理組合作進(jìn)一步的臨床研究提供了基礎(chǔ)。mAb3.19.3與阿瓦斯汀的組合在人肺瘤異種移植中的治療功效的測(cè)定單克隆抗體3.19.3與阿瓦斯汀頂?shù)慕M合的抗肺瘤活性可在人腫瘤的異種移植模型中進(jìn)行評(píng)估?？蓪431、Colo205、LoVo或其它細(xì)胞按常規(guī)在燒瓶中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到亞鋪滿(mǎn)?？刹捎妹庖呷毕莸?-10周齡雄性或雌性NCR棵鼠進(jìn)行模型開(kāi)發(fā)?？蓪⒓?xì)胞收獲，懸浮在基質(zhì)凝膠中，然后皮下注射到每只小鼠中。然后可將小鼠隨機(jī)分組，每組8-10只小鼠。阿瓦斯汀TM和mAb3.19.3可通過(guò)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來(lái)給予。每周可測(cè)量每個(gè)腫瘤的大小兩次。腫瘤的體積可如下計(jì)算體積=長(zhǎng)x(寬fx0.5cm3，或者通過(guò)雙邊游標(biāo)卡尺測(cè)量來(lái)計(jì)算，長(zhǎng)度M紳瘤的最長(zhǎng)直徑，寬度取相應(yīng)的垂線，計(jì)算公式(Ti/6)x(長(zhǎng)度x寬度)x々(長(zhǎng)度x寬度)。從處理的開(kāi)始算起的生長(zhǎng)抑制，可通過(guò)比較對(duì)照組和處理組之間的肺瘤體積差異來(lái)評(píng)估。mAb3.19.3與阿瓦斯汀，處理的組合預(yù)期產(chǎn)生出比單獨(dú)的單一藥劑顯著更高的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(組合對(duì)單一藥劑的p<0.01:P值得自假設(shè)等方差的單尾兩樣品f檢驗(yàn))。mAb3.19.3與SU11248(Sutent)或BAY43-9006(Sorafinib)的組合在人腫瘤異種移植中的治療功效的測(cè)定單克隆抗體3.19.3與Sutent或Somfinib的組合的抗腫瘤活性可在人腫瘤的異種移植模型中進(jìn)行評(píng)估?？蓪T29、A431、Colo205、LoVo或其它人胂瘤細(xì)胞按常規(guī)在燒瓶中培養(yǎng)，直到細(xì)胞達(dá)到亞鋪滿(mǎn)?？刹捎妹庖呷毕莸?-10周齡雄性或雌性NCR棵鼠進(jìn)行模型開(kāi)發(fā)?？蓪⒓?xì)胞收獲，懸浮在基質(zhì)凝膠中，然后皮下注射到每只小鼠中。然后可將小鼠隨機(jī)分組，每組8-10只小鼠。Sutent和mAb3.19.3可按照下表通過(guò)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射來(lái)給予。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>每周可測(cè)量每個(gè)腫瘤的大小兩次。胂瘤的體積可如下計(jì)算長(zhǎng)x(寬/x0.5cm3，或者通過(guò)雙邊游標(biāo)卡尺測(cè)量來(lái)計(jì)算，長(zhǎng)度取跨腫瘤的最長(zhǎng)直徑，寬度取相應(yīng)的垂線，計(jì)算公式(7c/6)x(長(zhǎng)度x寬度)x々(長(zhǎng)度x寬度)。從處理的開(kāi)始算起的生長(zhǎng)抑制，可通過(guò)比較對(duì)照組和處理組之間的腫瘤體積差異來(lái)評(píng)估。mAb3.19.3與Sutent或Sorafmib的組合預(yù)期產(chǎn)生出比單獨(dú)的單一藥劑顯著更高的腫瘤生長(zhǎng)抑制作用(組合對(duì)單一藥劑的p<0.01:P值得自假設(shè)等方差(assumingequalvariance)的單尾兩樣品t-檢驗(yàn))。表1中所列單克隆抗體的可變區(qū)的核苷酸和多肽序列如下所示。抗促血管生成素-2單克隆抗體3.3.2重鏈可變區(qū)的核苷酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGAGAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAAGGTATAGCAGTGGCTGGGCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCC丁CAGCC(SEQIDNO:1)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFSSY窗SWVRQ(SEQIDNO:2)輕鏈可變區(qū)的核苦酸序列:GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGACTGTTAGCAGCGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGAGCATCCATTAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTCCTGTCAGCAGTATTATAACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA(SEQIDNO:3)輕鏈可變區(qū)的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQTVSSDLAWYQQKPGQAPRLLIYGASIRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYSCQQYYNWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:4)抗促血管生成素-2單克隆抗體3.19.3重鏈可變區(qū)的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCACTAACTATGGCATGCACTGGGGCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCACATGATGGAAATAATAAGTATTATGTAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGAATCGATTTTTGGAGTGGCCTCAACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCC(SEQIDNO:5)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFTNYG固WGRQAPGKGLEWVAVISHDGNNKYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLA(SEQIDNO:6)輕鏈可變區(qū)的核苦酸序列GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTACCGGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGACTCCTCATCTGTGGTGCATCCAGCTGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGTAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATAGTAGTTCACCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAACGA(SEQIDNO:7)輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSITGSYLAWYQQKPYYCQQYSSSPITFGQGTRLEIKR(SEQIDNO:8)抗血管生成素-2單克隆抗體3.31.2重鏈可變區(qū)的核苷酸序列GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGCTATTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGCAAGATGGAAGTGACAAATACTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCTGTGCGAGAGATATGGGCAGTGGCTGGTTTGACTACTGGGG重鏈可變區(qū)的氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQRMNSLRAEDTAVFYCARDMGSGWFDYWGQGTLVTVSSA(SEQIDNO:10)輕鏈可變區(qū)的核香酸序列GAAGTAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTGCTGTCAGCAGTATAATCACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA(SEQIDNO:輕鏈可變區(qū)的^J^^列EWMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGSNLAWYQQKPCCQQYNHWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:12)抗血管生成素-2單克隆抗體5.16.3重鏈可變區(qū)的核香*列CAGGTACAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTTCTATATGTACTGGGTGCGACAGGCCCCGTAGTGGCACAAACCATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGATATAGCAACAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGC(SEQIDNO:13)重鏈可變區(qū)的M酸序列:QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGFYMYWVR(SEQIDNO:14)輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列:GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCACCCGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAACTGGTGGACGTTCGGCCGAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAA(SEQIDNO:15)輕鏈可變區(qū)的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWWTFGRGTKVEIKR(SEQIDNO:16)抗血管生成素-2單克隆抗體5.28.1重鏈可變區(qū)的核苷酸序列GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAATCGTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATACCATGCACTGGGTCCGTCAAACTCCGGGGAAGGGTCTGGAGTGGGTCTCTCTTATTAGTTGGGATGGTGGTAGCACATACTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACAGCAAAAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAACTGAGGACACCGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGATATAGATATAGCAGTGGCTGGTACAGGATTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:17)重鏈可變區(qū)的M酸序列EVQLVESGGIWQPGGSLRLSCAASGFTFDDYTMHWVRQTNSLRTEDTALYYCAKDIDIAVAGTGFD鼎GQGTLVTVSSA(SEQIDNO:18)輕鏈可變區(qū)的核普酸序列GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTACCAGCAACCTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATTAATTAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATAATAACTGGCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGA(SEQIDNO:19)輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列EI程TQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVTSNLAWYQQKPYCQQYNNWPFTFGPGTKVDIKR(SEQIDNO:20)抗血管生成素-2單克隆抗體5.78.3重鏈可變區(qū)的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGCTGGAACTACGCAGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:21)重鏈可變區(qū)的氨基餅列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRMELSRLRSDDTAVYYCARDRGWNYADYYYYGMDVWGQGTTVTVSSA(SEQIDNO:22)輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列GACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGCGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAGCCAGAGTGTTTTATACAGTTCCAACAATCAGAACTTCTTAGCTTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAACTGCTCATTTACTGGGCATCTACCCGGGAATCCGGGGTCCCTGACCGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATGTGGCAGTTTATTACTGTCACCAATAGATTAAACGA(SEQIDNO:23)輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列EDVAVYYCHQYYSTPITFGQGTRLEIKR(SEQIDNO:24)抗血管生成素-2單克隆抗體5.86.1重鏈可變區(qū)的核苦酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACCATATGTACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGCTGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGTGAGAGATCAGGGTATAGCAGCAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGTGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:25)重鏈可變區(qū)的M酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYHMYWVR(SEQIDNO:26)輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列:GACATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTTGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGAAAGCCCCTAAGTTCCTGATCTATGCTGCATCTAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACACTACCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGA(SEQIDNO:27)輕鏈可變區(qū)的M酸序列DI腹TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISTYLNWYQQKPGYCQQSYTTPFTFGPGTKVDIKR(SEQIDNO:28)抗血管生成素-2單克隆抗體5.88.3重鏈可變區(qū)的核苦酸序列GAGGTGCAGATGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTAAGAAGCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAAGGAAGACGGAAGTGAGAAATACCATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCGAGAACTCACTGTTTCTGCAAATGAGCAGCCTGCGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATATGGAAGCATCAGCTGGCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:29)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列MSSLRAEDTAVYYCARDMEASAGLFDYWGQGTLVTVSSA(SEQIDNO:30)輕鏈可變區(qū)的核苦酸序列GAAATAGTGATGACGCAGTCCCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCATCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATTACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGA(SEQIDNO:31)輕鏈可變區(qū)的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERAILSCRASQSISSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:32)抗血管生成素-2單克隆抗體5.101.1重鏈可變區(qū)的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAACCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCTTACATGGAGCTGAGGAGGCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGGGTAGTATACCAGTGTCTGGTCACTTTGACTACTGGGGGCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:33)重鏈可變區(qū)的氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVPA(SEQIDNO:34)輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列:GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTATCAGCAACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTTTGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCATCAGTATAATAACTGGTGGACG35)輕鏈可變區(qū)的M酸序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSLISNLAWYQQKPGQAPRLLIFGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHQYNNWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:36)抗血管生成素-2單克隆抗體5.103.1重鏈可變區(qū)的核苷酸序列CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCCTCAGTCAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCGGCTACTATTTGTACTGGGTGCCACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCCCTAACAGTGGTGGCACAAACTATGCACAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGTGCGAGAGATCAGGTCATAGCAGTAGCTGGTCCCTTTGACTACTGGGCCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCT(SEQIDNO:37)重鏈可變區(qū)的M酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLYWVPQ(SEQIDNO:38)輕鏈可變區(qū)的核苦酸序列GAAACAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGTCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTATCAGCAGCTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAATAATTGGTGGACG39)輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列ETVMTQSPATLSVSPGERVTLSCRASQSVISSLAWYQQKPGCQQYNNWWTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO:40)本文引述的所有參考文獻(xiàn)，包括專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、論文、教科書(shū)等及其中引述的參考文獻(xiàn)，通過(guò)引用整體結(jié)合到本文中。前面的書(shū)面說(shuō)明書(shū)被認(rèn)為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。前面的說(shuō)明內(nèi)容和實(shí)施例詳述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，描述了本發(fā)明人所構(gòu)思的最佳方式。但是應(yīng)認(rèn)識(shí)到，前述內(nèi)容無(wú)論在文本上可能顯得如何詳盡，本發(fā)明都還可用多種方式進(jìn)行實(shí)施，本發(fā)明應(yīng)按照所附權(quán)利要求或其任何等同權(quán)利要求進(jìn)行解釋。權(quán)利要求1.促血管生成素-2生物活性的拮抗劑和以下物質(zhì)的生物活性的拮抗劑的組合i.VEGF-A，和/或ii.KDR，和/或iii.Flt1。2.權(quán)利要求1的組合,其中促血管生成素-2的拮抗劑是抗體。3.權(quán)利要求2的組合，其中促血管生成素-2的拮抗劑是完全人單克隆抗體。4.權(quán)利要求2或3中任一項(xiàng)的組合，其中所述抗體結(jié)合的表位與以下任何一個(gè)完全人單克隆抗體相同i.3.31.2，或ii.5.16.3,或iii.5.86.1，或iv.5.88.3,或V.3.3.2,或vi.5.103.1，或vii.5.101.1，或viii.3.19.3,或ix.5.28.1，或X.5.78.3。5.權(quán)利要求4的組合，其中所述抗體是選自以下任何一個(gè)的完全人單克隆抗體i.3.31.2，或ii.5.16.3,或iii.5.86.1，或iv.5.88.3,或v.3.3.2,或vi.5.103.1，或vii.5.101.1，或viii.3.19.3，或ix.5,28.1，或x,5.78.3。6.權(quán)利要求1的組合,其中KDR或FItl的生物活性的拮抗劑是抗體。7.權(quán)利要求1的組合,其中VEGF-A的生物活性的拮抗劑是抗體。8.權(quán)利要求7的組合,其中VEGF-A的生物活性的拮抗劑是阿瓦斯汀或DC101。9.權(quán)利要求1的組合，其中KDR或FItl的生物活性的拮抗劑是化合物。10.權(quán)利要求9的組合,其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗劑是酪氨酸激酶抑制劑。11.權(quán)利要求10的組合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗劑選自ZactimaTM、AZD2171、SU11248、SU148B、Vatalanib、BAY43隱9006、XL-647、XL-999、AG曙013736、AMG706、BIBF1120、TS函、GW786034、AEE788、CP-547632、KRN951、CHIR258、CEP-7055、OSI-930、ABT-869、E7080、ZK-304709、BAY57-9352、L-21649、BMS582664、XL-880、XL-184或XL-820。12.權(quán)利要求11的組合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗劑選自ZactimaTM、AZD2171、SU11248或BAY43-卯06。13.權(quán)利要求11的組合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗劑是Zactima1^。14.權(quán)利要求11的組合，其中KDR或Fltl的生物活性的拮抗劑是AZD2171。15.包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合的藥物組合物。16.—種拮抗促血管生成素-2和以下任何.-種物質(zhì)的生物活性的方法i.VEGF誦A,和/或ii.KDR，和/或iii.Fltl，所述方法包括給予權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合。17.—種治療哺乳動(dòng)物中的疾病相關(guān)性血管發(fā)生的方法，所述方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合。18.—種治療哺乳動(dòng)物中的癌癥的方法，所述方法包括給予治療有效量的權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合。全文摘要本發(fā)明涉及具有抗血管生成活性并因此可用于治療與動(dòng)物或人體中的血管發(fā)生有關(guān)的疾病狀態(tài)的方法的活性物質(zhì)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及促血管生成素-2生物活性的拮抗劑和VEGF-A和/或KDR和/或FIt1生物活性的拮抗劑的組合，以及這種拮抗劑的用途。文檔編號(hào)A61P35/00GK101370519SQ200680052740公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2006年12月12日優(yōu)先權(quán)日2005年12月15日發(fā)明者D·C·布萊基,J·L·布朗,S·C·埃梅里申請(qǐng)人:阿斯利康(瑞典)有限公司