專利名稱：由小分子靶向人癌中的gli蛋白的制作方法
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本申請(qǐng)要求2005年12月9日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/748,968和2006年1月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)60/763,829、2006年12月7日提交的美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/608,197的優(yōu)先權(quán)，將其全部?jī)?nèi)容納入本文作參考。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明總地涉及抑制腫瘤發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)和腫瘤存活的組合物和方法。該組合物包含抑制Hedgehog和GLI信號(hào)傳導(dǎo)途徑的小分子化合物。

背景技術(shù)：
在胚胎發(fā)生、組織再生和癌發(fā)生的過程中，Hedgehog(Shh或Hh)、WNT、FGF和BMP信號(hào)傳導(dǎo)途徑形成網(wǎng)絡(luò)。Hh信號(hào)傳導(dǎo)途徑的異常激活導(dǎo)致的病理后果是各種人體腫瘤，如胃癌和胰腺癌。Hedgehog是一種分泌糖蛋白，它通過結(jié)合含有PATCHED1(ptch1)和SMOOTHENED(smo)的跨膜蛋白復(fù)合物和引發(fā)胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件級(jí)聯(lián)反應(yīng)而啟動(dòng)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括抑制導(dǎo)致GLI鋅指轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄的蛋白激酶A。接著，鋅指轉(zhuǎn)錄因子GLI家族以內(nèi)容依賴性和細(xì)胞類型特異性方式將胞外Hh刺激轉(zhuǎn)化成確定的轉(zhuǎn)錄程序(Ruiz I Altaba等，2002，Nat.Rev.Cancer 2361-72)。
包括GLI蛋白在內(nèi)的幾種蛋白質(zhì)參與介導(dǎo)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Katoh和Katoh，2005，Cancer Biol.Ther.41050-4)。脊椎動(dòng)物至少有三種不同的GLI蛋白，即GLI(也稱為GLI1)、GLI2和GLI3。這些蛋白質(zhì)是鋅指轉(zhuǎn)錄因子GLI家族的成員，共享高度保守的C2-H2鋅指結(jié)構(gòu)域(含有五個(gè)鋅指DNA-結(jié)合基序)，含有果蠅(Drosophila)翅脈中斷(Cubitus interruptus)(Ci)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)性別決定基因tra-1(Hui等，1994，Dev.Biol.162402-13)。在果蠅中，需要Ci來激活hedgehog靶點(diǎn)，Ci也用作Hedgehog表達(dá)的阻抑物。
在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育期間，所有表達(dá)部分重疊的基因響應(yīng)Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而被轉(zhuǎn)錄激活，能夠介導(dǎo)激活該途徑引起的大部分效應(yīng)。在脊椎動(dòng)物發(fā)育過程中，GLI1、GLI2和GLI3各自具有特定功能(Kinzler等，1984，Nature332371-374；Ruppert等，1988，Mol.Cell.Biol.83104-3113；Walterhouse等，1993，Dev.Dyn.19691-102；Hui等，1994，Dev.Biol.162402-413)。例如，Gli2突變小鼠顯示出嚴(yán)重的骨骼異常，包括顎裂、牙齒缺陷、椎體和椎間盤缺失、四肢和胸骨短小(Mo等，1997，Development 124113-23)。
Gli3是幾種身體結(jié)構(gòu)的發(fā)育和分化中的重要控制基因。例如，基因數(shù)量下降導(dǎo)致嚴(yán)重的干擾，特別是對(duì)于四肢形態(tài)發(fā)生(Vortkamp等，1995 DNACell Biol.14629-34)。另外，在幾種人體畸形綜合征，如影響四肢和顱面發(fā)育的格雷格頭多指(cephalopolydactyly)綜合征(GCPS)和Pallister-Hall綜合征的常染色體顯性形式中鑒定到GLI3的突變。(Vortkamp等，1991，Nature352539-40；Bose等，2002，Hum.Mol.Genet.111129-35)。在小鼠中，小鼠突變的多余趾中牽扯到GLI3突變。
GLI蛋白用作轉(zhuǎn)錄激活物，通過其鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合于靶基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列內(nèi)的DNA結(jié)合位點(diǎn)。近年來，鑒定到GLI蛋白結(jié)合的DNA結(jié)合序列。例如，GLI3鋅指結(jié)合的DNA序列由16個(gè)核苷酸組成，與GLI和tra-1蛋白結(jié)合的序列高度相似(Vortkamp等，1995，DNA Cell.Biol.14629-34)。這一結(jié)合位點(diǎn)包括以前在GLI蛋白中鑒定到的9-堿基對(duì)序列5′-GACCACCCA-3′(Kinzler和Vogelstein，1990，Mol.Cell Biol 10634-42)。據(jù)信，GLI、GLI2和GLI3結(jié)合相同或相似的DNA序列(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.2733496-3501)。近年來，Hallikas等驗(yàn)證了作為GLI1、GLI2和GLI3蛋白結(jié)合位點(diǎn)的9bp共有序列5′-GACCACCCA-3′(Hallikas等，2006，Cell 12447-59)。
由GLI2和GLI3蛋白激活Hh/GLI靶基因可能需要轉(zhuǎn)錄共激活蛋白Creb Bing蛋白(CBP)，它能結(jié)合CBP結(jié)合域(參見

圖1；Dai等，1999，J.Biol.Chem.2748143-52；Kasper、Regl、Frischauf和Aberger，2006，Eur.J.Cancer)。
據(jù)報(bào)道，GLI1表達(dá)在GLI2和GLI3蛋白的控制下(Dai等，1999，J.Biol.Chem.2748143-52)。雖然整個(gè)GLI1蛋白是轉(zhuǎn)錄激活物，但GLI2和GLI3同時(shí)含有激活域和阻抑域(見圖1)?？赏ㄟ^蛋白激酶A(PKA)的作用加工GLI2和GLI3實(shí)現(xiàn)不同功能。全長(zhǎng)GLI2用作弱轉(zhuǎn)錄激活物。截短一半C末端活化結(jié)構(gòu)域會(huì)產(chǎn)生具有阻抑活性的蛋白質(zhì)，而去除N末端的阻抑結(jié)構(gòu)域則將GLI2轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)激活物。在轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎中，不像全長(zhǎng)蛋白質(zhì)那樣，N末端截短的GLI2能激活(例如)Sonic hedgehog(Shh)基因HNF3β。這表明，暴露GLI2的激活結(jié)構(gòu)域是Shh信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵機(jī)制之一。也描述了GLI3(而非GLI)的涉及N末端區(qū)的相似調(diào)控機(jī)制。(Sasaki等，1999，Development 1263915-24，全文納入本文作參考)。
鼠和人GLI3 cDNA的比較揭示出，推倒出的氨基酸序列之間總體同源性為85％，在某些結(jié)構(gòu)域(包括鋅指)中保守性更高(>95％)(Thien等，1996，Biochim.Biophys.Acta 1307267-9)。
近年來，在包含氨基酸殘基1020-1091的羧基端鑒定到GLI的轉(zhuǎn)錄激活域。此結(jié)構(gòu)域包含18個(gè)氨基酸α-螺旋(氨基酸1037-1054)，其中含有6個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基或(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.2733496-3501)。這一α螺旋區(qū)與單純皰疹病毒蛋白16(VP16)轉(zhuǎn)錄激活域非常相似，包含保守基序FXXΦΦ(F＝苯丙氨酸；X＝任何殘基；Φ＝任何疏水性殘基)，稱作TAFII31的酸性激活域的普通識(shí)別元件。此外，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)保守的氨基酸殘基(VP16中的Asp472、Phe479和Leu483和GLI中的Asp1040、Phe1048和Leu1052)能與TBP相關(guān)因子(TAF)TAFII31直接接觸(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.2733496-3501；Goodrich等，1993，Cell 75519-530；Klemm等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 925788-5792；Uesugi等，1997，Science2771310-1313)。
其它GLI家族蛋白中存在相似的結(jié)構(gòu)域。例如，描述過推定TAFU31結(jié)合域，其包含NH2-INKDNLRKDLFTVSIKA-COOH(果蠅Ci，氨基酸殘基1044-1060)，NH2-DMADFEFEQMFTDALGI-COOH(VP16，氨基酸殘基469-485)，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI，氨基酸殘基1037-1054)，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(小鼠GLI，氨基酸殘基1040-1057)，NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512)和NH2-DSQLLEPPQIDFDAIMDD-COOH(小鼠GLI2，氨基酸殘基1509-1526)。(Yoon等，1998，J.Biol Chem.2733496-3501)。此外，可由(如)GenBank登錄號(hào)AAY87165鑒定到人GLI2的推定TAFII31相互作用結(jié)構(gòu)域NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(氨基酸殘基1501-1518)。另外，可由(如)GenBank登錄號(hào)Q61602鑒定到小鼠GLI3的推定TAFII31相互作用結(jié)構(gòu)域NH2-ESHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(氨基酸殘基1497-1514)。用粗體和下劃線表示接觸TAFII31的保守氨基酸殘基。
雖然我們對(duì)果蠅和鼠發(fā)育過程中的Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)知之甚多，但對(duì)隨人癌中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和GLI活性而激活的分子機(jī)制和成瘤程序的了解仍然非常有限。Hh相關(guān)性癌癥的共同特性是一種或多種GLI蛋白表達(dá)水平升高。例如，近年來，發(fā)現(xiàn)GLI1在很多癌癥類型中過度表達(dá)，包括前列腺癌、胰腺癌和小細(xì)胞肺癌(Karhadkar等，2004，Nature 431707-12)。此外，發(fā)現(xiàn)Gli在兒童肉瘤中擴(kuò)增，在惡性膠質(zhì)瘤中增加了50倍以上(Roberts等，1989，Cancer Res.495407-13；Kinzler等，1987，Science 23670-3)。雖然業(yè)已發(fā)現(xiàn)Hedgehog(Hh)和其受體Patched(Ptch)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中過表達(dá)，但在這一癌癥類型中沒有發(fā)現(xiàn)GLI1的表達(dá)。
例如，與正常皮膚相比，在基底細(xì)胞癌(BCC)病變中發(fā)現(xiàn)GLI2過度表達(dá)(Ecram等，2004，J.Invest Dermatol 1221503-9；Regl等，2002，Oncogene215529-39；Hutchin等，2005，Genes Dev.19214-23)。此外，根據(jù)GLI2和GLI3的加工，在許多癌癥類型(包括肺癌和前列腺癌)的腫瘤發(fā)生過程中，GLI2和/或GLI3可能對(duì)激活Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)更重要。
肺癌是美國(guó)和世界上癌癥死亡的主要原因，每年美國(guó)新診斷的肺癌病例>170,000，全球新診斷的肺癌病例則將近一百萬(Minna等，2002，CancerCell.1(1)49-52)。盡管在過去幾十年中產(chǎn)生了一些治療肺癌的激進(jìn)方法，但肺癌的5年存活率仍然低于15％。肺癌分為兩類非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)。NSCLC(占所有癌癥的75-80％)由三種主要類型組成腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌(Minna等，2002，Cancer Cell.1(1)49-52)。肺癌和鱗狀細(xì)胞癌占所有肺癌的60-70％。在晚期疾病中通常采用手術(shù)、化療和放療，但結(jié)果并不令人滿意。提高肺癌治療功效是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生目標(biāo)。
前列腺癌可能是男性最常見的實(shí)體瘤(Nelson等，2003，N.Engl.J.Med.349366-381)。例如，50％超過50歲的男性和基本上所有超過70歲的男性都患有某種形式的前列腺增生。在美國(guó)，前列腺癌是最頻繁診斷的癌癥，每年診斷的新病例超過250,000例。每年有40,000男性死于前列腺癌。
因此，對(duì)涉及Hh/GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的各種頻發(fā)和致死性惡性腫瘤而言，特異性靶向Hh/GLI-信號(hào)傳導(dǎo)途徑可提供治療各種致死性腫瘤的非常有效的治療方案(Pasca di Magliano和Hebrok，2003，Nat.Rev.Cancer 3903-911；Sanchez等，2005，Cancer Res.652990-2；Kasper、Regl、Frischauf和Aberger，2006，Eur.J.Cancer)。異位Hh或GLI信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活導(dǎo)致的人類疾病的治療可能需要使用通路拮抗劑。迄今為止，通過在不同水平上阻斷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)拮抗劑的治療抑制異位活性。例如，抗-Shh抗體在細(xì)胞外發(fā)揮作用，而植物生物堿，環(huán)杷明在細(xì)胞膜中的Smo水平發(fā)揮作用(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?005/0130922 A1；Taipale等，2000，Nature4061005-9；Sanchez和Ruiz I Altaba，2005，Mech.Dev.122(2)223-30；Athar等，2004，Cancer Res.64(20)7545-52)。描述了Hedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和Smo結(jié)合的小分子調(diào)節(jié)劑，包括合成的非肽小分子Hh-Ag(Frank-Kamenetsky等，2002，J.Biol.1(2)10)、HhAntag(Romer等，2004，Cancer Cell.6(3)229-40)和Cur61414(Williams等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(8)4616-21)。此外，利用福斯高林在細(xì)胞內(nèi)激活蛋白激酶A(PKA)，它是GLI信號(hào)傳導(dǎo)途徑的胞質(zhì)抑制劑。然而，這些方法有缺點(diǎn)。例如，給予治療有效量的抗Shh抗體在患者中難以實(shí)現(xiàn)并可能影響其它正常的通路依賴性細(xì)胞。環(huán)杷明非常昂貴，僅可用于治療通過在Smo或以上水平激活Hh信號(hào)傳導(dǎo)途徑產(chǎn)生的疾病。另外，由于PKA的廣泛活性，給予福斯高林可能產(chǎn)生許多副作用。相反，使用抑制GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子化合物則大有希望。
本發(fā)明者解決了在GLI蛋白，特別是GLI3過度表達(dá)的癌癥治療中尚未滿足的巨大需求。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)和治療GLI3蛋白過度表達(dá)的許多癌癥的小分子化合物、藥物組合物、試劑盒和方法。這類癌癥包括肺癌、NSCLC、乳腺癌、結(jié)腸癌、間皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤等。
發(fā)明概述 在本發(fā)明中，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)，GLI3蛋白的激活域(約70kDa)在多種人癌細(xì)胞系中過度表達(dá)，這些細(xì)胞系包括肺癌、NSCLC、乳腺癌、結(jié)腸癌、間皮瘤、黑色素瘤、肉瘤、前列腺癌、卵巢癌、腎癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤等細(xì)胞系。也在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌和肉瘤組織樣品中發(fā)現(xiàn)了GLI3的過度表達(dá)(>95％)。
因此，本發(fā)明者提出，在這些癌癥、而非正常細(xì)胞中抑制GLI3蛋白的活性形式能誘導(dǎo)顯著凋亡?？赏ㄟ^不同方式抑制GLI3蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括但不限于(i)直接抑制GLI3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性，(ii)抑制GLI3前體蛋白的加工，(iii)抑制GLI3激活域的磷酸化，或者(iv)抑制任何參與活性GLI3蛋白產(chǎn)生過程的細(xì)胞蛋白?？赏ㄟ^多種方式抑制GLI3蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如使用小分子化合物、siRNA、肽或反義寡核苷酸。本發(fā)明提供了抑制GLI蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，特別是GLI3蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子化合物。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供具有下式的小分子化合物
式中X1和X2各自獨(dú)立地是N或C，式中X1和X2之一是N，X1和X2之一是C，因此環(huán)N與X1或X2的C形成雙鍵。此外，R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自用0-3個(gè)R6基團(tuán)任選取代的C1-C6烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基，所述R6基團(tuán)各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、-OR7、-C(O)R7、-OC(O)R7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、-N(R7)C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標(biāo)m是0、1或2。Y是直接鍵或C1-C4烷基，Z選自C1-C4烷基、芳基和雜芳基。R4是氫、鹵素、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標(biāo)m是0、1或2。R5是氫、C1-C6烷基，或任選與Y聯(lián)合形成5-6元雜環(huán)。R7各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基。
此外，也考慮了本發(fā)明小分子化合物的鹽、水合物、溶劑合物、異構(gòu)體和前藥。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是芳基。在另一實(shí)施方式中，R1、R2和R3各自是苯基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中R4是羥基。在另一實(shí)施方式中，Z是C1-C4烷基。在另一實(shí)施方式中，Z是芳基。在又一實(shí)施方式中，Z是苯基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是苯基，Y是C1-C4烷基，Z是C1-C4烷基或苯基，R4是羥基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中X1是C、X2是N。在又一實(shí)施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結(jié)構(gòu)
在又一實(shí)施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結(jié)構(gòu)
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中X1是N、X2是C。在另一實(shí)施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結(jié)構(gòu)
在又一實(shí)施方式中，具有該式的小分子化合物具有以下結(jié)構(gòu)
本發(fā)明還提供了藥物組合物和藥物。因此，在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了含有本發(fā)明小分子化合物和藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的藥物組合物。
本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明小分子化合物的方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種誘導(dǎo)表達(dá)GLI蛋白的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的方法。此方法包括使腫瘤細(xì)胞與足量的本發(fā)明小分子化合物相接觸的步驟，其中所述接觸步驟能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。GLI蛋白優(yōu)選GLI2或GLI3。
在該方法的一個(gè)實(shí)施方式中，給予所述小分子化合物作為癌癥治療方案的一部分。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種抑制細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為的方法。該方法包括確定該細(xì)胞是否表達(dá)GK基因或是GLI蛋白的步驟。該方法還包括使所述細(xì)胞與有效量的本發(fā)明小分子相接觸的步驟，其中所述接觸步驟導(dǎo)致抑制所述細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中的至少一種行為。
用于本發(fā)明方法的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞選自結(jié)腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
可以在體外或體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療癌癥患者的方法。該方法包括給予該對(duì)象治療有效量的小分子化合物的步驟，其中所述癌癥的特征是表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽，所述給藥步驟導(dǎo)致治療該對(duì)象。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了一種抑制細(xì)胞中GLI蛋白活性的方法。該方法包括使所述細(xì)胞與本發(fā)明小分子化合物相接觸的步驟，其中所述接觸步驟導(dǎo)致抑制了所述細(xì)胞中GLI蛋白的活性。受抑制的GLI蛋白活性優(yōu)選是GLI蛋白與細(xì)胞蛋白或核蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用。優(yōu)選的核蛋白是TAF蛋白、TATA框結(jié)合蛋白相關(guān)因子，優(yōu)選TAFII31蛋白。
另外，本發(fā)明提供了一種抑制含有操作性連接于該基因啟動(dòng)子的GLIDNA結(jié)合位點(diǎn)的基因表達(dá)的方法。此方法包括使表達(dá)GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)操作性連接于其啟動(dòng)子的基因的細(xì)胞與本發(fā)明小分子化合物相接觸的步驟，其中所述接觸步驟導(dǎo)致抑制該基因的表達(dá)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基因是Wnt2基因，優(yōu)選人Wnt2基因。
另外，本發(fā)明提供了本發(fā)明小分子化合物在制備抑制細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為的藥物中的應(yīng)用。在另一方面，提供了小分子化合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。在又一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了小分子化合物在制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。在另一方面，提供了本發(fā)明小分子化合物在制備抑制細(xì)胞的GLI蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物中的應(yīng)用。
另一方面，本發(fā)明提供了篩選方法。本發(fā)明優(yōu)選方法是鑒定能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用的候選化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟使候選化合物與含有GLI蛋白和TAFII31蛋白的樣品相接觸；和確定GLI蛋白與TAFII31蛋白的結(jié)合。與不存在候選化合物時(shí)GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合相比，在候選化合物存在下GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合水平降低表明該候選化合物能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白的相互作用。
本文提供的另一種方法是鑒定調(diào)節(jié)GLI蛋白活性的化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，GLI蛋白活性是GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性，該方法用于鑒定調(diào)節(jié)GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性的化合物。所述方法包括使樣品與候選化合物相接觸的步驟，其中所述樣品包含具有操作性連接于報(bào)道基因的一個(gè)或多個(gè)GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)報(bào)道構(gòu)建物；以及如果有，則測(cè)定所述候選化合物對(duì)GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性水平的影響。
附圖簡(jiǎn)要說明 圖1顯示了GLI3的轉(zhuǎn)錄激活域的位置。GLI3轉(zhuǎn)錄激活域位于C末端附近，含有保守的VP16樣激活區(qū)(TAFII31結(jié)合域)，是GLI3的激活功能、而非GLI3的阻抑功能所必需。認(rèn)為此FXXΦΦ基序與TAFII31直接接觸。在GLI3中，此結(jié)構(gòu)域含有氨基酸序列FDAII。
圖2顯示了用于檢測(cè)人細(xì)胞系中的Gli3表達(dá)的半定量RT-PCR分析。該圖中，上圖是GLI3的示意圖，顯示了阻抑結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基1-397)、鋅指結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基482-637)和CBP-結(jié)合域(氨基酸殘基827-1132)。指出了PCR引物F2和R2的大概位置(詳見表1)。該圖中，中間的圖片(泳道1-17)顯示了用RT-PCR分析的以下細(xì)胞系正常肝臟(泳道1)；NSCLCH1703、H460和A549(泳道2-4)；乳腺癌HuL100、BT474和MCF-7(泳道5-7)；間皮瘤Met5A、H290、REN、H513、H28、211H和LARK1A(泳道8-14)；結(jié)腸癌SW480(泳道15)；一對(duì)原代NSCLC組織樣品(泳道16和17分別是正常和癌癥組織)。該圖中，下圖(泳道1-29)顯示了用RT-PCR分析的以下細(xì)胞系結(jié)腸癌SW480、HCT116、HT29、Lovo和CaCO2(泳道1-5)；正常結(jié)腸(泳道6)；正常腎細(xì)胞系HRE-152和HK-2(泳道7和8)；腎細(xì)胞癌786-Om Caki、769-P、A704和OMRC3(泳道9-13)；正常肺(泳道14)；間皮瘤REN、H290、211H、H513、H2052、H28和MS-I(泳道15-21)；NSCLCA549、H460、H838、H1703、H1229、H1650、H1975和A427(泳道22-29)。大多數(shù)癌細(xì)胞系和原代組織樣品表達(dá)Gli3。值得注意的是，在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29中沒有檢測(cè)到Gli3的表達(dá)(下圖，泳道2)。詳見實(shí)施例4。
圖3顯示了手工繪制的小分子化合物FN1-5和GLI3的FXXΦΦ基序(氨基酸序列FDAII)的RMS重疊圖。FDAII顯示為α螺旋。詳見(如)實(shí)施例2。
圖4顯示了小分子化合物FN1-1、FN1-2、FN1-3、FN1-5和FN2-1的初步篩選。設(shè)計(jì)該小分子化合物以抑制GLI3轉(zhuǎn)錄激活(TAF-結(jié)合域)。觀察到小分子化合物FN1-5能顯著殺傷所有檢測(cè)的癌細(xì)胞。DMSO用作對(duì)照。詳見(如)實(shí)施例5。
圖5是流式細(xì)胞術(shù)分析圖，其中顯示小分子化合物FN1-5能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480凋亡。在100μM FN1-5時(shí)觀察到顯著凋亡(58.6％)，這與染色結(jié)果相符。詳見(如)實(shí)施例5和6。
圖6顯示用細(xì)胞毒試驗(yàn)和NSCLC細(xì)胞系H1299、A549和H460篩選小分子化合物FN1-7、FN1-8和FN3-5，如本文所述。用小分子化合物FN1-8處理時(shí)，在所有癌細(xì)胞中觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用。詳見(如)實(shí)施例5。
圖7顯示用小分子化合物FN1-5、FN1-8、FN1-7、FN1-9U和FN1-9S處理LOX細(xì)胞(黑色素瘤)后細(xì)胞毒試驗(yàn)的結(jié)果。一致性地，用FN1-5和FN1-8處理時(shí)觀察到顯著細(xì)胞殺傷作用。用小分子化合物FN1-7和FN1-9U孵育LOX細(xì)胞時(shí)也觀察到一些殺傷作用?；罴?xì)胞用0.5％結(jié)晶紫染色。DMSO用作對(duì)照。詳見(如)實(shí)施例10。
圖8顯示不同小分子化合物對(duì)由組織樣品新鮮制備的原代培養(yǎng)的人間皮瘤細(xì)胞的作用。在FN1-5和FN1-8中觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用。在相同劑量下，小分子化合物FN1-8殺傷這種原代培養(yǎng)物的效力高于FN1-5。DMSO用作對(duì)照。詳見(如)實(shí)施例11。
圖9顯示用小分子化合物FN1-1、FN1-2、FN1-3、FN1-5、FN1-7、FN1-8、FN2-1、FN2-5和FN3-5調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中的Wnt2啟動(dòng)子活性。FN1-5和FN1-8均能顯著下調(diào)Wnt2啟動(dòng)子活性。DMSO和＂空載體＂是對(duì)照。詳見(如)實(shí)施例27。
圖10顯示用小分子化合物FN1-5、FN1-7、FN1-8、FN1-9U、FN1-9S、FN2-1和FN3-5調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116的TOP/FOP活性。發(fā)現(xiàn)FN1-5和FN1-8能顯著下調(diào)TOP/FOP活性。DMSO用作對(duì)照。詳見(如)實(shí)施例31。
圖11顯示，小分子化合物FN1-5和FN1-8不調(diào)節(jié)NSCLC A549細(xì)胞的SOCS3啟動(dòng)子活性。空載體和DMSO用作對(duì)照。詳見(如)實(shí)施例32。
圖12顯示用FN1-5和FN1-8處理后結(jié)腸癌細(xì)胞中Dvl-3、胞漿β-聯(lián)蛋白、存活素和肌動(dòng)蛋白(對(duì)照)的Western印跡分析。小分子化合物FN1-5和FN1-8能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。詳見(如)實(shí)施例33。
圖13顯示用FN1-5和FN1-8處理后NSCLC細(xì)胞中Dvl-3、胞漿β-聯(lián)蛋白、存活素和肌動(dòng)蛋白(對(duì)照)的Western印跡分析。小分子化合物FN1-5和FN1-8能抑制NSCLC細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。詳見(如)實(shí)施例33。
圖14顯示時(shí)程實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，表明FN1-8能誘導(dǎo)Malme-3M細(xì)胞(A)、A375細(xì)胞(B)和SK-Mel-5細(xì)胞(C)發(fā)生顯著凋亡，而不誘導(dǎo)人正常皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞(D)凋亡。詳見實(shí)施例10。
圖15顯示小分子化合物FN1-8能下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞系Malme-3M(A)、A375(B)、SK-Mel-2(C)和SK-Mel-5(D)中GLI1-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。詳見實(shí)施例29。
圖16顯示小分子化合物FN1-8能降低NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中GLI蛋白-TAF誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活水平。詳見實(shí)施例35。
圖17顯示小分子化合物FN1-8在小鼠異種移植瘤模型NSCLCH460(箭頭)和黑色素瘤LOX(箭頭)中的體內(nèi)功效。用FN1-8處理后顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。詳見(如)實(shí)施例36和37。
圖18顯示用小鼠異種移植瘤模型(NSCLC H460)進(jìn)行的小分子化合物FN1-8的體內(nèi)功效研究。A.用小分子化合物FN1-8處理后顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。箭頭指出每天注射小分子化合物FN1-8或用作對(duì)照的DMSO(連續(xù)6天各兩次)。B.顯示由各組小鼠切下的腫瘤。DMSO，DMSO處理；FN1-8，用本文所述的小分子化合物FN1-8處理。C.用FN1-8處理后瘤重顯著降低。結(jié)果是平均值±SD(誤差線)。詳見(如)實(shí)施例36。
圖19顯示用小鼠異種移植瘤模型(黑色素瘤LOX)進(jìn)行的小分子化合物FN1-8的體內(nèi)功效研究。A.用小分子化合物FN1-8處理后顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)。箭頭指出每天注射小分子化合物FN1-8或用作對(duì)照的DMSO(連續(xù)6天各兩次)。B.顯示由各組小鼠切下的腫瘤。DMSO，DMSO處理；FN1-8，用本文所述的小分子化合物FN1-8處理。C.用FN1-8處理后瘤重顯著降低。結(jié)果是平均值±SD(誤差線)。詳見(如)實(shí)施例37。
圖20顯示用小鼠異種移植瘤模型(結(jié)腸癌HT29)進(jìn)行的小分子化合物FN1-8的體內(nèi)功效研究。詳見實(shí)施例35。A.用小分子化合物FN1-8處理后腫瘤生長(zhǎng)不受影響。箭頭指出每天注射小分子化合物FN1-8或用作對(duì)照的DMSO(連續(xù)6天各兩次)。B.用FN1-8處理后瘤重類似于DMSO對(duì)照組。結(jié)果是平均值±SD(誤差線)。詳見(如)實(shí)施例38。
圖21顯示小分子化合物FN1-5(A)和FN1-8(B)在小鼠(腹膜內(nèi)注射)中的藥代動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表示為獲自三只小鼠的數(shù)據(jù)的平均值和SD(誤差線)。詳見實(shí)施例43。
圖22顯示小分子化合物FN1-5(A)和FN1-8(B)在小鼠(口服給藥)中的藥代動(dòng)力學(xué)分析。結(jié)果表示為獲自三只小鼠的數(shù)據(jù)的平均值和SD(誤差線)。詳見實(shí)施例43。
圖23顯示共免疫沉淀分析的定量結(jié)果，該結(jié)果證明，小分子化合物FN1-8能阻斷GLI蛋白和TAFII31蛋白的蛋白質(zhì)相互作用。通過測(cè)定共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中各條帶的密集度(任意單位)定量測(cè)定GLI-TAF結(jié)合域肽(GLI-TAFbd)和TAFII31蛋白的結(jié)合。將DMSO處理后各GLI-TAFbd肽的結(jié)合設(shè)定為100％。FN1-8以劑量依賴方式干擾了這種結(jié)合用20 μM和50μM FN1-8處理后，GLI1-TAFbd的結(jié)合分別為73.6％和33.5％，GLI2-TAFbd分別為73.8％和60％，GLI3-TAFbd分別為71.6％和28.6％。詳見實(shí)施例35。
發(fā)明詳述 I.定義 除非另有定義，本文所用的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。以下參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明所用許多術(shù)語的普通定義Singleton等，微生物學(xué)和分子生物學(xué)字典(Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology)(第2版，1994)；The CambridgeDictionary of Science and Technology(劍橋科技字典)(Walker編，1988)；TheGlossary of Genetics(遺傳學(xué)詞匯表)，第5版，R.Rieger等(編)，SpringerVerlag(施普林格出版社)(1991)；以及Hale和Marham，The Harper CollinsDictionary of Biology(哈珀柯林斯生物學(xué)字典)(1991)。本文所用的以下術(shù)語具有所屬含義，除非另有說明。
本文所用術(shù)語＂烷基＂指含有所示碳原子數(shù)的直鏈或支鏈烴基(即C1-C10指1-10個(gè)碳)，可包括二價(jià)和多價(jià)基團(tuán)。飽和烴基的例子包括以下基團(tuán)，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的類似物和異構(gòu)體。
本文所用術(shù)語＂烯基＂指含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的不飽和烷基。烯基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁間二烯基)、2，4-戊二烯基和3-(1，4-戊二烯基)以及更高級(jí)的類似物和異構(gòu)體。
本文所用術(shù)語＂炔基＂指含有一個(gè)或多個(gè)三鍵的不飽和烷基。炔基的例子包括乙炔基、1-丙炔基、1-和2-丁炔基以及更高級(jí)的類似物和異構(gòu)體。
術(shù)語＂氨基酸＂指天然產(chǎn)生和合成的氨基酸，以及功能類似于天然產(chǎn)生氨基酸的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然產(chǎn)生氨基酸是遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。＂氨基酸類似物＂指與天然產(chǎn)生氨基酸的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)相同的化合物，如含有結(jié)合于氫、羧基、氨基和R基團(tuán)的α碳，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物可含有修飾的R基團(tuán)(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)仍然與天然產(chǎn)生氨基酸相同。＂氨基酸模擬物＂指化學(xué)結(jié)構(gòu)與氨基酸的普通化學(xué)結(jié)構(gòu)不同、但功能與天然產(chǎn)生氨基酸類似的化合物。
氨基酸可用公知的三字母符號(hào)或由IUPAC-IUB生化命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)表示。同樣，核苷酸也可用其普遍接受的單字母代號(hào)表示。
本文所用術(shù)語＂芳基＂指含有5-12個(gè)環(huán)原子的多不飽和芳香烴取代基，它可以是單環(huán)或者稠合在一起或共價(jià)連接的多環(huán)(至多三環(huán))。芳基的非限制性例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基和芐基。本發(fā)明也可采用其它芳基。
本文所用的＂生物樣品＂是含有核酸或多肽的生物組織或液體的樣品。這類樣品一般來自人，但包括分離自除人之外的哺乳動(dòng)物或嚙齒動(dòng)物，如小鼠和大鼠的組織。生物樣品也可包括組織切片，如活檢樣品和尸檢樣品、為組織學(xué)目的的冷凍切片、血液、血漿、血清、痰液、糞便、淚液、粘液、毛發(fā)、皮膚等。生物樣品也包括外植體以及來自患者組織的原代和/或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物。＂生物樣品＂也指來自動(dòng)物的細(xì)胞或細(xì)胞群或一定量的組織或液體。生物樣品常常是從動(dòng)物體內(nèi)取出的，但術(shù)語＂生物樣品＂也可指在體內(nèi)分析(即不用從動(dòng)物體內(nèi)取出)的細(xì)胞或組織。＂生物樣品＂一般含有動(dòng)物細(xì)胞，但該術(shù)語也指可用于測(cè)量癌癥相關(guān)性多核苷酸或多肽水平的無細(xì)胞生物物質(zhì)，如血液、唾液或尿液的無細(xì)胞組分。本發(fā)明可采用許多類型的生物樣品，包括但不限于組織活檢樣品、血樣、口腔刮出物、唾液樣品或乳頭溢液。本文所用的＂組織活檢＂指一定量的從動(dòng)物，優(yōu)選人取出用于診斷分析的組織。在癌癥患者中，可取出腫瘤中的組織，用于分析腫瘤內(nèi)的細(xì)胞。＂腫瘤活檢＂可指任何類型的活檢，如穿刺活檢、細(xì)針穿刺活檢、手術(shù)活檢等。
＂提供生物樣品＂指獲得用于本發(fā)明所述方法的生物樣品。常常通過從患者中取出細(xì)胞樣品完成這一過程，但也可使用以前分離的細(xì)胞(如另一個(gè)人、在另一個(gè)時(shí)間和/或出于另一種目的分離)，或在體內(nèi)進(jìn)行本發(fā)明方法，來完成這一過程。有治療或結(jié)果歷史的存檔組織特別有用。
＂癌細(xì)胞＂、＂轉(zhuǎn)化＂細(xì)胞或在組織培養(yǎng)物中＂轉(zhuǎn)化＂指自發(fā)性或誘導(dǎo)性表型改變，不一定包括攝入了新的遺傳物質(zhì)。雖然可通過轉(zhuǎn)化病毒的感染和摻入新的基因組DNA，或攝取外源性DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但也可自發(fā)地或通過接觸致癌物而轉(zhuǎn)化，從而使內(nèi)源性基因突變。轉(zhuǎn)化與表型改變有關(guān)，例如細(xì)胞永生化、異常生長(zhǎng)控制、非形態(tài)改變和/或惡變(參見Freshney，Cultureof Animal Cell a Manual of Basic Technique(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè))(第3版，1994))。
術(shù)語＂細(xì)胞生長(zhǎng)改變＂指體外或體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的任何改變，如形成灶、貼壁非依賴性、半固體或軟瓊脂生長(zhǎng)、接觸抑制改變和生長(zhǎng)的密度限制、缺少生長(zhǎng)因子或血清要求、細(xì)胞形態(tài)改變、獲得或失去永生化、獲得或失去腫瘤特異性標(biāo)記、注入合適的動(dòng)物宿主時(shí)形成或抑制腫瘤的能力和/或細(xì)胞永生化。參見例如，F(xiàn)reshney，Culture of Animal Cell a Manual ofBasic Technique(動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè))第231-241頁(第3版，1994)。
＂使含量關(guān)聯(lián)＂指將一個(gè)樣品中測(cè)定的物質(zhì)、分子或標(biāo)記(如Gli或GLI)的含量與另一樣品中測(cè)定的相同物質(zhì)、分子或標(biāo)記的含量作比較。在另一樣品中測(cè)定的相同物質(zhì)、分子或標(biāo)記的量可能對(duì)給定癌癥特異。
本發(fā)明范圍內(nèi)也包括術(shù)語＂測(cè)定量＂的同義詞，包括但不限于檢測(cè)、測(cè)定、測(cè)試或確定某分子如Gli或GLI的存在、不存在、量或濃度。
本文所用術(shù)語＂環(huán)烷基＂指含有3-15個(gè)碳和1-3個(gè)稠合或共價(jià)連接環(huán)的飽和環(huán)烴。本發(fā)明所用的環(huán)烷基包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。本發(fā)明所用的雙環(huán)烷基包括但不限于[3.3.0]雙環(huán)辛烷基、[2.2.2]雙環(huán)辛烷基、[4.3.0]雙環(huán)壬烷、[4.4.0]雙環(huán)癸烷(萘烷)、螺環(huán)[3.4]辛烷基、螺環(huán)[2.5]辛烷基等。
本文所用術(shù)語＂環(huán)烯基＂指含有3-15個(gè)碳和1-3個(gè)稠合或共價(jià)連接環(huán)的的不飽和環(huán)烴。本發(fā)明所用的環(huán)烯基包括但不限于環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基、環(huán)庚烯基和環(huán)辛烯基。本發(fā)明也可采用雙環(huán)烯基。
＂測(cè)定功能作用＂指測(cè)定某化合物提高或降低受GLI蛋白間接或直接影響的參數(shù)的作用，如功能、酶、物理和化學(xué)作用。這類功能作用可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式測(cè)定，如光譜特征改變(如熒光、吸光度、折射率)、流體力學(xué)(如形狀)、色譜或該蛋白的溶解度特性，測(cè)定誘導(dǎo)標(biāo)記或GLI蛋白的轉(zhuǎn)錄激活；測(cè)定結(jié)合活性如結(jié)合TAF蛋白(如TAFII31)的活性，測(cè)定細(xì)胞增殖、測(cè)定凋亡等。也可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)驗(yàn)如體外實(shí)驗(yàn)，如軟瓊脂上的細(xì)胞生長(zhǎng)；貼壁依賴性；接觸抑制和生長(zhǎng)的密度限制；細(xì)胞增殖；細(xì)胞轉(zhuǎn)化；生長(zhǎng)因子或血清依賴性；腫瘤特異性標(biāo)記水平；侵入基質(zhì)膠；體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞中mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)和癌細(xì)胞的其它特征，來測(cè)定化合物(如小分子化合物)對(duì)癌癥的功能作用?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多方式評(píng)估功能作用，例如，用顯微鏡定量或定性測(cè)定形態(tài)特征的改變、測(cè)定Gli RNA或蛋白質(zhì)水平的改變、測(cè)定RNA穩(wěn)定性、鑒定下游或報(bào)道物基因表達(dá)(CAT、熒光素酶、β-gal、GFP等)，如通過化學(xué)發(fā)光、熒光、比色反應(yīng)、抗體結(jié)合、誘導(dǎo)標(biāo)記和配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。＂功能作用＂包括體外、體內(nèi)和離體活性。
本發(fā)明范圍包括術(shù)語＂測(cè)定＂的同義詞，包括但不限于檢測(cè)、測(cè)定、測(cè)試或確定某分子如GLI多肽、標(biāo)簽、本發(fā)明小分子化合物的存在、不存在、量或濃度。該術(shù)語指定性或定量測(cè)定。
在Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或Wnt2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，術(shù)語＂下調(diào)＂或＂抑制＂指經(jīng)Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或Wnt2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的已知實(shí)驗(yàn)測(cè)定，部分或完全阻斷Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)或Wnt2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制劑是(例如)本發(fā)明小分子化合物。
用于治療的本發(fā)明小分子化合物的＂有效量＂、＂有效劑量＂、＂足量＂或其語法等同形式是足以緩解、或以某種方式減輕癥狀或者阻止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展的量。通過給予具體藥物組合物緩解特定疾病如癌癥的癥狀指，可能與給予該藥物組合物有關(guān)的永久性或暫時(shí)性、持續(xù)性或瞬時(shí)性減輕?？稍隗w內(nèi)和體外給予“有效量”。
“表達(dá)載體”或“表達(dá)構(gòu)建物”是重組或合成產(chǎn)生的核酸構(gòu)建物，其含有能夠在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄特定核酸的一系列專用核酸元件。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒、病毒或核酸片段的一部分。表達(dá)載體一般包含待轉(zhuǎn)錄的操作性連接于啟動(dòng)子的核酸。
術(shù)語＂GLI＂指GLI蛋白家族。GLI蛋白包括GLI(也稱為GLI1)、GLI2和GLI3。優(yōu)選的GLI蛋白是GLI1、GLI2或GLI3。
術(shù)語＂Gli＂指GLI蛋白編碼基因。因此，Gli1，Gli2和Gli3分別是編碼GLI1、GLI2和GLI3蛋白的基因。
術(shù)語＂GLI蛋白活性＂指GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括例如，GLI轉(zhuǎn)錄激活下游基因、GLI蛋白與GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合以及GLI蛋白與其它蛋白如TAF或共同激活物如CBP(Creb蛋白結(jié)合蛋白)的結(jié)合。
術(shù)語＂GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)＂指GLI蛋白能結(jié)合并且可由其激活基因轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)參見例如Vortkamp等(1995，DNA Cell.Biol.14629-34)Kinder和Vogelstein(1990，Mol.Cell.Biol.10634-42)和Yoon等(998，J Biol Chem 2733496-3501)。例如，GLI3鋅指結(jié)合的GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)參見Vortkamp等(1995，DNA Cell.Biol.14629-34)由16個(gè)核苷酸組成，與GLI和tra-1蛋白結(jié)合的序列高度相似。此結(jié)合位點(diǎn)包含9-堿基對(duì)序列5′-GACCACCCA-3′。應(yīng)理解，GLI3 DNA結(jié)合位點(diǎn)不需要與Vortkamp等(1995，DNA Cell.Biol.14629-34)鑒定的GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)100％相同。例如，近年來，Hallikas等確定了GLI1、GLI2和GLI3的DNA結(jié)合特異性，也發(fā)現(xiàn)GLI結(jié)合于(例如)5′-TACCAACCCA-3′、5′-GCCCACCCA-3′、5′-GGCCACCCA-3′和5′-GATCACCCA-3′，其中下劃線核苷酸表示9 bp共有序列的差異(Hallikas等，2006，Cell 124(1)47-59；全文納入本文作參考)。本領(lǐng)域已知確定GLI蛋白與GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的實(shí)驗(yàn)，包括例如，電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA；Fried和Crothers，1981，Nucleic Acids Res.96505-6525；Hallikas等，2006，Cell 12447-59)、SELEX(Roulet等，2002Nat.Biotechnol.20831-835)和色譜結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
＂GLI＂多肽包括天然產(chǎn)生或重組的形式。因此，在一些實(shí)施方式中，本文所述的GLI多肽和GLI亞域多肽可包含對(duì)應(yīng)人GLI序列的序列。因此，本文提供了示范性GLI，它是本領(lǐng)域已知的。例如，鑒定了幾種脊椎動(dòng)物GLI1、GLI2和GLI3蛋白，例如人GLI1(GenBank登錄號(hào)NM_005269、P08151)、小鼠GLI1(GenBank登錄號(hào)NM_010296、AB025922、AAC09169、P47806)、斑馬魚GLI1(GenBank登錄號(hào)NM_178296)、人GLI2(GenBank登錄號(hào)NM_030381；NM_030380；NM-030379、DQ086814)、小鼠GLI2(GenBank登錄號(hào)XM_922107)、人GLI3(GenBank登錄號(hào)NM_000168、AJ250408、M57609、P10071、AAY87165)、黑猩猩GLI3(GenBank登錄號(hào)NM_001034190、AY665272、Q5IS56)、小鼠GLI3(GenBank登錄號(hào)X95255、NM_008130、NP_032156、Q61602)、大鼠GLI3(GenBank登錄號(hào)XM_225411)、斑馬魚GLI3(GenBank登錄號(hào)NM_205728、AY377429)。
GLI蛋白可以是全長(zhǎng)GLI蛋白，或者可以是部分GLI蛋白，如GLI蛋白亞域。例如，＂GLI3＂多肽指人GLI3的多肽和多態(tài)性變體、等位基因、突變體(i)其氨基酸序列優(yōu)選在至少約100、150、200、250、300、500或更多氨基酸的區(qū)域上與選自GenBank登錄號(hào)NM_000168、AJ250408、M57609、P10071和AAY87165的人GLI3的氨基酸序列的相同性大于約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，優(yōu)選91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高，(ii)包含氨基酸基序FXXΦΦ(F＝苯丙氨酸；X＝任何殘基；Φ＝任何疏水性殘基)，優(yōu)選氨基酸序列FDAII，(iii)包含轉(zhuǎn)錄激活域，(iv)結(jié)合GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)和/或(v)結(jié)合TAF。
＂Gli核酸＂或＂gli多核苷酸＂指編碼GLI、GLI2或GLI3蛋白的脊椎動(dòng)物基因。＂Gli核酸＂包括天然產(chǎn)生或重組的形式。Gli多核苷酸或GLI多肽編碼序列一般來自人，但可能來自其它哺乳動(dòng)物，包括但不限于除人之外的靈長(zhǎng)動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物如大鼠、小鼠或倉鼠；牛、豬、馬、綿羊或其它哺乳動(dòng)物。已經(jīng)克隆和鑒定了用于實(shí)施本發(fā)明的Gli核酸，例如人Gli1(GenBank登錄號(hào)NM_005269)、小鼠Gli1(GenBank登錄號(hào)NM_010296、AB025922)、斑馬魚Gli1(GenBank登錄號(hào)NM_178296)、人Gli2(GenBank登錄號(hào)NM_030381；NM_030380；NM-030379、DQ086814)、小鼠GH2(GenBank登錄號(hào)XM_922107)、人GH3(GenBank登錄號(hào)NM_000168、AJ250408、M57609)、黑猩猩Gli3(GenBank登錄號(hào)NM_001034190、AY665272)、小鼠Gli3(GenBank登錄號(hào)X95255、NM_008130)、大鼠Gli3(GenBank登錄號(hào)XM_225411)、斑馬魚Gli3(GenBank登錄號(hào)NM_205728、AY377429)。Gli多核苷酸可以是全長(zhǎng)Gli多核苷酸，即編碼完整GLI蛋白的多核苷酸，或者可以是編碼GLI蛋白亞域的部分Gli多核苷酸。
術(shù)語＂GLI途徑＂、＂GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)＂或＂GLI信號(hào)傳導(dǎo)途徑＂可互換使用，指hedgehog蛋白與其受體結(jié)合啟動(dòng)、導(dǎo)致GLI蛋白表達(dá)和/或激活的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
本文所用術(shù)語＂鹵素＂指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)等元素。
術(shù)語＂hedgehog＂與術(shù)語＂Hh＂可互換使用，它是結(jié)合Hh受體而啟動(dòng)Hh信號(hào)傳導(dǎo)途徑、導(dǎo)致GLI蛋白表達(dá)或激活的細(xì)胞因子。哺乳動(dòng)物中有三種Hh家族基因，它們是超聲刺猬基因(Sonic hedgehog，Shh)、印度刺猬基因(India hedgehog，Ihh)和沙漠刺猬基因(Desert hedgehog，Dhh)。本領(lǐng)域已知幾種脊椎動(dòng)物hedgehog蛋白，例如，人SHH、鼠SHH、大鼠SHH、人IHH和鼠DHH。
本文所用術(shù)語＂雜芳基＂指含有5-12個(gè)環(huán)原子的多不飽和芳香烴取代基，它可以是單環(huán)或稠合在一起或共價(jià)連接的多環(huán)(至多三環(huán))，環(huán)中至少有一個(gè)雜原子，如N、O或S。雜芳基可通過雜原子連接于該分子的其余部分。雜芳基的非限制性例子包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-異噁唑基、4-異噁唑基、5-異噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。本發(fā)明所用的其它雜芳基包括吡啶基N-氧化物、四唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基，或者被取代、特別是單取代或雙取代的任何上述基團(tuán)。
本文所用術(shù)語＂雜環(huán)烷基＂指含有3-15個(gè)環(huán)原子和1-3個(gè)稠合或共價(jià)連接環(huán)的飽和環(huán)烴，環(huán)中至少有一個(gè)雜原子，如N、O或S。此外，雜原子可占據(jù)雜環(huán)與該分子其余部分連接的位置。雜環(huán)烷基的例子包括1-(1，2，5，6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
本文所用術(shù)語＂異構(gòu)體＂指具有不對(duì)稱碳原子(光學(xué)中心)或雙鍵的本發(fā)明化合物。本發(fā)明范圍內(nèi)包括外消旋物、非對(duì)映異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體和單獨(dú)異構(gòu)體。
＂標(biāo)簽＂或＂可檢測(cè)部分＂是可用分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理手段檢測(cè)的組合物。例如，有用的標(biāo)簽包括3H、125I、32P、熒光染料、電子致密試劑、酶(如通常用于ELISA的酶)、生物素、異羥基洋地黃毒甙元或半抗原和蛋白質(zhì)或可通過某種方式(如將放射性標(biāo)記摻入小分子化合物)得以檢測(cè)的其它實(shí)體。該標(biāo)簽可摻入小分子化合物的任何位置上。
生物樣品中所用的術(shù)語＂Gli mRNA水平＂或＂Wnt2 mRNA水平＂指細(xì)胞或生物樣品中存在的分別由Gli或Wnt基因轉(zhuǎn)錄的mRNA量。mRNA通常編碼功能性GLI或WNT蛋白，但可能存在改變或消除編碼蛋白功能的突變。＂Gli mRNA水平＂或＂Wnt2 mRNA水平＂不需要定量，但可簡(jiǎn)便地通過人的主觀觀測(cè)得以檢測(cè)(與或不與對(duì)照樣品水平或?qū)φ諛悠奉A(yù)計(jì)水平作比較)。
生物樣品中的＂GLI多肽水平＂或＂Wnt2多肽水平＂指細(xì)胞或生物樣品中存在的分別由Gli或Wnt2 mRNA翻譯的多肽的量。多肽可能具有或不具有GLI或WNT2蛋白活性。＂GLI多肽水平＂或＂WNT2多肽＂不需要定量，但可簡(jiǎn)便地通過人的主觀觀測(cè)得以檢測(cè)(與或不與對(duì)照樣品水平或?qū)φ諛悠奉A(yù)計(jì)水平作比較)。
本文所用的多肽(如GLI)水平或活性的“調(diào)節(jié)劑”包括該多肽的激活劑和/或抑制劑，用該術(shù)語描述能激活或抑制多肽表達(dá)水平或多肽活性的化合物。優(yōu)選多肽是GLI1、GLI2或GLI3。激活劑是(例如)誘導(dǎo)或激活本發(fā)明多肽表達(dá)或結(jié)合、刺激、提高、打開、激活、幫助或增強(qiáng)活化、敏化或上調(diào)本發(fā)明多肽的活性的化合物。激活劑包括天然產(chǎn)生和合成的化合物、小化學(xué)分子等。激活劑試驗(yàn)包括例如將候選化合物施用于表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞，然后測(cè)定功能作用。將包含用潛在激活劑處理的GLI多肽的樣品或試驗(yàn)與不用該激活劑處理的對(duì)照樣品作比較，以檢測(cè)作用程度。指定對(duì)照樣品(不用候選化合物處理)的相對(duì)活性為100％。當(dāng)相對(duì)于對(duì)照的多肽活性值為110％，任選130％、150％，任選200％、300％、400％、500％或1000-3000％或者更高時(shí)，則實(shí)現(xiàn)多肽激活。抑制劑是(例如)使本發(fā)明多肽表達(dá)抑制或失活，或者結(jié)合、降低、關(guān)閉、失活、阻礙或降低表達(dá)、脫敏或下調(diào)本發(fā)明多肽活性的化合物。抑制劑包括干擾GLI蛋白表達(dá)的核酸如siRNA和反義RNA，以及天然產(chǎn)生和合成的化合物、小化學(xué)分子等。本文描述了抑制劑試驗(yàn)。將包含用潛在抑制劑處理的GLI多肽的樣品或試驗(yàn)與不用該抑制劑處理的對(duì)照樣品作比較，以檢測(cè)作用程度。指定對(duì)照樣品(不用候選化合物處理)的相對(duì)活性為100％。當(dāng)相對(duì)于對(duì)照的多肽活性值降低10％，任選20％，任選30％，任選40％，任選50％、60％、70％、80％或90-100％時(shí)，則實(shí)現(xiàn)多肽抑制。
術(shù)語＂藥學(xué)上可接受的＂指給予對(duì)象，優(yōu)選人對(duì)象時(shí)，在生理上能耐受或者一般不產(chǎn)生過敏或相似不良反應(yīng)的組合物。優(yōu)選地，本文所用術(shù)語＂藥學(xué)上可接受的＂指聯(lián)邦或州政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或者美國(guó)藥典或其它普遍接受的藥典列出的可用于動(dòng)物、更具體是人。
術(shù)語＂多肽＂、＂肽＂和＂蛋白質(zhì)＂在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)天然產(chǎn)生氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，以及天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物、含有修飾殘基的氨基酸聚合物和非天然產(chǎn)生的氨基酸聚合物。
本文所用術(shù)語＂前藥＂指在生理?xiàng)l件下易于發(fā)生化學(xué)變化而提供本發(fā)明化合物的化合物。此外，前藥可以在離體環(huán)境中通過化學(xué)或生化方法轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物。例如，放入含有合適的酶或化學(xué)試劑的透皮貼劑儲(chǔ)庫中時(shí)，前藥可緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸景l(fā)明化合物。
＂啟動(dòng)子＂的定義為介導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸控制序列陣列。本文所用的啟動(dòng)子包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必需核酸序列，例如在聚合酶II型啟動(dòng)子中的TATA元件。啟動(dòng)子也任選包含遠(yuǎn)端增強(qiáng)子或阻抑元件，它們與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離可長(zhǎng)達(dá)幾千個(gè)堿基對(duì)。
＂組成型＂啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境和發(fā)育條件下有活性的啟動(dòng)子。＂誘導(dǎo)型＂啟動(dòng)子是在環(huán)境或發(fā)育調(diào)控下有活性的啟動(dòng)子。術(shù)語＂操作性連接＂指核酸表達(dá)控制序列(如啟動(dòng)子、或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)陣列)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達(dá)控制序列介導(dǎo)對(duì)應(yīng)于第二序列的核酸轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語＂重組＂用于修飾(如)細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體時(shí)，表明該細(xì)胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體通過引入異源核酸或蛋白質(zhì)或者改變天然核酸或蛋白質(zhì)被修飾，或該細(xì)胞衍生自如此修飾的細(xì)胞。因此，例如，重組細(xì)胞能表達(dá)該細(xì)胞的天然(非重組)形式中未發(fā)現(xiàn)的基因，或表達(dá)在其它情況下異常表達(dá)、低表達(dá)或根本不表達(dá)的天然基因。本文所用術(shù)語＂重組核酸＂指最初通過操縱核酸(例如使用聚合酶和核酸內(nèi)切酶)在體外形成、通常未見于天然條件下的核酸。以此方式，實(shí)現(xiàn)不同序列的操作性連接。因此，線性形式的分離核酸，或通過連接通常不相連的DNA分子在體外形成的表達(dá)載體，都被認(rèn)為是本發(fā)明目的的重組。應(yīng)理解，制備重組核酸并將其引入宿主細(xì)胞或生物體后，它會(huì)以非重組形式復(fù)制，即利用宿主細(xì)胞的體內(nèi)細(xì)胞機(jī)器、而非體外操作進(jìn)行復(fù)制；然而，這類核酸一旦重組產(chǎn)生后，雖然隨后以非重組形式復(fù)制，但仍被認(rèn)為是出于本發(fā)明目的的重組。相似地，＂重組蛋白＂是用重組技術(shù)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，即通過如上所述重組核酸的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
本文所用的＂化療藥耐受性＂指對(duì)化療藥治療無反應(yīng)，即通過這種治療無法殺死或抑制腫瘤生長(zhǎng)。
本文所用術(shù)語＂鹽＂指根據(jù)本文所述化合物上的具體取代基，用相對(duì)無毒的酸或堿制備的活性化合物的鹽。當(dāng)本發(fā)明化合物含有相對(duì)酸性的官能團(tuán)時(shí)，可通過將這類化合物的中性形式與足量所需堿(純堿或該堿在合適的惰性溶劑中的溶液)相接觸而獲得堿加成鹽。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機(jī)氨基鹽或鎂鹽，或相似的鹽。本發(fā)明化合物含有相對(duì)堿性的官能團(tuán)時(shí)，可通過將這類化合物的中性形式與足量所需酸(純酸或該酸在合適的惰性溶劑中的溶液)相接觸而獲得酸加成鹽。藥學(xué)上可接受的酸加成鹽的例子包括由無機(jī)酸衍生的鹽以及由相對(duì)無毒的有機(jī)酸衍生的鹽，所述無機(jī)酸衍生的鹽包括例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽、磷酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、氫碘酸鹽或亞磷酸鹽等，所述有機(jī)酸衍生的鹽包括例如，乙酸鹽、丙酸鹽、異丁酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、辛二酸鹽、富馬酸鹽、苦杏仁酸鹽、鄰苯二甲酸鹽、苯磺酸鹽、對(duì)甲苯基磺酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽等。也包括氨基酸如精氨酸等和有機(jī)酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(參見例如，Berge，S.M.等，＂PharmaceuticalSalts＂(藥物鹽)，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。某些特定的本發(fā)明化合物同時(shí)含有堿性和酸性官能團(tuán)，因而該化合物能轉(zhuǎn)化成堿或酸加成鹽。
可通過將該鹽與堿或酸接觸并以常規(guī)方式分離母體化合物，再次產(chǎn)生該化合物的中性形式。該化合物的母體形式與各種鹽形式在某些物理特性上(例如在極性溶劑中的溶解度)不同，但出于本發(fā)明目的這些鹽相當(dāng)于該化合物的母體形式。
本文所用術(shù)語＂溶劑合物＂指與溶劑復(fù)合的本發(fā)明化合物。可與本發(fā)明化合物形成溶劑合物的溶劑包括普通有機(jī)溶劑如醇(甲醇、乙醇等)、醚、丙酮、乙酸乙酯、鹵代溶劑(二氯甲烷、氯仿等)、己烷和戊烷。其它溶劑包括水。水作為復(fù)合溶劑時(shí)，該復(fù)合物稱為＂水合物＂。
術(shù)語＂對(duì)象＂或＂患者＂指需要治療病癥(如癌癥)、失調(diào)或疾病的哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人。
術(shù)語＂TAF＂指TBP相關(guān)因子。TAF優(yōu)選為TAFII，即參與介導(dǎo)RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的真核基因的轉(zhuǎn)錄激活的TAF蛋白。TAF蛋白能與其它轉(zhuǎn)錄激活物或阻抑物相互作用(Goodrich和Tjian，Curr Opin Cell Biol 6(3)4O3-9(1994)；Albright和Tjian，Gene 242(1-2)1-13(2000))。TAF優(yōu)選來自人、小鼠、果蠅或酵母。與GLI相互作用的TAF蛋白優(yōu)選為TAFII31蛋白。Klemm等克隆了人TFIID亞基，將其稱為hTAFII32(Klemm等，1995，Proc Natl AcadSci USA，92(13)5788-92)。這種32-kD蛋白分離自HeLa細(xì)胞核提取物并經(jīng)過部分測(cè)序。鑒定的cDNA具有推定的264個(gè)殘基的氨基酸序列，并且與果蠅TAFII40有關(guān)。Klemm等已證明，TAFII32能與GTF2B和病毒轉(zhuǎn)錄反式激活物VP16相互作用(Klemm等1995，Proc Natl Acad Sci USA，92(13)5788-92)。作者證明，重組表達(dá)的TAFII32在部分重組的TFIID復(fù)合物中有功能，重組復(fù)合物通過GAL4-VP16融合蛋白介導(dǎo)激活作用。TAFII32和TAFII31是同一種蛋白質(zhì)的兩個(gè)名稱，現(xiàn)在也稱為TAF9。Lu等克隆了TAF9，他們將其稱為TAFII31。TAF9能編碼264個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。免疫沉淀和結(jié)合分析證明TAF9與p53的N末端結(jié)構(gòu)域相互作用的位點(diǎn)與MDM2的結(jié)合位點(diǎn)相同，MDM2是細(xì)胞中主要的p53活性負(fù)調(diào)節(jié)物。(Lu等，1995，Proc Natl Acad Sci USA，92(11)5154-8)。人TAFII31核苷酸和蛋白序列可參見(例如)GenBank登錄號(hào)U25112、U21858和NM_016283。
本文所用術(shù)語“治療”包括(1)預(yù)防疾病(如癌癥)，即使傾向于發(fā)生該疾病但尚未出現(xiàn)該疾病的任何癥狀的對(duì)象不發(fā)生該疾病的臨床癥狀；(2)抑制該疾病，即阻滯或減少該疾病或其臨床癥狀的發(fā)生；或(3)緩解該疾病，即使該疾病或其臨床癥狀消退。治療指病癥、失調(diào)或疾病的癥狀或病理得到改善或有益改變的任何方式。優(yōu)選地，需要這種治療的對(duì)象是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人。
＂腫瘤細(xì)胞＂指腫瘤中的癌前細(xì)胞、癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。
術(shù)語＂Wnt＂指一類哺乳動(dòng)物基因家族，其編碼與果蠅體節(jié)極性基因wingless有關(guān)的蛋白質(zhì)。在人中，Wnt基因家族一般編碼38-43 kDa富含半胱氨酸的糖蛋白，其含有疏水性信號(hào)序列和保守的天冬酰胺-連接的寡糖共有序列(Shimizu等，Cell Growth Differ 8(12)1349-58(1997))。Wnt家族包括至少19個(gè)哺乳動(dòng)物成員。示范性Wnt蛋白包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15和Wnt16。本發(fā)明優(yōu)選的Wnt蛋白是Wnt2，優(yōu)選人Wnt2蛋白。
II.小分子化合物 A.GLI3靶序列的選擇 轉(zhuǎn)錄激活域的序列同源性很小，在沒有結(jié)合靶蛋白時(shí)通常缺乏折疊結(jié)構(gòu)。相信本文所述的GLI、GLI2和GLI3能通過轉(zhuǎn)錄激活域內(nèi)的α-螺旋區(qū)與TBP相關(guān)因子TAFII31相接觸(參見圖3)。本發(fā)明一方面認(rèn)識(shí)到，雖然在許多物種中單獨(dú)的GLI、GLI2和GLI3轉(zhuǎn)錄激活域非常保守，但它們本身的差異很大。例如，人GLI1，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI1，氨基酸殘基1037-1054)和小鼠GLI1，NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(小鼠GLI1，氨基酸殘基1040-1057)的反式激活域相同。另外，人GLI2，NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(氨基酸殘基1501-1518)和小鼠GLI2，NH2-DSQLLEPPQIDFDAIMDD-COOH(小鼠GLI2，氨基酸殘基1509-1526)的反式激活域的差別只有一個(gè)氨基酸殘基位置(斜體和下劃線)。人GLI3，NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512)和小鼠GLI3，NH2-ESHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(氨基酸殘基1497-1514)的反式激活域的差別也只有一個(gè)氨基酸殘基位置(斜體和下劃線)。
然而，人GLI1、人GLI2和人GLI3之間有很大差異(星號(hào)表示人GLI1、GLI2和GLI3之間相同的氨基酸殘基) NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI1，氨基酸殘基1037-1054)，＊＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊ NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(人GLI2，氨基酸殘基1501-1518)， ＊＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊ NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512)， 以下是對(duì)人GLI1和人GLI2的TAFII31作用結(jié)構(gòu)域的比較(星號(hào)代表相同的氨基酸殘基) NH2-DSLDLDNTQLDFVAILDE-COOH(人GLI1，氨基酸殘基1037-1054) ＊＊ ＊ ＊ ＊＊ ＊＊ ＊ NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(人GLI2，氨基酸殘基1501-1518) 以下是對(duì)人GLI2和人GLI3的TAFII31作用結(jié)構(gòu)域的比較(星號(hào)代表相同的氨基酸殘基) NH2-DSQLLEAPQIDFDAIMDD-COOH(人GLI2，氨基酸殘基1501-1518) ＊＊ ＊＊ ＊＊＊＊＊＊＊ ＊＊ NH2-DSHDLEGVQIDFDAIIDD-COOH(人GLI3，氨基酸殘基1495-1512) 如上所述，已經(jīng)鑒定了GLI2和GLI3在哺乳動(dòng)物骨骼發(fā)育過程中特定和冗余的功能，然而，例如，GLI1而非GLI3能激活組織培養(yǎng)物中的HNF-3β增強(qiáng)子(Mo等，1997，Development 124113-123；Sasaki等，1997，Development1241313-1322)。TAF結(jié)合或結(jié)合親和力的差異可能導(dǎo)致GLI1，GLI2和GLI3的不同特性。
Yoon等描述，GLI1轉(zhuǎn)錄激活域類似于VP16d轉(zhuǎn)錄激活域，包括含有保守FXXΦΦ基序的α螺旋區(qū)。(Yoon等，1998，J.Biol.Chem.，273(6)3496-3501)。結(jié)合于靶蛋白TAFII31后，VP16激活域經(jīng)誘導(dǎo)由隨機(jī)卷轉(zhuǎn)變?yōu)棣?螺旋，已鑒定到三個(gè)殘基與TAFII31直接接觸D472、F479和L483(Uesugi等，1997，Science，2771310-1313)。也在包含F(xiàn)XXΦΦ(FVAIL)的人GLI1的激活域中發(fā)現(xiàn)了這三個(gè)氨基酸殘基(D1040、F1048和L1052)。
GLI3中的FXXΦΦ基序是FDAII。這一GLI3基序非常可能直接參與接觸TAF，可能是TAFII31。
也在腫瘤抑制基因p53的激活域和NF-κB p65中發(fā)現(xiàn)了FXXΦΦ基序。p53的細(xì)胞弱化子MDM2能將p53的FXXΦΦ基序與NF-κB p65和VP16區(qū)別開來，并且特異性抑制p53活性(Uesugi和Verdine，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(26)14801-14806)。因此，合理地假定含有FXXΦΦ基序的多肽I的激活域可與也含有FXXΦΦ基序但具有不同氨基酸序列的多肽II的激活域區(qū)別開來。因此，也可能通過設(shè)計(jì)和使用模擬多肽I的FXXΦΦ基序，即多肽I的FXXΦΦ基序的氨基酸序列的小分子化合物，來顯著抑制多肽I(如GLI3)的活性，但不顯著抑制多肽II的活性。
因此，本發(fā)明目的是提供能顯著抑制GLI3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但不顯著抑制GLI或GLI2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子化合物。因此，本發(fā)明一方面提供了能區(qū)別影響GLI1、GLI2和GLI3的轉(zhuǎn)錄激活潛能的小分子化合物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，小分子化合物抑制或減少了GLI3與TAF，優(yōu)選TAFII31的結(jié)合。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，提供了模擬GLI蛋白(優(yōu)選人或小鼠GLI蛋白)FXXΦΦ基序的小分子化合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物模擬了GLI3的FXXΦΦ基序FDAII(見圖3)。
在本發(fā)明其它實(shí)施方式中，該小分子化合物模擬了GLI2的FXXΦΦ基序FDAIM。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，該小分子化合物模擬了GLI1的FXXΦΦ基序FVAIL。
B.本發(fā)明小分子化合物 如上所述，本發(fā)明目的之一是提供模擬GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽的轉(zhuǎn)錄激活域的小分子化合物?，F(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域描述了含有三芳基/烷基雜環(huán)化合物的許多α-螺旋模擬物。然而，沒有充分研究基于吡唑啉的模擬α-螺旋區(qū)的化合物。因此，本發(fā)明目的之一是提供基于吡唑啉并且模擬GLI轉(zhuǎn)錄激活域的α-螺旋區(qū)，優(yōu)選GLI3轉(zhuǎn)錄激活域的α-螺旋區(qū)的小分子化合物。圖3顯示了本發(fā)明小分子化合物(FN1-5；見下)的RMS重疊，其中包括含有GLI3 FDAII基序的擬定α螺旋區(qū)。
因此，本發(fā)明化合物包含具有下式的小分子化合物
式中X1和X2各自獨(dú)立地是N或C，式中X1和X2之一是N，X1和X2之一是C，因此環(huán)N與X1或X2的C形成雙鍵。此外，R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自用0-3個(gè)R6基團(tuán)任選取代的C1-C6烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基，所述R6基團(tuán)各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、-OR7、-C(O)R7、-OC(O)R7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、-N(R7)C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標(biāo)m是0、1或2。Y是直接鍵或C1-C4烷基，Z選自C1-C4烷基、芳基和雜芳基。R4是氫、鹵素、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標(biāo)m是0、1或2。R5是氫、C1-C6烷基，或任選與Y聯(lián)合形成5-6元雜環(huán)。R7各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基。
此外，也考慮了本發(fā)明小分子化合物的鹽、水合物、溶劑合物、異構(gòu)體和前藥。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是芳基。在另一實(shí)施方式中，R1、R2和R3各自是苯基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中R4是羥基。在另一實(shí)施方式中，Z是C1-C4烷基。在又一實(shí)施方式中，Z是芳基。在又一實(shí)施方式中，Z是苯基。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了具有該式的小分子化合物，其中R1、R2和R3各自是苯基，Y是C1-C4烷基，Z是C1-C4烷基或苯基，R4是羥基。
因此，本發(fā)明小分子化合物優(yōu)選包括但不限于
其它本發(fā)明化合物包括以下小分子化合物
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，其它小分子化合物也可用于本發(fā)明。
C.小分子化合物的制備 可通過以下方法制備本發(fā)明小分子化合物使肉桂酸乙酯和苯甲醛苯腙縮合，然后通過乙酯皂化并與胺反應(yīng)形成所需的酰胺最終產(chǎn)物(參見實(shí)施例3)?；蛘?，先使肉桂酸與胺反應(yīng)制備酰胺，然后與苯甲醛苯腙縮合，以制備本發(fā)明小分子化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到，存在制備本發(fā)明小分子化合物的其它方法。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明小分子化合物包含標(biāo)簽。這對(duì)于檢測(cè)和測(cè)試體內(nèi)給藥后小分子化合物的分布特別有用。例如，3H可用作常規(guī)藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)研究的標(biāo)簽?？赏ㄟ^光譜、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)、化學(xué)或其它物理方法檢測(cè)含有標(biāo)簽的小分子化合物。
本發(fā)明小分子化合物也可在構(gòu)成該化合物的一個(gè)或多個(gè)原子上含有非天然同位素部分。例如，可用放射性同位素，如氚(3H)或碳-14(14C)標(biāo)記該化合物。本發(fā)明范圍應(yīng)包括本發(fā)明化合物的所有同位素變體(無論是否有放射性)。
D.用細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)小分子化合物 可在體外和體內(nèi)篩選本發(fā)明小分子化合物的活性。在體外試驗(yàn)中，本發(fā)明提供了基于細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)和凋亡試驗(yàn)，如本文所述(參見例如實(shí)施例1)。在體內(nèi)試驗(yàn)中，本發(fā)明提供了小鼠異種移植瘤試驗(yàn)，如本文所述(參見例如實(shí)施例33-35)。
III.藥物組合物 本發(fā)明一方面提供了含有至少一種本發(fā)明小分子化合物和任選的藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的藥物組合物或藥物?？山o予患者藥物組合物或藥物以治療(例如)諸如癌癥等病癥。
A.制劑和給藥 本發(fā)明小分子化合物可用于制備含有有效量本發(fā)明小分子化合物、聯(lián)合或混合適合腸道或胃腸道外施用的賦形劑或運(yùn)載體的藥物組合物或藥物。
可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)采用一種或多種生理上可接受的運(yùn)載體或賦形劑配制本發(fā)明所用的藥物組合物或藥物。本文描述了合適的藥物運(yùn)載體，參見E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”(雷明頓藥物科學(xué))?？膳渲票景l(fā)明小分子化合物及其生理上接受的鹽和溶劑合物，以便通過任何合適的途徑給藥，這些途徑包括吸入、外用、經(jīng)鼻、口服、胃腸道外或直腸途徑。因此，可用注射器或其它設(shè)備通過皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、腦內(nèi)、氣管內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、胸膜內(nèi)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)或腫瘤內(nèi)注射給予該藥物組合物。也考慮了透皮給藥，以及吸入或氣霧劑給藥?？赏ㄟ^口服、直腸或陰道途徑給予片劑和膠囊。
在口服給藥中，藥物組合物或藥物可通過常規(guī)手段采取(例如)藥學(xué)上可接受的賦形劑制備的片劑或膠囊形式給藥。優(yōu)選含有活性成分即本發(fā)明小分子化合物，以及以下物質(zhì)的片劑和明膠膠囊，這些物質(zhì)包括例如(a)稀釋劑或填料，如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纖維素(如乙基纖維素、微晶纖維素)、甘氨酸、果膠、聚丙烯酸酯和/或磷酸氫鈣、硫酸鈣；(b)潤(rùn)滑劑，如二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、硬脂酸金屬鹽、膠體二氧化硅、氫化植物油、玉米淀粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉和/或聚乙二醇；對(duì)片劑而言還含有(c)粘合劑，如硅酸鎂鋁、淀粉糊、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮和/或羥丙基甲基纖維素；如果需要還可加入(d)崩解劑，如淀粉(如馬鈴薯淀粉或淀粉鈉)、乙醇酸、瓊脂、藻酸或其鈉鹽、或泡騰混合物；(e)濕潤(rùn)劑，如十二烷基硫酸鈉和/或(f)吸附劑、著色劑、調(diào)味劑和甜味劑。
片劑可以是按照本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行薄膜或腸溶衣包衣的。口服給藥的液體制劑可采取以下形式，例如，溶液劑、糖漿劑或混懸劑，或者它們可以是干燥產(chǎn)品，臨用前用水或其它合適的載體重建?？赏ㄟ^常規(guī)方法用藥學(xué)上可接受的添加劑制備這類液體制劑，所述添加劑包括例如助懸劑，如山梨糖醇糖漿，纖維素衍生物或氫化食用脂肪；乳化劑，如卵磷脂或阿拉伯膠；非水性載體，如杏仁油、油脂、乙醇或分餾的植物油；和防腐劑，如對(duì)羥基苯甲酸或山梨酸的甲酯或丙酯。所述制劑也可適當(dāng)?shù)睾芯彌_劑、調(diào)味劑、著色劑和/或甜味劑。如果需要，可適當(dāng)配制口服給藥制劑，以便控制釋放該活性化合物。
就吸入給藥而言，可通過加壓包裝或噴霧器以氣溶膠噴霧的形式方便地遞送化合物，其中應(yīng)用了合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供遞送可計(jì)量數(shù)量的閥門來確定劑量單位?？膳渲坪性摶衔锏姆勰┗旌衔锖秃线m的粉末基料(如乳糖或淀粉)的用于吸入器或吹藥器的明膠膠囊和藥筒。
可配制用于胃腸外注射給藥，如推注或連續(xù)輸注的本發(fā)明小分子化合物?？梢杂锰砑臃栏瘎┑膯挝粍┬?如)安瓿或多劑量容器盛放注射制劑。可注射組合物優(yōu)選為水性等滲溶液劑或混懸劑，栓劑優(yōu)選由脂肪乳劑或混懸劑制備。該組合物可以是無菌組合物和/或含有輔助試劑，如防腐劑、穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑或乳化劑、促溶劑、調(diào)節(jié)滲透壓和/或緩沖液的鹽?；蛘?，活性成分可以是臨用前用合適的載體，如無菌無熱原水重建的粉末形式。此外，它們還可含有其它有治療價(jià)值的物質(zhì)。按照常規(guī)的混合、造?；虬路椒ㄖ苽湓摻M合物，其含有約0.1-75％，優(yōu)選約1-50％的活性成分。
適用于透皮給藥的制劑包含有效量的本發(fā)明化合物和運(yùn)載體。優(yōu)選的運(yùn)載體包括可吸收的藥學(xué)上可接受的溶劑，以幫助其穿過宿主皮膚。例如，透皮裝置是繃帶形式，其包括襯墊部件，含有化合物和任選運(yùn)載體的儲(chǔ)庫；任選的速率控制屏障，以便在一段較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)以可控和預(yù)定的速率將該化合物給予宿主皮膚；和將該裝置固定在皮膚上的機(jī)構(gòu)。也可采用基質(zhì)透皮制劑。
局部應(yīng)用，如用于皮膚和眼睛的合適制劑優(yōu)選本領(lǐng)域熟知的水性溶液劑、軟膏、乳膏或凝膠。這類制劑可含有增溶劑、穩(wěn)定劑、張度增強(qiáng)劑、緩沖劑和防腐劑。
該化合物也可配制到例如含有常規(guī)栓劑基料如可可油或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑直腸組合物，如栓劑或保留灌腸劑中。
而且，可將該化合物配制成長(zhǎng)效制劑。可通過植入(如皮下或肌肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射給予這類長(zhǎng)效制劑。因此，例如，可用合適的聚合材料或疏水性材料或離子交換樹脂配制該化合物(例如，用可接受的油配制成乳劑)，或配制成微溶性衍生物，例如，微溶鹽。
如果需要，可以在包裝或配藥裝置中提供該組合物，所述裝置可含有一個(gè)或多個(gè)含有活性成分的單位劑量形式。該包裝可以(例如)包含金屬或塑料箔，例如泡罩包裝。該包裝或配藥裝置可附有給藥說明。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，藥物組合物或藥物含有有效量的如上所述本發(fā)明化合物和另一種治療劑，如化療藥?；熕幍睦影ǖ幌抻谌峒t霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿糖胞苷、雙氯乙基亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、氯潑尼松、羥基孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧柯福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙素、紫杉醇、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊甙、三甲曲沙、替尼泊苷、順鉑和二乙基乙烯雌酚(DES)。通常參見，The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克診斷治療手冊(cè))，第15版，1987，第1206-1228頁，Berkow等編，新澤西州羅韋(Rahway，N.J.)。
與本發(fā)明小分子化合物一起使用時(shí)，這類化療藥可單獨(dú)使用(如5-FU和小分子化合物)、連續(xù)給藥(如給予5-FU和小分子化合物一段時(shí)間后，給予(如)MTX和小分子化合物)，或者與一種或多種這類化療藥(如5-FU、MTX和小分子化合物，或者5-FU、放療和小分子化合物)聯(lián)用。可通過相同或不同的給藥途徑給藥，或者在同一藥物制劑中一起給藥。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，與手術(shù)和任選給予的另一化療藥聯(lián)合給予治療有效量的本發(fā)明小分子化合物。
B.治療有效量和給藥 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，將治療有效劑量的藥物組合物或藥物給予患者，以預(yù)防、治療或控制癌癥。將足量的藥物組合物或藥物給予患者，以在患者中產(chǎn)生有效的治療效果。有效治療效果是，至少部分阻滯或減慢該疾病的癥狀或并發(fā)癥的效果。能夠達(dá)到這一目的的量被定義為＂治療有效劑量＂。
所給的活性小分子化合物的劑量取決于溫血?jiǎng)游?哺乳動(dòng)物)的種類、體重、年齡、個(gè)體狀況、待治療區(qū)域的表面積和給藥形式。劑量大小也取決于向具體對(duì)象給予具體小分子化合物時(shí)伴隨的副作用的存在、特性和程度。約50-70千克的哺乳動(dòng)物的口服給藥單位劑量可含有約5-500毫克活性成分。一般地，本發(fā)明活性小分子化合物的劑量是足以實(shí)現(xiàn)所需效果的劑量。
可由對(duì)象體內(nèi)小分子化合物累積測(cè)定值計(jì)算最優(yōu)給藥方案。通常，劑量為1納克-1,000毫克/千克體重，可每天、每周、每月或每年給予一次或多次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難確定最優(yōu)劑量、給藥方法和給藥頻率。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在數(shù)天中，每天給予含有本發(fā)明小分子化合物的藥物組合物或藥物的劑量范圍為約1毫克小分子化合物/千克對(duì)象體重(1毫克/千克)至約1克/千克。在另一實(shí)施方式中，每日劑量的范圍為約5mg/kg-500mg/kg。在又一實(shí)施方式中，每日劑量為約10mg/kg-250mg/kg。在另一實(shí)施方式中，每日劑量為約25mg/kg-150mg/kg。每日劑量可每天給藥一次，或分成亞劑量每天給藥多次，如每天給藥兩次、三次或四次。
為了實(shí)現(xiàn)所需療效，小分子化合物必須以治療有效的日劑量給予多天。因此，治療有效地給予小分子化合物以治療對(duì)象的癌癥需要定期(如每天)給藥持續(xù)一段時(shí)間，這段時(shí)間為三天至兩周或更長(zhǎng)時(shí)間。一般地，可以連續(xù)給予小分子化合物至少三天，常常是連續(xù)至少5天，更經(jīng)常是連續(xù)至少10天，有時(shí)連續(xù)給藥20、30、40或更多天。雖然每日連續(xù)給藥是實(shí)現(xiàn)治療有效劑量的優(yōu)選途徑，但即使不是每天給予該小分子化合物也可實(shí)現(xiàn)治療有益的效果，只要重復(fù)給藥的頻率足以在對(duì)象中維持治療有效濃度的小分子化合物。例如，可以每隔一天、每三天給予該小分子化合物，或者如果采用較高劑量范圍并且對(duì)象能耐受，則可每周給藥一次。給藥方案參見(例如)實(shí)施例33-35和圖15-17。
這類小分子化合物的最優(yōu)劑量、毒性和療效可取決于單個(gè)小分子化合物的相對(duì)效力，可通過細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物所用的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法測(cè)定，例如，測(cè)定LD50(對(duì)50％群體致死的劑量)和ED50(對(duì)50％群體治療有效的劑量)。毒性和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，可表示為L(zhǎng)D50/ED50之比。優(yōu)選治療指數(shù)大的化合物。雖然可采用具有毒副作用的化合物，但應(yīng)該小心設(shè)計(jì)將這類化合物靶向患病組織部位以最大程度降低對(duì)正常細(xì)胞的損傷、從而降低副作用的遞送系統(tǒng)。
獲自(例如)細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)可用于確定人用劑量范圍。這類小分子化合物的劑量?jī)?yōu)選在包含ED50的毒性很小或無毒性的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。根據(jù)所用劑型和給藥途徑，該劑量可在此范圍內(nèi)變動(dòng)。對(duì)本發(fā)明方法所用的任何小分子化合物而言，最初可由細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估計(jì)治療有效劑量。可在動(dòng)物模型中確定劑量，以使循環(huán)血漿濃度范圍包含細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)定的IC50(對(duì)癥狀實(shí)現(xiàn)半數(shù)最大抑制的受試化合物濃度)?？衫眠@類信息更準(zhǔn)確地確定人用劑量?？赏ㄟ^高效液相色譜(HPLC)確定血漿中的濃度。通常，對(duì)典型對(duì)象而言，小分子化合物的劑量當(dāng)量約為1ng/kg-100mg/kg。
成功治療后，可能需要對(duì)該對(duì)象進(jìn)行維持治療，以防止所治療疾病(如癌癥)的復(fù)發(fā)。
IV.鑒定表達(dá)GLI蛋白的細(xì)胞 A.檢測(cè)GLI蛋白 在另一實(shí)施方式中，檢測(cè)癌癥的方法包括測(cè)定來自對(duì)象(如患者)的生物樣品中GLI多肽，優(yōu)選GLI1，GLI2或GLI3多肽的水平。在優(yōu)選實(shí)施方式中，確定含有轉(zhuǎn)錄激活域的GLI3蛋白的激活片段水平。檢測(cè)到GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽水平增加或GLI3蛋白激活片段水平增加(相對(duì)于正常水平)說明該對(duì)象患有癌癥。
例如，GLI1、GLI2或GLI3表達(dá)上調(diào)表明癌癥，或者可能與各種癌癥相關(guān)聯(lián)。因此，GLI1、GLI2或GLI3多肽或者Gli1、Gli2或Gli3多核苷酸可用作診斷癌癥的生物標(biāo)記物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，測(cè)定生物樣品中GLI蛋白如GLI3的含量。一般地，例如，由正常、健康或非癌對(duì)象提供的生物樣品中GLI3含量與癌癥患者或懷疑患有癌癥的對(duì)象提供生物樣品中的GLI3含量相關(guān)聯(lián)。癌癥患者或懷疑患有癌癥的對(duì)象提供的生物樣品中檢測(cè)到的GLI3含量可能是給定癌癥特異性的。
例如，可通過任何具體檢測(cè)方法檢測(cè)GLI多肽如GLI3多肽，這些方法包括但不限于親和力捕獲、質(zhì)譜、GLI3的傳統(tǒng)免疫試驗(yàn)、PAGE、Western印跡或HPLC，如本文的進(jìn)一步描述或本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
可用于此目的的檢測(cè)范例包括光學(xué)方法、電化學(xué)方法(測(cè)定電壓和測(cè)定電流的技術(shù))、原子力顯微術(shù)和射頻方法如多級(jí)共振光譜。除共聚焦和非共聚焦顯微術(shù)外，光學(xué)方法的例子是檢測(cè)熒光、發(fā)光、化學(xué)發(fā)光、光吸收、反射、透光度和雙折射或折射率(如表面等離振子共振、橢圓光度法、共振鏡法、光柵耦合器波導(dǎo)法或干涉量度法)。
B.檢測(cè)Gli mRNA 在一個(gè)實(shí)施方式中，檢測(cè)癌癥的方法包括確定對(duì)象(如患者)生物樣品中編碼GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽的轉(zhuǎn)錄物的水平(參見例如Genbank登錄號(hào)NM 007191和SEQ ID NO1)。檢測(cè)到Gli mRNA，優(yōu)選GLI3 mRNA水平相對(duì)于正常水平升高表明該對(duì)象患有癌癥。在一個(gè)實(shí)施方式中，確定GlimRNA水平的步驟包括擴(kuò)增反應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，通過測(cè)定細(xì)胞中編碼GLI多肽的mRNA表達(dá)水平評(píng)估是否存在癌癥。Gli mRNA水平高于相應(yīng)非癌組織表明存在癌癥。評(píng)估具體基因的RNA表達(dá)水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，包括雜交和擴(kuò)增試驗(yàn)等。
1.直接雜交試驗(yàn) 用核酸雜交技術(shù)檢測(cè)和/或定量測(cè)定Gli基因轉(zhuǎn)錄物(mRNA或由其制備的cDNA)水平的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，評(píng)估Gli多核苷酸如Gli3多核苷酸存在、不存在或含量的一種方法包括Northern印跡。也可通過本領(lǐng)域已知技術(shù)分析基因表達(dá)水平，例如打點(diǎn)印跡、原位雜交、RNA酶保護(hù)、檢測(cè)DNA微芯片試驗(yàn)等。
2.擴(kuò)增試驗(yàn) 在另一實(shí)施方式中，用擴(kuò)增試驗(yàn)測(cè)定Gli基因，優(yōu)選Gli3基因的表達(dá)水平。在這類試驗(yàn)中，Gli核酸序列用作擴(kuò)增反應(yīng)(如聚合酶鏈反應(yīng)或PCR)的模板。在定量擴(kuò)增中，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與原始樣品中模板量成正比。與合適對(duì)照進(jìn)行比較能衡量樣品中的Gli mRNA水平。定量擴(kuò)增的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。定量PCR的詳細(xì)方案參見(如)Innis等(1990)PCRProtocols，A Guide to Methods and Applications(PCR方案方法和應(yīng)用指南)，紐約學(xué)術(shù)出版社公司(Academic Press，Inc.N.Y.))。已知的Gli核酸序列(參見例如，本文中的ATCC登錄號(hào))足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇引物來擴(kuò)增該基因的任何部分。半定量RT-PCR分析參見(例如)實(shí)施例1和圖2。
在一個(gè)實(shí)施方式中，采用基于TaqMan的試驗(yàn)定量測(cè)定癌癥相關(guān)性多核苷酸。基于TaqMan的試驗(yàn)采用發(fā)熒光的寡核苷酸探針，其含有5′熒光染料和3′淬滅劑。該探針與PCR產(chǎn)物雜交，但本身無法延伸，因?yàn)槠?′末端有封端劑。在后續(xù)循環(huán)中擴(kuò)增PCR產(chǎn)物時(shí)，聚合酶如AmpliTaq的5′核酸酶活性導(dǎo)致切割TaqMan探針。這種切割分離了5′熒光染料和3′淬滅劑，從而隨著擴(kuò)增的進(jìn)行提高了熒光水平(參見例如，帕金埃爾默公司(Perkin-Elmer)提供的文獻(xiàn)，如www2.perkin-elmer.com)。
其它合適擴(kuò)增方法包括但不限于連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(參見Wu和Wallace，Genomics 4560(1989)；Landegren等，Science 2411077(1988)；和Barringer等，Gene 89117(1990))、轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增(Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 861173(1989))、自身維持序列復(fù)制(Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 871874(1990))、打點(diǎn)PCR和接頭銜接子PCR等。
V.方法 本發(fā)明小分子化合物可以各種方式應(yīng)用。本發(fā)明提供了使用本發(fā)明小分子化合物進(jìn)行以下操作的方法，例如，(i)誘導(dǎo)表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞凋亡，(ii)抑制表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活，(iii)治療表達(dá)GLI多肽的病癥如癌癥，(iv)抑制具有GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)的基因表達(dá)和(v)抑制GLI多肽的活性。
任何表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞可用于實(shí)施本發(fā)明方法。表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞優(yōu)選選自結(jié)腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
本發(fā)明方法可以在體外或體內(nèi)實(shí)施。
A.用小分子化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 凋亡在多細(xì)胞生物體的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起到核心作用。＂凋亡＂指程序性細(xì)胞死亡，其特征是某些細(xì)胞特征，如膜起泡、染色質(zhì)皺縮和片段化、形成凋亡小體和陽性＂TUNEL＂(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的UTP缺口末端標(biāo)記)染色圖案。凋亡過程中的后一步驟是質(zhì)膜降解，使凋亡細(xì)胞泄漏各種染料(如碘化丙錠)。
凋亡可能由集中于最終效應(yīng)物機(jī)制的多個(gè)獨(dú)立信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)，這些機(jī)制由幾種死亡受體與其配體(屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體/配體超家族)之間的多種相互作用組成。最佳表征的死亡受體是CD95(＂Fas＂)、TNFR1(p55)、死亡受體3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。凋亡的最終效應(yīng)物機(jī)制是激活了稱為胱冬酶的一系列蛋白酶。這些胱冬酶的激活導(dǎo)致一系列有活力的細(xì)胞蛋白的裂解和細(xì)胞死亡。
本發(fā)明提供了誘導(dǎo)表達(dá)GLI蛋白的細(xì)胞凋亡的方法。在一個(gè)方面，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法包括使細(xì)胞暴露于組合物或使細(xì)胞接觸含有本發(fā)明小分子化合物的組合物的步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含小分子化合物FN1-5。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該組合物包含小分子化合物FN1-8。一般地，使細(xì)胞暴露于或接觸有效量的組合物，這種接觸能誘導(dǎo)凋亡。在優(yōu)選實(shí)施方式中，GLI蛋白是GLI2或GLI3。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，使細(xì)胞暴露于含有本發(fā)明小分子的組合物包括將該組合物引入細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方法，其包括給予本發(fā)明小分子化合物的步驟。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述小分子化合物是FN1-5。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述小分子化合物是FN1-8。
在優(yōu)選實(shí)施方式中，使細(xì)胞離體暴露于或離體接觸該組合物。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，使細(xì)胞在體內(nèi)暴露于或在體內(nèi)接觸該組合物。
B.用小分子化合物抑制細(xì)胞的不希望的生長(zhǎng)、增殖或存活 本發(fā)明的目的之一是提供治療癌癥的新型治療方案，該方案包括施用防止通過GLI信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明小分子化合物。本發(fā)明一方面提供了抑制細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為的方法。這種方法包括確定該細(xì)胞是否表達(dá)Gli基因或者GLI多肽的步驟。此方法也包括使細(xì)胞接觸有效量的本發(fā)明小分子的步驟，其中所述接觸步驟導(dǎo)致抑制了細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為。
抑制其不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞優(yōu)選選自結(jié)腸癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞、間皮瘤細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、腎細(xì)胞癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、肝細(xì)胞癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，提供了一種抑制表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3的細(xì)胞增殖的方法。＂增殖＂指細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞或病理囊腫的繁殖或增多。該方法包括使細(xì)胞接觸有效量的小分子化合物的步驟，所述有效量能抑制細(xì)胞增殖。優(yōu)選地，單用或聯(lián)用小分子化合物FN1-5或FN1-8能抑制細(xì)胞，優(yōu)選癌細(xì)胞的增殖。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，在體外實(shí)施此方法。如本文進(jìn)一步所述，也可在體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法。
許多腫瘤都會(huì)轉(zhuǎn)移。因此，在本發(fā)明的另一方面，采用本發(fā)明小分子化合物預(yù)防轉(zhuǎn)移灶的形成。此方法包括給予腫瘤細(xì)胞本發(fā)明小分子化合物的步驟，這種給藥能防止轉(zhuǎn)移。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物是FN1-5。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物是FN1-8。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，表達(dá)GLI蛋白并接觸本發(fā)明小分子化合物的細(xì)胞是選自下組的癌細(xì)胞結(jié)腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞。優(yōu)選癌細(xì)胞是肺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞或黑色素瘤細(xì)胞。
C.用小分子化合物治療癌癥 可以在體外和體內(nèi)實(shí)施本發(fā)明方法。因此，在本發(fā)明的另一方面，提供了治療患有癌癥的對(duì)象的方法。此方法包括給予該對(duì)象治療有效量的小分子化合物的步驟，其中所述癌癥的特征是表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽，其中給藥步驟導(dǎo)致治療了該對(duì)象。
如本文所示，大部分癌癥表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽(圖2；數(shù)據(jù)未顯示)。因此，可用本發(fā)明小分子化合物治療大部分對(duì)象癌癥。癌癥優(yōu)選選自結(jié)腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤。
因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的結(jié)腸癌的對(duì)象。
在本發(fā)明另一優(yōu)選實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的乳腺癌的對(duì)象。
在本發(fā)明的又一優(yōu)選實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的鼻咽癌的對(duì)象。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的肺癌的對(duì)象。肺癌包括但不限于支氣管癌[鱗狀細(xì)胞癌、未分化的小細(xì)胞癌、未分化的大細(xì)胞癌、腺癌]、肺胞癌[細(xì)支氣管癌]、支氣管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、軟骨瘤性錯(cuò)構(gòu)瘤、間皮瘤、SCLC和NSCLC。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的肉瘤的對(duì)象。肉瘤包括但不限于諸如血管肉瘤、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、橫紋肌瘤、纖維瘤、脂肪瘤和畸胎瘤等癌癥。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的胃腸道癌癥的對(duì)象。胃腸道癌癥包括但不限于食道癌[鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤]、胃癌[上皮癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤]、胰腺癌[膽管腺癌、胰島素瘤、高血糖素瘤、胃泌素瘤、類癌瘤、舒血管腸肽瘤]、小腸癌[腺癌、淋巴瘤、類癌瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神經(jīng)纖維瘤、纖維瘤]和大腸癌[腺癌、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、錯(cuò)構(gòu)瘤、平滑肌瘤]。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的泌尿生殖道癌癥的對(duì)象。泌尿生殖道癌癥包括但不限于腎癌[腺癌、腎母細(xì)胞瘤(腎胚細(xì)胞瘤)、淋巴瘤、白血病、腎細(xì)胞癌]、膀胱癌和尿道癌[鱗狀細(xì)胞癌、移行細(xì)胞癌、腺癌]、前列腺癌[腺癌、肉瘤]和睪丸癌[精原細(xì)胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、絨毛膜癌、肉瘤、萊迪希細(xì)胞瘤、纖維瘤、纖維腺瘤、類腺瘤、脂肪瘤]。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的肝癌的對(duì)象。肝癌包括但不限于肝細(xì)胞癌、膽管癌、肝母細(xì)胞瘤、血管肉瘤、肝細(xì)胞腺瘤和血管瘤。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的皮膚癌的對(duì)象。皮膚癌包括但不限于惡性黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、卡波濟(jì)氏肉瘤、痣、發(fā)育異常的痣、脂肪瘤、血管瘤、皮膚纖維瘤、瘢痕疙瘩和牛皮癬。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的婦科癌癥的對(duì)象。婦科癌癥包括但不限于子宮癌[子宮內(nèi)膜癌]、宮頸癌[宮頸上皮癌、侵襲前宮頸發(fā)育異常]、卵巢癌[卵巢上皮癌(漿液性囊腫腺癌、粘質(zhì)囊腫腺癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞腺癌、未分類上皮癌]、粒層泡膜細(xì)胞瘤、塞爾托利-雷迪(Sertoli-Leydig)細(xì)胞瘤、無性細(xì)胞瘤、惡性畸胎瘤和其它胚細(xì)胞瘤]、陰門癌[鱗狀細(xì)胞癌、上皮內(nèi)癌、腺癌、纖維肉瘤、黑色素瘤]、陰道癌[透明細(xì)胞上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、葡萄狀肉瘤(胚胎橫紋肌肉瘤)和輸卵管癌[上皮癌]。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的骨癌的對(duì)象。骨癌包括但不限于成骨肉瘤[骨肉瘤]、纖維肉瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、軟骨肉瘤、尤因肉瘤、惡性淋巴瘤[網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤]、多發(fā)性骨髓瘤、惡性巨細(xì)胞瘤、脊索瘤、骨軟骨瘤[骨軟骨外生骨疣]、良性軟骨瘤、軟骨母細(xì)胞瘤、軟骨粘液樣纖維瘤、骨樣骨瘤和巨細(xì)胞瘤。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的神經(jīng)系統(tǒng)癌癥的對(duì)象。神經(jīng)系統(tǒng)癌癥包括但不限于顱骨癌癥[骨瘤、血管瘤、肉芽腫、黃色瘤、骨佩吉特病]、腦脊膜癌癥[腦脊膜瘤、腦脊膜肉瘤、膠質(zhì)瘤病]、腦癌[星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、生殖細(xì)胞瘤(松果體瘤)、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、先天性腫瘤]和脊髓癌[神經(jīng)纖維瘤、腦脊膜瘤、膠質(zhì)瘤、肉瘤]。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的血液癌癥的對(duì)象。血液癌癥包括但不限于血液癌[骨髓性白血病(急性和慢性)、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、骨髓增生性疾病、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓發(fā)育異常綜合征]、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤(惡性淋巴瘤)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用小分子化合物治療患有表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的腎上腺癌的對(duì)象。腎上腺癌包括但不限于神經(jīng)母細(xì)胞瘤。
本發(fā)明提供了治療或預(yù)防表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的癌癥的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，此方法包括給予患者藥物組合物的步驟。這類藥物組合物包含(例如)本發(fā)明小分子化合物。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物是FN1-5。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物是FN1-8。本發(fā)明藥物組合物單獨(dú)給藥或與一種或多種其它治療性化合物或治療聯(lián)合給藥。這類治療性化合物或治療的例子包括但不限于紫杉醇、環(huán)磷酰胺、他莫昔芬、氟尿嘧啶和多柔比星。此外，其它化療藥如本文所述。
癌癥治療方法可任選包括以下一個(gè)或多個(gè)步驟由個(gè)體獲得組織或液體的生物樣品；(例如)使該生物樣品接觸GLI1、GLI2或GLI3的抗體，以篩選表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的生物樣品；或通過檢測(cè)Gli1、Gli2或Gli3mRNA篩選表達(dá)Gli1、Gli2或Gli3多核苷酸的生物樣品。
許多癌癥最初是用本文所述的化療藥治療的。然而，癌癥常常對(duì)這些化療藥產(chǎn)生耐藥性，隨后這些藥物則不再有效。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，癌癥是多藥耐藥性癌癥或頑固性癌癥。因此，在本發(fā)明的另一方面，用本發(fā)明小分子化合物克服腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的耐藥性。這種方法包括給予對(duì)至少一種化療藥產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞本發(fā)明小分子化合物的步驟，其中所述給藥導(dǎo)致隨后腫瘤細(xì)胞死亡。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物是FN1-5。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，該小分子化合物是FN1-8。
D.抑制含有GLI PNA結(jié)合位點(diǎn)的基因表達(dá) 因?yàn)镚LI多肽，如GLI1、GLI2或GLI3多肽用作轉(zhuǎn)錄激活物，所以本發(fā)明方法對(duì)GLI轉(zhuǎn)錄活性的抑制作用也應(yīng)抑制或下調(diào)下游基因，即其表達(dá)受GLI，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)。GLI一般通過結(jié)合其關(guān)聯(lián)DNA結(jié)合位點(diǎn)來調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，所述關(guān)聯(lián)DNA結(jié)合位點(diǎn)操作性連接于下游基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列。例如，描述了GLI3的DNA結(jié)合位點(diǎn)(Vortkamp等，1995，DNA Cell.Biol 14629-34；Hallikas等，2006，Cell 124(1)47-59)。
本發(fā)明一方面鑒定了GLI1、GLI2或GLI3下游基因。按照本發(fā)明，通過對(duì)懷疑受GLI1、GLI2或GLI3調(diào)控的基因的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域進(jìn)行DNA測(cè)序來鑒定GLI1、GLI2或GLI3下游基因。在表達(dá)或過度表達(dá)GLI1、GLI2或GLI3的癌癥中，預(yù)計(jì)GLI1、GLI2或GLI3下游基因也表達(dá)或過度表達(dá)。也可通過使基因組片段化并使用所得片段作為本領(lǐng)域已知的凝膠遷移試驗(yàn)中的探針來鑒定具有GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)的GLI下游基因。這類試驗(yàn)中鑒定的任何片段可進(jìn)行擴(kuò)增、鑒定和/或用作核酸探針，用于篩選和鑒定來源基因，如本領(lǐng)域已知篩選基因組DNA文庫。(本發(fā)明提供了)鑒定哺乳動(dòng)物增強(qiáng)子元件中的GLI結(jié)合位點(diǎn)的另一種方法，因此，GLI靶基因是增強(qiáng)子元件定位器(EEL；Hallikas等，2006，Cell 12447-59)。例如，Hallikas等鑒定了含有兩個(gè)或多個(gè)在小鼠與人和大鼠與人的比對(duì)中保守的GLI結(jié)合位點(diǎn)的幾個(gè)增強(qiáng)子元件。這些增強(qiáng)子元件與GLI靶基因相連，例如胞吐囊復(fù)合物元件Sec5(SEC5L1)、NULL(NM_018271；NM_144962)、早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白3(EGR-3)(鋅指蛋白pilot)(EGR3)、PR-結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白10(PRDM10)、T-框轉(zhuǎn)錄因子TBX2(T-框蛋白2；TBX2)、SOX-13蛋白(1型糖尿病自身抗原ICA12)(島細(xì)胞抗原12)(SOX13)、補(bǔ)丁蛋白(patched protein)同源物1(PTC1)(PTC)(PTCH)以及與DAN和Cerberus有關(guān)的蛋白質(zhì)(NM_022469)。因此，可采用本發(fā)明小分子化合物抑制這些靶基因的表達(dá)。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，抑制了操作性連接于啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列的含有GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3DNA結(jié)合位點(diǎn)的GLI下游基因。采用抑制GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明方法可抑制下游基因。具體說，本發(fā)明提供了抑制GLI3下游基因表達(dá)的方法，所述方法包括給予表達(dá)GLI3下游基因的細(xì)胞本發(fā)明小分子化合物的步驟，其中所述給藥導(dǎo)致抑制了GLI3下游基因的表達(dá)。任選地，這一方法包括驗(yàn)證GLI3下游基因被抑制的步驟?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知方法，如RT-PCR或Western印跡分析達(dá)到這一目的。
除Hallikas等(Hallikas等，2006，Cell 12447-59)鑒定的GLI靶基因以外，本發(fā)明也將Wnt2基因鑒定為GLI靶基因，即含有GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)(參見本文實(shí)施例)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，下游基因是Wnt基因，優(yōu)選Wnt-2基因，更優(yōu)選人Wnt2基因。在此實(shí)施方式中，抑制GLI3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致抑制或下調(diào)Wnt-2以及Wnt-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。抑制Wnt-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能影響(例如)Dvl和β-聯(lián)蛋白的表達(dá)，如美國(guó)專利申請(qǐng)10/678,639和11/131,425所述。
GLI3位于GLI1和GLI2的上游，似乎也能通過結(jié)合Gli1和Gli2基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子區(qū)域內(nèi)GLI3DNA結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)Gli1和Gli2基因的轉(zhuǎn)錄。因此，GLI3、GLI1和GLI2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不是平行的，而更可能是在同一信號(hào)傳導(dǎo)途徑內(nèi)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，下游基因是Gli1基因，優(yōu)選人Gli1基因。在此實(shí)施方式中，抑制GLI3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致抑制或下調(diào)Gli1表達(dá)以及GLI1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，下游基因是Gli2基因，優(yōu)選人Gli2基因。在此實(shí)施方式中，抑制GLI3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致抑制或下調(diào)Gli2表達(dá)以及GLI2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
E.抑制GLI多肽的活性 GLI多肽具有本文所述的幾種生物學(xué)活性。本發(fā)明一方面提供了抑制GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法。此方法包括使GLI多肽接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽活性的步驟。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，此方法包括使表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽活性的步驟。
例如，GLI多肽是轉(zhuǎn)錄激活物蛋白，一般通過結(jié)合于或作用于TBP相關(guān)因子(TAF)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活潛能。因此，在本發(fā)明一方面，抑制GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法包括使GLI多肽接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與TAF結(jié)合或GLI多肽與TAF相互作用的步驟。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，此方法包括使表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與TAF結(jié)合或GLI多肽與TAF相互作用的步驟。
GLI多肽是轉(zhuǎn)錄激活物蛋白，一般通過結(jié)合于或作用于輔助激活物如CBP發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活潛能。因此，在本發(fā)明一方面，抑制GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法包括使GLI多肽接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與輔助激活物結(jié)合或GLI多肽與輔助激活物相互作用的步驟。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，此方法包括使表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與輔助激活物結(jié)合或GLI多肽與輔助激活物相互作用的步驟。
本文所述的GLI多肽是轉(zhuǎn)錄激活物蛋白，一般通過結(jié)合于或作用于GLIDNA結(jié)合位點(diǎn)發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活潛能。因此，在本發(fā)明的另一方面，抑制GLI多肽，優(yōu)選GLI1、GLI2或GLI3多肽的活性的方法包括使GLI多肽接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的方法。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，此方法包括使表達(dá)GLI多肽的細(xì)胞接觸本發(fā)明小分子化合物，從而抑制GLI多肽與GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的步驟。
可以在體外或體內(nèi)抑制GLI多肽活性。
F.小分子化合物在制備藥物組合物或藥物中的應(yīng)用 本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明小分子化合物在制備治療和/或預(yù)防性治療病癥，如表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽的癌癥的藥物組合物或藥物中的應(yīng)用。
在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了小分子化合物在制備誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的藥物組合物或藥物中的應(yīng)用，其中所述癌細(xì)胞表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽。
在另一相關(guān)方面，本發(fā)明提供了小分子化合物在制備與治療表達(dá)GLI多肽，優(yōu)選GLI3多肽的癌癥的另一種化療抗癌劑聯(lián)用的藥物組合物或藥物中的應(yīng)用。本文描述了本發(fā)明提供的藥物組合物和藥物。
G.篩選GLI蛋白活性調(diào)節(jié)劑 用本領(lǐng)域已知和本文所述的方法鑒定抑制劑和激活劑，這些抑制劑和激活劑在本文中稱為GLI蛋白活性的調(diào)節(jié)劑。可利用許多不同篩選方案來鑒定能夠調(diào)節(jié)GLI多肽活性的除本文所述化合物之外的其他化合物。術(shù)語＂調(diào)節(jié)＂包括與合適對(duì)照相比提高或降低測(cè)定的GLI多肽活性。
這些篩選方法可用于細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，尤其是人細(xì)胞，甚至更優(yōu)選人癌細(xì)胞?？偟膩砜?，篩選方法包括篩選各種化合物以鑒定能夠調(diào)節(jié)GLI多肽活性的化合物。該方法通常包括以下步驟(a)使候選化合物與GLI多肽，含有GLI多肽的樣品或表達(dá)GLI多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞相接觸；和(b)測(cè)定在候選化合物存在下的GLI多肽活性。與合適對(duì)照(如不存在候選化合物時(shí)的GLI多肽，不存在候選化合物時(shí)含有GLI多肽的樣品或不存在候選化合物時(shí)表達(dá)GLI多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中的GLI多肽活性相比測(cè)定的活性提高或降低表明，該候選化合物能調(diào)節(jié)GLI多肽的活性。一旦用本發(fā)明篩選方法之一鑒定到候選化合物或候選藥物，一般將其稱為化合物或藥物，而非候選化合物或候選藥物。
可選擇能將GLI多肽活性提高或降低至所需程度的化合物進(jìn)一步研究，并評(píng)估細(xì)胞可用性、藥代動(dòng)力學(xué)分析、細(xì)胞毒性、生物相容性等。
在一個(gè)優(yōu)選方面，該篩選方法包括篩選候選化合物以鑒定能抑制或降低GLI多肽活性的化合物。在另一方面，該篩選方法包括篩選候選化合物以鑒定能提高GLI多肽活性的化合物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種鑒定能調(diào)節(jié)GLI蛋白活性的化合物的方法。本發(fā)明優(yōu)選方法是鑒定能夠調(diào)節(jié)GLI蛋白和TAFII31蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用的候選化合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，此方法包括以下步驟使候選化合物于含有GLI蛋白和TAFII31蛋白的樣品相接觸；確定GLI蛋白與TAFII31蛋白的結(jié)合。與不存在候選化合物時(shí)GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合相比，在候選化合物存在時(shí)GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合水平降低表明該候選化合物能夠抑制GLI蛋白與TAFII31蛋白之間的相互作用。與不存在候選化合物時(shí)GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合相比，在候選化合物存在時(shí)GLI蛋白與TAFII31蛋白的結(jié)合水平升高表明該候選化合物能夠提高GLI蛋白與TAFII31蛋白之間的相互作用。
在一個(gè)實(shí)施方式中，GLI蛋白活性是GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性，該方法用于鑒定能調(diào)節(jié)GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性的化合物。該方法包括以下步驟使樣品與候選化合物相接觸，其中該樣品包含具有一個(gè)或多個(gè)操作性連接于報(bào)道基因的GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)報(bào)道構(gòu)建物；以及如果有，則測(cè)定所述候選化合物對(duì)GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性水平的影響。
可采用本領(lǐng)域已知的許多報(bào)道基因。合適的報(bào)道基因包括但不限于熒光素酶、CAT(氯霉素-乙?；D(zhuǎn)移酶)、GFP(綠色熒光蛋白)和β-Gal(β-半乳糖苷酶)。
采用(如)本文所述的結(jié)合試驗(yàn)，如免疫沉淀試驗(yàn)和轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)(參見例如，實(shí)施例35)，可評(píng)估不存在或存在候選化合物時(shí)對(duì)GLI蛋白與TAFII31結(jié)合的調(diào)節(jié)。通常，可將本文所述試驗(yàn)用于篩選方法，用待測(cè)候選化合物替換這些試驗(yàn)中分析的小分子化合物。
如本文所述，抑制GLI蛋白活性可導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種鑒定能誘導(dǎo)凋亡的候選化合物的方法。在此方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法包括以下步驟(a)使GLI多肽與候選化合物相接觸，和(b)確定候選化合物是否結(jié)合于GLI多肽，抑制GLI多肽的活性；其中結(jié)合GLI多肽或抑制GLI多肽活性的候選化合物是適用于誘導(dǎo)凋亡的候選化合物。
任選地，如本文所述鑒定候選化合物的方法包括選擇結(jié)合GLI多肽或調(diào)節(jié)GLI多肽活性的化合物的步驟。
可采用本文所述的凋亡試驗(yàn)和本領(lǐng)域已知試驗(yàn)評(píng)估本文所述方法鑒定的用于誘導(dǎo)凋亡的候選化合物。
采用公知試驗(yàn)，如臺(tái)盼藍(lán)染料排斥試驗(yàn)、MTT([3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-溴化四唑])試驗(yàn)等評(píng)估候選化合物在正常細(xì)胞(如非癌細(xì)胞)中可能存在的細(xì)胞毒活性。沒有細(xì)胞毒活性的化合物被認(rèn)為是候選化合物。
a)篩選化合物 除上述篩選方法和本文所述試驗(yàn)外，在本發(fā)明篩選方法的另一實(shí)施方式中，使用了利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(＂媒人雙雜交系統(tǒng)(MATCHMAKERTwo-Hybrid system)＂、＂哺乳動(dòng)物媒人雙雜交測(cè)定試劑盒＂、＂媒人單雜交系統(tǒng)＂(克隆泰克公司(Clontech))；＂HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)＂(司查塔基公司(Stratagene))；也參見Dalton和Treisman，1992，Cell 68597-612；Fields和Sternglanz，1994，Trends Genet 10286-92)。
例如，在雙雜交系統(tǒng)中，使GLI多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。使結(jié)合GLI多肽的TAFII31多肽與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合，也在酵母細(xì)胞中表達(dá)。或者，可使結(jié)合GLI多肽的TAFII31多肽與SRF結(jié)合區(qū)或GAL4結(jié)合區(qū)融合，使GLI多肽與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄激活區(qū)融合。受試化合物無法抑制GLI多肽和TAFII31多肽的結(jié)合時(shí)，二者的結(jié)合能激活報(bào)道基因，因而可檢測(cè)到陽性克隆。除HIS3基因外，可使用(如)Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、熒光素酶基因等作為報(bào)道基因?；蛘撸茉嚮衔锬芤种艷LI多肽和TAFII31多肽的結(jié)合時(shí)，也可檢測(cè)到這兩種多肽不結(jié)合(例如，不表達(dá)lazZ基因產(chǎn)生白色酵母集落，而表達(dá)lacZ基因則產(chǎn)生藍(lán)色集落)。
本發(fā)明篩選方法中可采用任何受試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、微生物發(fā)酵產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化蛋白或粗蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物和天然化合物。也可利用本領(lǐng)域已知的組合庫方法中的許多方法來獲取本發(fā)明受試化合物，包括(1)生物文庫，(2)空間可尋址的平行固相或溶液相文庫，(3)需要去卷積的合成文庫方法，(4)＂一珠一化合物＂文庫法和(5)采用親和色譜選擇的合成文庫法。采用親和色譜選擇的生物文庫法僅限于肽文庫，而另外四種方法可用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文庫(Lam，1997，Anticancer Drug Des.12145)。在本領(lǐng)域中可見合成分子文庫的方法的例子(DeWitt等，1993，ProcNatl Acad Sci USA 906909；Erb等，1994，Pro.Natl Acad Sci USA 9111422；Zuckermann等，1994，J Med Chem 372678；Cho等，1993，Science 2611303；Carell等，1994，Angew Chem Int.Ed Engl.332059；Carell等，1994，AngewChem Irtt Ed.Engl.332061；Gallop等，1994，J Med Chem 371233)?；衔镂膸炜纱嬖谟谌芤褐?參見Houghten，1992，Bio/Techniques 13412)或珠上(Lam，1991，Nature 35482)、芯片上(Fodor，1993，Nature 364555)、細(xì)菌上(美國(guó)專利號(hào)5,223,409)、芽孢上(美國(guó)專利號(hào)5,571,698；5,403,484和5,223,409)、質(zhì)粒上(Cull等，1992，Proc Natl Acad Sci USA 891865)或噬菌體上(Scott和Smith，1990，Science 249386；Devlin，1990，Science249404；Cwirla等，1990，Proc Natl Acad Sci USA 876378；Felici，1991，J Mol Biol 222 301；美國(guó)專利申請(qǐng)20020103360)。按照本發(fā)明篩選方法接觸細(xì)胞或蛋白質(zhì)的受試化合物可以是一種化合物或一組化合物。將一組化合物用于本發(fā)明篩選方法時(shí)，該化合物可依次或同時(shí)接觸。
用本發(fā)明篩選方法分離的化合物是能調(diào)節(jié)GLI多肽活性，以誘導(dǎo)凋亡和治療或預(yù)防病癥如癌癥(如本文所述)的化合物。通過本發(fā)明篩選方法獲得的化合物也包括通過本發(fā)明篩選方法獲得的化合物結(jié)構(gòu)的一部分通過添加、缺失和/或取代發(fā)生轉(zhuǎn)變的化合物。
天然產(chǎn)生的GLI多肽和重組GLI多肽均可用于實(shí)施本發(fā)明方法。
本文提供了檢測(cè)和測(cè)定用本文所述方法鑒定的化合物、藥物或拮抗劑的方法，所述方法包括確定給定的化合物、藥物或小分子化合物能否用于實(shí)施本發(fā)明方法的各種接受的測(cè)試。本發(fā)明方法可任選包括檢測(cè)核酸如mRNA(如通過核酸雜交或PCR)、多肽(如Western印跡、免疫試驗(yàn)或質(zhì)譜)、酶活性(如報(bào)道基因產(chǎn)物如熒光素酶的酶活性)，或者誘導(dǎo)或抑制凋亡的步驟。這些檢測(cè)方法是本領(lǐng)域熟知的。
VI.試劑盒 為應(yīng)用于上述診斷、研究和治療應(yīng)用，本發(fā)明也提供了試劑盒。在診斷和研究應(yīng)用中，這類試劑盒可包括以下任何或所有物質(zhì)測(cè)定試劑、緩沖液、本發(fā)明小分子化合物、GLI多肽、Gli核酸、抗-GLI抗體、雜交探針和/或引物、Gli表達(dá)構(gòu)建物等。治療產(chǎn)物可包括無菌鹽水或另一種藥學(xué)上可接受的乳劑和懸浮基料。
此外，該試劑盒可包括說明材料，其中含有實(shí)施本發(fā)明方法的指南(即方案)。該說明可以各種形式存在于主題試劑盒中，其中的一種或多種形式可存在于試劑盒中。
雖然說明書一般包含手寫或打印的材料，但它們不限于此。本發(fā)明考慮了能夠儲(chǔ)存說明并將它們傳遞給終端用戶的任何介質(zhì)。這類介質(zhì)包括但不限于電子儲(chǔ)存介質(zhì)(如磁盤、磁帶、錄音帶、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(如CD ROM)等。這類介質(zhì)可包括提供這類說明材料的因特網(wǎng)地址。
可按照本發(fā)明制備各種試劑盒和組件，這取決于該試劑盒的目標(biāo)用戶和用戶的具體需求。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，該試劑盒是藥盒，包含含有以下組分的藥物組合物(i)小分子化合物，優(yōu)選FN1-5或FN1-8和(ii)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。藥盒任選裝有說明該藥物組合物可以或應(yīng)該用于治療表達(dá)GLI多肽或Gli核酸，優(yōu)選GLI3多肽或Gli3核酸的癌癥的說明書。
本發(fā)明試劑盒還可包含進(jìn)行質(zhì)譜的試劑。這類試劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括例如探針或芯片。
本發(fā)明其它試劑盒實(shí)施方式包括允許本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)行本文所述的任何方法變化形式的任選功能組件。
雖然為了闡述和理解的需要通過說明和舉例的方式詳細(xì)描述了上述發(fā)明，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通過本發(fā)明內(nèi)容能明白，可以在不背離本發(fā)明構(gòu)思和范圍的情況下進(jìn)行某些變化、改變、修飾和等效取代。結(jié)果是，在僅由所附權(quán)利要求書確定的本發(fā)明范圍內(nèi)對(duì)本文所述的實(shí)施方式進(jìn)行各種修飾、改變等。本領(lǐng)域技術(shù)人員不難了解可變化、改變或修飾以產(chǎn)生基本相似結(jié)果的各種非關(guān)鍵參數(shù)。
雖然在本文中描述的本發(fā)明各個(gè)部件含有多種實(shí)施方式，但應(yīng)理解，除非另有說明，本發(fā)明給定部件的各個(gè)實(shí)施方式能夠與本發(fā)明其它部件的各個(gè)實(shí)施方式一起使用，各種應(yīng)用應(yīng)構(gòu)成有區(qū)別的本發(fā)明實(shí)施方式。
將本說明書引用的所有發(fā)表物、專利和專利申請(qǐng)全文納入本文作參考，就好像將各篇發(fā)表物、專利或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)貏e和單獨(dú)納入本文作參考那樣。
從上述公開可理解，本發(fā)明有各種應(yīng)用。還通過以下實(shí)施例說明了本發(fā)明，它們僅為說明，而不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明的定義和范圍。
VII.實(shí)施例 實(shí)施例1總方法 A.細(xì)胞系 大部分人細(xì)胞系獲自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C.；弗吉尼亞州馬納薩斯(Manassas，Virginia))。這些細(xì)胞系包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞A549、H1703、H460、H358、H322、H838、H1299、H1650、H1975和A427；間皮瘤細(xì)胞21IH、H513、H2052、H28和Met5A；結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、HCT116、HT29、Lovo和CaCO2；乳腺癌細(xì)胞MCF7、HuL100、SKBR-3和BT474；肉瘤MG-63、MNNG、A-204和SJSA-I；黑色素瘤細(xì)胞LOX、FEM、FEMX、A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5、SK-Mel-28和Malme-3M；人正常皮膚成纖維細(xì)胞、Malme-3；腎細(xì)胞癌細(xì)胞786-O、Caki、769-P、A704和OMRC3；前列腺癌細(xì)胞系LnCAP；膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87；肝細(xì)胞癌細(xì)胞HepG2和SK-Hep-1；正常肌肉細(xì)胞系；正常腎細(xì)胞系HRE152和HK-2。其它人間皮瘤癌細(xì)胞系H290和MS-I獲自馬里蘭州弗雷德里克的國(guó)立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health，NIH，F(xiàn)rederick，Maryland)，LRK1A和REN由賓西法尼亞州費(fèi)城的賓州大學(xué)(University ofPennsylvania，Philadelphia，Pennsylvania)的Steven Albelda博士實(shí)驗(yàn)室友情提供。正常間皮細(xì)胞系LP-9獲自麻薩諸塞州波士頓的哈佛大學(xué)的細(xì)胞培養(yǎng)核心機(jī)構(gòu)(Cell Culture Core Facility，Harvard University，Boston，Massachusetts))。人胰腺癌細(xì)胞系BxPC3、Panc4.21、CFPAC-1和L3.6sl由加州大學(xué)舊金山分校(University of California，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)Matthias Hebrok博士的實(shí)驗(yàn)室友情提供。人鼻咽癌細(xì)胞系HNE-I和HONE-I由俄亥俄州哥倫布的俄亥俄州立大學(xué)(Ohio State University，Columbus，Ohio)的Ronald Glaser博士友情提供。人胃癌細(xì)胞系NUGC3、MNK28和AGS由加州大學(xué)舊金山分校(University of California，SanFrancisco)(加利福尼亞州舊金山)的Xin Chen博士友情提供；食道癌細(xì)胞系SEG-I、TE-7、BIC-I和OE21由加州大學(xué)舊金山分校(University of California，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)的Michael Korn博士友情提供；卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)Z23247由加州大學(xué)舊金山分校(University of California，SanFrancisco)(加利福尼亞州舊金山)的Karen Smith-McCune博士友情提供。
大多數(shù)細(xì)胞系用補(bǔ)充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI1640常規(guī)培養(yǎng)，但LP-9用含有15％ CS加10ng/ml EGF加0.4μg/ml HC的M199培養(yǎng)；卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)Z23247用補(bǔ)充有10％胎牛血清(UCSF細(xì)胞培養(yǎng)機(jī)構(gòu)(UCSF Cell Culture Facility))的M15培養(yǎng)基培養(yǎng)；正常腎細(xì)胞系HRE152用補(bǔ)充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的αMEM培養(yǎng)；獲自馬里蘭州沃科司威爾的克隆泰科公司(Clonetics，Walkersville，Maryland)的正常人小氣道上皮細(xì)胞(SAEC)和支氣管上皮細(xì)胞(NHBE)(原代培養(yǎng)物)用克隆泰克SAGMTM Bullet試劑盒培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在含有5％CO2的37℃潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
B.組織樣品 在手術(shù)時(shí)獲取初次進(jìn)行治愈性腫瘤切除術(shù)患者的新鮮的癌組織和相鄰正常組織(IRB批準(zhǔn)號(hào)H8714-15319-040)，立即用液氮快速冷凍。這些組織樣品在液氮中以-170℃保存待用。原代組織培養(yǎng)物的制備方法如下經(jīng)由進(jìn)行切除術(shù)的患者同意，由其獲得新鮮癌癥組織，切成小塊(直徑1-2mm)，然后按照生產(chǎn)商方案用膠原酶A(印第安納州印第安納波利斯的羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(Roche Applied Science，Indianapolis，Indiana))室溫消化2小時(shí)。離心消化獲得的單個(gè)細(xì)胞，用補(bǔ)充有10％胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的RPMI1640洗滌細(xì)胞團(tuán)兩次。然后，將細(xì)胞重懸于相同培養(yǎng)基中，用6孔板在含有5％CO2的37℃潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到它們可用于進(jìn)一步治療。
C.細(xì)胞存活率試驗(yàn)(基于細(xì)胞的細(xì)胞毒試驗(yàn)) 本發(fā)明小分子化合物一般溶解于DMSO，濃度為30mM。然后在細(xì)胞培養(yǎng)條件下測(cè)定范圍是0、10、30、50至100μM的不同濃度的小分子化合物。為了測(cè)定治療后的細(xì)胞存活率，用該小分子化合物在6孔板中培養(yǎng)細(xì)胞約3天。去除細(xì)胞培養(yǎng)基后，加入1ml 0.5％結(jié)晶紫溶液(用20％乙醇和20％甲醇制備)，染色細(xì)胞5分鐘。然后，用自來水沖洗掉結(jié)晶紫溶液。根據(jù)結(jié)晶紫染色平板的密度估計(jì)細(xì)胞存活率。
測(cè)定增殖或細(xì)胞毒試驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)目的另一種試驗(yàn)是比色法MTS試驗(yàn)?？少彽肕TS測(cè)定試劑(普洛麥格公司(Promega Corp.)，威斯康星州麥迪遜)。該試劑含有四唑鎓化合物[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓，內(nèi)鹽；MTS]和電子偶聯(lián)試劑(吩嗪乙基硫酸鹽；PES)。PES的化學(xué)穩(wěn)定性提高，使其能夠與MTS混合形成穩(wěn)定溶液。MTS四唑鎓化合物(歐文試劑(Owen.s reagent))被細(xì)胞生物還原成有色的甲

產(chǎn)物，該產(chǎn)物在組織培養(yǎng)基中可溶?？赏ㄟ^代謝活性細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的完成這種轉(zhuǎn)化。經(jīng)490nm吸光度測(cè)定的甲

產(chǎn)量與培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)成正比。因?yàn)镸TS甲

產(chǎn)物在組織培養(yǎng)基中可溶，所以此試驗(yàn)需要的步驟比使用四唑鎓化合物如MTT要少。MTT還原產(chǎn)生的甲

產(chǎn)物是結(jié)晶沉淀，需要額外步驟來溶解這些晶體，然后記錄570nm的吸光度讀數(shù)。
B.凋亡分析 按照生產(chǎn)商方案用膜聯(lián)蛋白V FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(加州卡馬里奧的生物資源公司(Biosource，Camarillo，CA))分析凋亡。用不同濃度的不同小分子化合物處理約3天后，通過胰酶消化收獲細(xì)胞，染色，立即用流式細(xì)胞術(shù)分析(FACScan；貝克頓迪金森公司(Decton Dickinson)，新澤西州富蘭克林湖(Franklin Lake，New Jersey))。暴露磷脂酰絲氨酸但細(xì)胞膜完整的早期凋亡細(xì)胞將結(jié)合膜聯(lián)蛋白V-FITC，但不結(jié)合碘化丙錠(PI)。壞死或晚期凋亡階段的細(xì)胞會(huì)同時(shí)標(biāo)記上膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI。＂％凋亡細(xì)胞＂或＂％凋亡＂指早期晚期凋亡細(xì)胞之和。
E.半定量RT-PCR 用凱杰RNeasy小抽試劑盒(加州巴倫西亞(Valencia，California))分離細(xì)胞系或組織樣品的總RNA。用英杰生物技術(shù)公司(加利福尼亞州卡爾斯巴德)的一步RT-PCR試劑盒在GeneAmp PCR系統(tǒng)2700(加州福斯特城的應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，California))中進(jìn)行RT-PCR。RT-PCR引物獲自加州阿拉米達(dá)的歐普龍技術(shù)公司(Operon TechnologiesInc.，Alameda，California)。擴(kuò)增Hedgehog和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的引物序列見下表(表1；F，正向引物；R，反向引物)。標(biāo)出各引物對(duì)產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物的預(yù)計(jì)大小。GAPDH用作內(nèi)標(biāo)。
表1.半定量RT-PCR中的引物序列 F.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染cDNA構(gòu)建物 在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)用不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基將細(xì)胞(2 x 105)接種于六孔板。按照生產(chǎn)商方案，通過LipofectamineTM 2000(英杰生物技術(shù)公司；加利福尼亞州卡爾斯巴德)介導(dǎo)，用2.0μg pCDNA3載體中的cDNA或2.0μg pCDNA3空載體作對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)染。然后在含有5％CO2的37℃潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，直到它們可用于分析。Gli2 cDNA由奧地利薩爾茲堡的薩爾茲堡大學(xué)(University of Salzburg，Salzburg，Austria)的Fritz Aberger博士友情提供。Gli1和Gli3 cDNA由馬里蘭州巴爾的摩的約翰霍普金斯大學(xué)(Johns Hopkins University，Baltimore，Maryland)的悉尼金梅綜合癌癥中心(Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center)的BertVogelstein博士和Kenneth W.Kinzler博士友情提供。TAFII31 cDNA由麻薩諸塞州劍橋的哈佛大學(xué)的Gregory L.Verdine博士友情提供。
G.啟動(dòng)子活性分析 轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞(1 x 105)接種于裝有不含抗生素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基的12孔板。細(xì)胞達(dá)到80-90％匯合度時(shí)，用0.5μg pGL3Basic載體中的各啟動(dòng)子構(gòu)建物和0.025μg含有花蟲熒光素酶的pRL-TK載體(普洛麥格公司(Promega)；威斯康星州麥迪遜)共同轉(zhuǎn)染它們，含有花蟲熒光素酶的pRL-TK載體用作轉(zhuǎn)化效率的內(nèi)標(biāo)。用Lipofectamine 2000TM(英杰生物技術(shù)公司)介導(dǎo)轉(zhuǎn)染約6小時(shí)。然后用含有濃度為30μM的各種小分子化合物的新鮮培養(yǎng)基更換原來的培養(yǎng)基，再培養(yǎng)得到的細(xì)胞18-24小時(shí)，并進(jìn)行熒光素酶試驗(yàn)。簡(jiǎn)要說，用裂解緩沖液裂解細(xì)胞，用雙熒光素酶試驗(yàn)系統(tǒng)(普洛麥格公司)和照度計(jì)測(cè)定各孔細(xì)胞的螢火蟲和花蟲熒光素酶活性。將熒光素酶的測(cè)定活性標(biāo)準(zhǔn)化至pRL-TK載體活性，并相對(duì)于pGL3-Basic空載體的基本活性給出其活性(設(shè)定為統(tǒng)一)。所示數(shù)據(jù)代表平均值(±S.D.)。一式三份地進(jìn)行所有測(cè)定，在至少三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中重復(fù)進(jìn)行。加州大學(xué)舊金山分校(University of California，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)Jablons博士的實(shí)驗(yàn)室克隆和鑒定了人Wnt-2啟動(dòng)子-熒光素酶構(gòu)建物、人SOCS3啟動(dòng)子-熒光素酶構(gòu)建物和人Gremlin啟動(dòng)子-熒光素酶構(gòu)建物(He等，BiochemBiophy Res Comm，2003；和未公開數(shù)據(jù))。6GLI-TKO-熒光素酶構(gòu)建物(含有6個(gè)共有GLI DNA結(jié)合序列重復(fù))由加州大學(xué)舊金山分校(University ofCalifornia，San Francisco)(加利福尼亞州舊金山)Matthias Hebrok博士的實(shí)驗(yàn)室友情提供。
H.TOPFLASH試驗(yàn) 將細(xì)胞接種于12孔板。如上所述將TOPFLASH或FOPFLASH報(bào)道質(zhì)粒(Upstate；弗吉尼亞州夏洛茨維爾(Charlottesville，Virginia))瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。通過pTOPFLASHpFOPFLASH熒光素酶活性之比測(cè)定Tcf-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄，各活性值標(biāo)準(zhǔn)化至pRL-TK報(bào)道物(共同轉(zhuǎn)染的內(nèi)標(biāo))的熒光素酶活性。一式三份地進(jìn)行所有測(cè)定，至少重復(fù)三次。
I.Western印跡 用標(biāo)準(zhǔn)方案(伊利諾斯州羅克福德的皮爾斯生物技術(shù)公司(PierceBiotechnology，Rockford，Illinois)獲得用或不用小分子化合物處理(30μM處理2-3天)的細(xì)胞培養(yǎng)物的全部蛋白質(zhì)。用伯樂(Bio-Rad)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將全部細(xì)胞裂解物蛋白(5-20μg)煮沸5分鐘，用10-20％SDS-PAGE分離。用半干轉(zhuǎn)移槽(加州貝尼西亞的伯樂公司(Bio-Rad；Benicia，California))將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜(麻薩諸塞州貝德福德的密理伯公司(Millipore Corp.，Bedford，Massachusetts))上。用Tris-緩沖鹽水配制的5％脫脂奶粉和0.1％吐溫20在4℃下封閉膜過夜，然后用第一抗體在室溫下培育1小時(shí)。用Tris-緩沖鹽水配制的5％脫脂奶粉和0.1％吐溫20洗滌膜三次，每次10分鐘。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔或驢抗小鼠抗體用作第二抗體。用化學(xué)發(fā)光魯米諾試劑(圣克魯斯生物技術(shù)公司(SantaCruz Bio-technology))觀察蛋白質(zhì)?？笵vl-3抗體和抗-存活素抗體購自加州圣克魯斯(Santa Cruz，California)的圣克魯斯生物技術(shù)公司?？闺锥?抗體來自麻薩諸塞州劍橋的癌基因公司(Oncogene，Cambridge，Massachusetts)。抗-β-肌動(dòng)蛋白抗體購自西格瑪-奧德里奇公司(Sigma-Aldrich Corp.)(密蘇里州圣路易斯(St.Louis，Missouri))?？?β-聯(lián)蛋白抗體購自肯塔基州列克星敦的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室公司(TransductionLaboratories，Lexington，Kentucky)?？?細(xì)胞色素c抗體來自BD生物科學(xué)公司(BD Biosciences)(加州圣地亞哥)。為了檢測(cè)β-聯(lián)蛋白的改變，如我們實(shí)驗(yàn)室以前發(fā)表的文獻(xiàn)所述制備胞漿提取物并進(jìn)行檢測(cè)。
J.體內(nèi)抗腫瘤發(fā)生研究 在攜帶人癌細(xì)胞的小鼠異種移植瘤模型體內(nèi)檢測(cè)小分子化合物FN1-8。簡(jiǎn)要說，在無熱原條件下培育雌性無胸腺裸小鼠品系NCRNU-M(5-10周齡，體重20-25克；塔康(Taconic)，德國(guó)城(Germantown)，紐約)。使用三種人癌細(xì)胞系NSCLC H460、黑色素瘤LOX(均顯示Gli3激活)和結(jié)腸癌HT29(沒有激活Gli3，用作陰性對(duì)照)。各組中使用10只小鼠，在背部區(qū)域皮下注射體積100μl的3 x 106個(gè)癌細(xì)胞。接種后，使人癌細(xì)胞在小鼠中生長(zhǎng)7天，變成可見的腫瘤塊。然后給動(dòng)物注射小分子化合物FN1-8，劑量為50毫克/千克體重(1毫克/小鼠/天)。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照。在小鼠腹部進(jìn)行腹膜內(nèi)注射時(shí)，將化合物和對(duì)照體積調(diào)整為40μl。注射化合物(6次注射)后1小時(shí)內(nèi)處死一只小鼠，收集血液。然后用質(zhì)譜分析血樣中的化合物水平，以驗(yàn)證吸收到小鼠血流中的化合物。每天大約在相同時(shí)間進(jìn)行注射，共注射14天。完成化合物處理后使腫瘤再生長(zhǎng)1-2周。每三天測(cè)定一次腫瘤大小，用寬(x)和長(zhǎng)(y)計(jì)算腫瘤體積(x2y/2，其中x<y)。數(shù)據(jù)表示為平均值(±S.D.)。
K.TUNEL染色分析腫瘤異種移植物上的凋亡 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死后從不同治療組的小鼠上切下腫瘤。切下的腫瘤立即進(jìn)行低溫粉碎，然后測(cè)定各樣品的腫瘤質(zhì)量。按照生產(chǎn)商方案用ApopTag過氧化物酶原位寡核苷酸連接凋亡檢測(cè)試劑盒(加州特美克拉的開米康國(guó)際公司(Chemicon International，Temecula，California))對(duì)腫瘤樣品進(jìn)行TUNEL染色。
L.用于評(píng)估毒性的組織學(xué)檢查 體內(nèi)研究完成后，切下小鼠的不同器官。這些器官包括肝、肺、心、腎、腸、卵巢、腦、脾、皮膚和肌肉。用4％甲醛緩沖液固定樣品，石蠟包埋，切片，并用蘇木精和伊紅(HE)染色進(jìn)行組織學(xué)分析。由小鼠病理學(xué)家檢查與DMSO對(duì)照相比所有器官的HE染色玻片的毒性證據(jù)。
M.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所示數(shù)據(jù)代表平均值(±S.D.)。用Excel的不配對(duì)T檢驗(yàn)比較不同處理和細(xì)胞系。
實(shí)施例2模擬Gli3轉(zhuǎn)錄激活域的肽FDAII 為了用小分子模擬GLI3轉(zhuǎn)錄激活域的FDAII基序，構(gòu)建FDAII的3D結(jié)構(gòu)模型。如Yoon等(1998，J Biol Chem 2733496-3501)所述，GLI1多肽的FVAIL基序產(chǎn)生α-螺旋結(jié)構(gòu)。也應(yīng)該對(duì)GLI3多肽的FDAII基序的α螺旋結(jié)構(gòu)建模。因此，產(chǎn)生了GLI3多肽的FDAII基序的α螺旋結(jié)構(gòu)，通過合理化學(xué)設(shè)計(jì)來設(shè)計(jì)模擬此基序結(jié)構(gòu)的小分子化合物。設(shè)計(jì)了含有吡唑啉結(jié)構(gòu)的小分子化合物。圖3顯示小分子化合物FN1-5(本文所述)和GLI3多肽的FDAII基序(模擬為α-螺旋的)之間的RMS重疊圖。
實(shí)施例3制備小分子化合物 a)1，3，5-三苯基-4，5-二氫吡唑-4-羧酸乙酯(FN1-1)的制備
將肉桂酸乙酯(7，2.55g)、苯甲醛苯腙(2，4.21g)，三水合氯胺-T(6.45g)和甲醇(45mL)的混合物加熱回流22小時(shí)。用50％乙酸乙酯的正己烷溶液(400mL)稀釋反應(yīng)混合物，過濾并蒸發(fā)。用柱色譜純化殘留物(硅膠200g，洗脫液0-10％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發(fā)得到無色結(jié)晶狀FN1-1(8，1.25g)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ 7.66-7.64(m，1H)，7.46-7.22(m，13H)，6.88(t，J＝7.2Hz，1H)，4.81(d，J＝4.0 Hz，1H)，4.70(d，J＝4.0Hz，1H)，4.07(四重峰，J＝7.2Hz，2H)，0.97(t，J＝7.2Hz，3H)。MS371.9(M+H)，325.5，297.5。
b)1，3，5-三苯基-4，5-二氫吡唑-4-羧酸(FN1-2)的制備 FN1-1(53mg)、甲醇(0.5mL)、1，4-二噁烷(0.5mL)和10％(w/v)氫氧化鈉水溶液(0.1mL)的混合物在室溫下保溫1小時(shí)。用水(30mL)稀釋反應(yīng)混合物，用30％乙酸乙酯的正己烷溶液洗滌。用2N鹽酸酸化水相，用乙酸乙酯萃取。用水洗滌萃取物兩次(各5mL)，然后用鹽水(5mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，蒸發(fā)得到FN1-2(38mg)。MS297.9(M-CO2H)。
c)正丁基-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-3)的制備
以類似于FN1-5的方式，用正丁胺代替4-(羥基苯基)乙胺制備FN1-3。MS420.9(M+Na)，398.9(M+H)，325.5，297.5。
d)N-(5-羥基戊基)-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-5)的制備
將FN1-1(22mg)、5-氨基戊醇(100微升)和N-N-二甲基甲酰胺(200微升)的混合物于95℃加熱20小時(shí)。用乙酸乙酯(10mL)稀釋反應(yīng)混合物，用水洗滌兩次(各5mL)，然后用鹽水(5mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。用柱色譜純化殘留物(硅膠10mL，洗脫液0-70％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發(fā)得到淺黃色無定形FN1-5(12mg)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ7.69-7.67(m，1H)，7.34-7.14(m，13H)，6.94(t，J＝7.6Hz，1H)，6.37(寬t，1H)，4.82(d，J＝4.8Hz，1H)，4.48(d，J＝4.8Hz，1H)，3.53(t，J＝6.4Hz，2H)，3.40-3.33(m，1H)，3.22-3.14(m，1H)，1.56-1.41(m，6H)。MS450.6(M+Na)，428.6(M+H)，325.5，297.5。UV吸收峰348nm(0.05％TFA-MeOH-水8:2)。
e)N-(3-羥丙基)-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-7)的制備
以類似于FN1-5的方式，用3-氨基丙醇代替4-(羥基苯基)乙胺制備FN1-7。MS422.9(M+Na)，400.9(M+H)，325.5，297.5。
f)N-(2-(4-羥基苯基)乙基)-1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN1-8)的制備
將FN1-1(11mg)、4-(羥基苯基)乙胺(132mg)和N-N-二甲基甲酰胺(100微升)的混合物于95℃加熱20小時(shí)。用乙酸乙酯(10mL)稀釋反應(yīng)混合物，用水洗滌兩次(各5mL)，然后用鹽水(5mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。用柱色譜純化殘留物(硅膠10mL，洗脫液0-50％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發(fā)得到淺黃色無定形FN1-8(9.5mg)。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ 7.66-7.63(m，1H)，7.34-7.16(m，14H)，7.07(d，J＝8.4Hz，1H)，6.94(t，J＝6.8Hz，1H)，6.84(d，J＝8.4Hz，1H)，6.52(d，J＝8.4Hz，1H)，6.35(寬t，J＝5.6Hz，1H)，4.66(s，1H)，4.65(d，J＝4.8Hz，1H)，4.41(d，J＝4.8Hz，1H)，3.56-3.42(m，2H)，3.40-3.33(m，1H)，2.76-2.57(m，2H)。MS484.5(M+Na)，462.5(M+H)，325.5，297.5。UV吸收峰351nm(0.05％TFA-MeOH-水8:2)。
通過液相色譜-質(zhì)譜分析小分子化合物FN1-8的制劑，發(fā)現(xiàn)它的純度為90-95％(數(shù)據(jù)未顯示)。
g)5-(1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羰基)氨基戊酸(FN1-9U)和5-(1，3，4-三苯基-4，5-二氫-吡唑-5-羰基)氨基戊酸(FN1-9S)的制備
將乙酰氯(5mL)加入甲醇(150mL)中，以制備氯化氫的甲醇溶液，然后加入5-氨基戊酸(1g)。將該混合物在室溫下保溫過夜，蒸發(fā)以分離5-氨基戊酸甲酯鹽酸鹽。5-氨基戊酸甲酯鹽酸鹽(251mg)、肉桂酸(74mg)、HBTU(168mg)、二異丙基乙胺(0.87mL)和二甲基甲酰胺(2mL)在室溫下保溫1小時(shí)。用乙酸乙酯(20mL)稀釋反應(yīng)混合物，用水洗滌兩次(各10mL)，然后用鹽水洗滌(10mL)，干燥(Na2SO4)，蒸發(fā)以分離(4-甲氧基羰基)丁基肉桂酰胺(1，100mg)。將(4-甲氧基羰基)丁基肉桂酰胺(1，100mg)、苯甲醛苯腙(2，113mg)、三水合氯胺-T(160mg)和甲醇(2mL)的混合物加熱回流22小時(shí)。用50％乙酸乙酯的正己烷(40mL)溶液稀釋該反應(yīng)混合物，過濾并蒸發(fā)。用柱色譜純化殘留物(硅膠20g，洗脫液0-10％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，以分離5-(1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羰基)氨基戊酸甲酯(3，13mg)和5-(1，3，4-三苯基-4，5-二氫-吡唑-5-羰基)氨基戊酸甲酯(4，103mg)。通過與酰胺羰基相鄰的CH的1H-和13-C NMR化學(xué)改變鑒定各異構(gòu)體的位向化學(xué)。通過FN1-2制備中所述的標(biāo)準(zhǔn)酯水解條件由3獲得5-(1，3，5-三苯基-4，5-二氫-吡唑-4-羰基)氨基戊酸(5，F(xiàn)N1-9U)。MS464.9(M+Na)，442.9(M+H)，325.8，297.9。通過類似于FN1-2制備的方式由4獲得5-(1，3，4-三苯基-4，5-二氫-吡唑-5-羰基)氨基戊酸(6，F(xiàn)N1-9S)。MS464.9(M+Na)，442.9(M+H)，325.8，297.9。
5和6位向化學(xué)的指定與其ESI-MS片段相當(dāng)一致即，5產(chǎn)生的去羰基峰(m/z＝297)比6大，因?yàn)槠洇?酮亞氨基結(jié)構(gòu)有利于去羰基化。


FN1-9U(右上圖)和FN1-9S(左上圖)的ESI-MS。由于去羰基化片段的形成(下圖)，F(xiàn)N1-9U在m/z＝297時(shí)的峰大于FN1-9S。
h)1，3-二苯基-5-異丁基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酸乙酯(FN2-1)的制備
簡(jiǎn)單地用正己烷沖洗60％氫化鈉在礦物油中的分散體(0.24g)以去除油，并將該分散體懸浮于無水二甲基甲酰胺(5mL)中。在冰水浴中冷卻該懸浮液，加入磷代乙酸三乙酯(1.0mL)。攪拌該混合物0.5小時(shí)后，在冰浴溫度下加入3-甲基正丁醛(0.65mL)。室溫?cái)嚢柙摶旌衔镞^夜，用水(10mL)處理，用50％乙酸乙酯的正己烷溶液(30mL)萃取，用水洗滌兩次(各20mL)，然后用鹽水(20mL)洗滌，干燥(Na2SO4)并蒸發(fā)。用柱色譜純化殘留物(硅膠40mL，洗脫液0-5％乙酸乙酯在己烷中的梯度溶液)，蒸發(fā)得到無色油狀5-甲基-己-2-烯酸乙酯。通過類似于FN1-1的方式，用5-甲基-己-2-烯酸乙酯代替實(shí)施例2中的肉桂酸乙酯制備FN2-1。1HNMR(CDCl3，400MHz)δ 7.35-7.29(m，3H)，7.25(dt，J＝2.0Hz，6.8Hz，2H)，7.13(dd，J＝1.6Hz， 6.4Hz，2H)，7.06(d，J＝8.0Hz，2H)，6.84(t，J＝7.6Hz，1H)，4.52(d，J＝5.6Hz，1H)，4.26(d，J＝5.6Hz，1H)，4.21(四重峰，J＝7.2Hz，2H)，2.14(dd，J＝9.2Hz，14.8Hz，1H)，2.05(dd，J＝5.6Hz，15.2Hz，1H)，1.95(雙七重峰，J＝2.8Hz，6.0Hz，1H)，1.21(t，J＝7.2Hz，3H)，0.94(d，J＝6.4Hz，6H)。MS351.9(M+H)，277.9，194.7。
i)N-(5-羥基戊基)-1，3-二苯基-5-異丁基-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN2-5)的制備
通過類似于FN1-5的方式用FN2-1代替FN1-1制備FN2-5。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ 7.31-7.25(m，5H)，7.09-7.03(m，4H)，6.92(t，J＝7.2Hz，1H)，6.63(寬t，J＝5.6Hz，1H)，4.30(d，J＝6.0Hz，1H)，4.20(d，J＝6.0Hz，1H)，3.59(t，J＝6.0Hz，2H)，3.31(dd，J＝4.4Hz，6.8Hz，1H)，3.28(dd，J＝4.4Hz，6.8Hz，1H)，2.12(dd，J＝8.8Hz，14.8Hz，1H)，2.05(dd，J＝6.0Hz，15.6Hz，1H)，1.93(雙七重峰，J＝2.4Hz，6.8Hz，1H)，1.53(五重峰，J＝6.4Hz，2H)，1.50(五重峰，J＝6.4Hz，2H)，1.32(五重峰，J＝6.4Hz，2H)，0.92(d，J＝6.8Hz，3H)，0.90(d，J＝6.8Hz，3H)。MS431.0(M+Na)，409.0(M+H)，305.9，277.9。
j)N-(5-羥基戊基)-1-苯基-3，5-雙(異丁基)-4，5-二氫-吡唑-4-羧酰胺(FN3-5)的制備
通過類似于實(shí)施例2的方式用5-甲基-2-己酸乙酯代替實(shí)施例2中的肉桂酸乙酯并用3-甲基正丁醛苯腙代替實(shí)施例2中的苯甲醛苯腙制備1-苯基-3，5-雙(異丁基)-4，5-二氫吡唑-4-羧酸乙酯。通過類似于實(shí)施例4的方式用1-苯基-3，5-雙(異丁基)-4，5-二氫吡唑-4-羧酸乙酯代替實(shí)施例4中的FN1-1，制備FN3-5。MS411.0(M+Na)，389.1(M+H)，285.9，257.9。
實(shí)施例4大多數(shù)癌細(xì)胞系表達(dá)Gli3 通過半定量RT-PCR分析幾種癌細(xì)胞系和原代組織樣品，以研究Gli3的表達(dá)。圖2顯示了檢測(cè)Gli3表達(dá)的RT-PCR的示范性分析。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)表達(dá)可檢測(cè)水平的Gli3mRNA的細(xì)胞系包括正常肝臟(圖2，中圖，泳道1)；NSCLCH1703、H460和A549(圖2，中圖，泳道2、3、4)；乳腺癌HuL100、BT474和MCF-7(圖2，中圖，泳道5、6、7)；間皮瘤Met5A、H290、REN、H513、H28和211H(圖2，中圖，泳道8-13)；結(jié)腸癌SW480(圖2，中圖，泳道15)；一對(duì)原代NSCLC組織樣品(圖2，中圖，泳道16和17分別是正常組織和癌組織)。LARK1A不顯示可檢測(cè)的Gli3 mRNA表達(dá)水平(圖2，中圖，泳道14)。
在另一組相似的RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，分析Gli3表達(dá)，并在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、Lovo和CaCO2(圖2，下圖，泳道1、4、5)；正常結(jié)腸(圖2，下圖，泳道6)；正常腎細(xì)胞系HRE-152和HK-2(圖2，下圖，泳道7和8)；腎細(xì)胞癌786-O、Caki、769-P、A704和OMRC3(圖2，下圖，泳道9-13)；正常肺(圖2，下圖，泳道14)；間皮瘤REN、H290、211H、H513、H2052、H28和MS-1(圖2，下圖，泳道15-21)；NSCLCA549、H460、H838、H1703、H1299、H1650和H1975(圖2，下圖，泳道22-28)中進(jìn)行檢測(cè)。因此，大部分癌細(xì)胞系表達(dá)Gli3。在細(xì)胞系HCT116(圖2，下圖，泳道2)、HT29(圖2，下圖，泳道3)和A427(圖2，下圖，泳道29)中發(fā)現(xiàn)無Gli3表達(dá)或其表達(dá)水平低。
實(shí)施例5篩選GLI3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子抑制劑 用本文所述的細(xì)胞試驗(yàn)初步篩選本發(fā)明小分子化合物。圖4顯示了這種分析的結(jié)果。用濃度為100μM的小分子化合物FN1-1、FN1-2、FN1-3、FN1-5和FN2-1培育兩種NSCLC細(xì)胞系H1299和A549以及兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和HCT116。DMSO用作對(duì)照。在所有測(cè)試的癌細(xì)胞系中觀察到FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(活細(xì)胞用0.5％結(jié)晶紫染色)。此試驗(yàn)將抑制GLI轉(zhuǎn)錄激活域(TAF-結(jié)合域，TAFbd)的小分子化合物FN1-5鑒定為活性命中化合物。
圖6顯示了用三種NSCLC細(xì)胞系(H1299、A549和H460)和一種結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480)測(cè)試小分子化合物FN1-7、FN1-8和FN3-5的細(xì)胞毒試驗(yàn)結(jié)果。如上所述將癌細(xì)胞系接種于6孔板，用50和100μM各化合物(母液溶解于DMSO，30mM)培育3天。在所有受試癌細(xì)胞系中觀察到FN1-8的顯著細(xì)胞殺傷作用，F(xiàn)N1-8是小分子化合物FN1-5的修飾形式。也采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡分析，結(jié)果一致(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，采用本文所述的合理的設(shè)計(jì)-篩選方法，鑒定到抑制GLI3轉(zhuǎn)錄激活域(TAF-結(jié)合域)的另一種小分子化合物FN1-8。
實(shí)施例6小分子FN1-5和FN1-8能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系CaCO2和SW480凋亡 用本發(fā)明小分子化合物處理結(jié)腸癌細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在圖5所示的代表性實(shí)施例中，觀察到用100μM FN1-5處理3天后結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480顯著凋亡(58.6％)(表2)。此結(jié)果與染色結(jié)果相一致。
使用本發(fā)明小分子化合物FN1-5和FN1-8進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)，觀察到對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo和CaCO2的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。FN1-8似乎比FN1-5的細(xì)胞殺傷作用更有效。小分子化合物FN1-5和FN1-8均能誘導(dǎo)CaCO2凋亡(表2和3)。
也用10、30、50和100μM化合物FN1-9U和FN1-9S培育兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和HCT116。沒有觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用或凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例7小分子FN1-5而非FN1-8能在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷和凋亡 將小分子化合物FN1-5用于細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)，在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29中觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，即使在較高劑量(50μM；數(shù)據(jù)未顯示)下，用小分子化合物FN1-8處理也沒有觀察到細(xì)胞殺傷作用。
用小分子化合物FN1-5和FN1-8處理細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29凋亡。雖然FN1-5能誘導(dǎo)HT29細(xì)胞凋亡(50μM觀察到35％凋亡細(xì)胞；表2)，用FN1-8處理后沒有觀察到凋亡(表3)。這些結(jié)果與上述染色結(jié)果相一致。因此，小分子化合物FN1-8在HT29細(xì)胞中既不影響存活也不誘導(dǎo)凋亡的結(jié)果證明，在其它細(xì)胞系中檢測(cè)到的FN1-8介導(dǎo)的作用不是由于FN1-8的一般毒性。
在這個(gè)方面值得注意的是，雖然HT29細(xì)胞表達(dá)Gli1和Gli2(數(shù)據(jù)未顯示；Zhu等，2004，Cancer Lett.207(20205-214)，但沒有觀察到HT29細(xì)胞中的Gli3表達(dá)(圖2，下圖，泳道3)。
實(shí)施例8小分子化合物FN1-5和FN1-8誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡 用本發(fā)明小分子化合物處理幾種NSCLC細(xì)胞系后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。例如，用100μM FN1-5處理3天后，觀察到NSCLC細(xì)胞系H1299顯著凋亡(55.9％凋亡)，A549顯著凋亡(30.0％凋亡)(其它數(shù)據(jù)見表2)。這些結(jié)果與染色結(jié)果一致。
用30μM和50μM FN1-8處理3天后，也觀察到NSCLC細(xì)胞系H460(50μM時(shí)75.2％凋亡；表3)和H838(50μM時(shí)82.3％凋亡；表3)顯著凋亡。這些結(jié)果與染色結(jié)果一致。FN1-5也能誘導(dǎo)H460和H838細(xì)胞凋亡(表2)。一致的是，觀察到FN1-8在相同劑量下誘導(dǎo)凋亡的效力高于FN1-5(表2和3)。
使用本發(fā)明小分子化合物FN1-5和FN1-8進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)時(shí)，觀察到對(duì)NSCLC細(xì)胞系H460、H838、H1975、H1650和H1703顯著的細(xì)胞殺傷作用。比較相同濃度時(shí)，F(xiàn)N1-8對(duì)這些細(xì)胞系的強(qiáng)度似乎高于FN1-5(數(shù)據(jù)未顯示)。
用NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549、H358和H322進(jìn)行小分子化合物FN1-8的劑量滴定實(shí)驗(yàn)。將A549、H358和H322細(xì)胞接種于6孔板，用DMSO(對(duì)照)或7.5μM、10μM、15μM、20μM和30μM FN1-8分別培育3天。加入15μM或更高濃度的FN1-8時(shí)觀察到對(duì)這些細(xì)胞系的顯著和劑量依賴性細(xì)胞殺傷作用。FN1-8在A549和H368細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用的濃度稍低于H322細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。用20μM FN1-8培育3天后，約28％A549細(xì)胞和58％H358細(xì)胞發(fā)生凋亡(表3)。
給予小分子化合物FN1-8后，分析了NSCLC細(xì)胞A549、H358和H322中的細(xì)胞存活時(shí)程。用10μM和20μM FN1-8培育A549細(xì)胞，分別用15μM和30μM FN1-8培育H358和H322細(xì)胞。然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)上活細(xì)胞和死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。3天后，F(xiàn)N1-8對(duì)A549細(xì)胞顯示出劑量依賴性細(xì)胞殺傷作用。在H358細(xì)胞中，F(xiàn)N1-8的細(xì)胞殺傷作用在1天后已經(jīng)很明顯，在H322細(xì)胞則為2天后(數(shù)據(jù)未顯示)。
小分子化合物FN1-8也能顯著抑制NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞增殖，所述NSCLC細(xì)胞包括A549、H358和H322細(xì)胞。通過以下方法證明這一點(diǎn)用7.5μM或15μM FN1-8培育細(xì)胞，然后按照生產(chǎn)商方案在加入化合物后的不同時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行MTS試驗(yàn)。已發(fā)現(xiàn)，1天后，F(xiàn)N1-8能以劑量依賴性方式抑制這些細(xì)胞的細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示)。
根據(jù)用小分子化合物FN1-5和FN1-8獲得的篩選結(jié)果，用本文所述的細(xì)胞毒和凋亡試驗(yàn)檢測(cè)其它小分子化合物對(duì)H1299和A549細(xì)胞的影響。使用10、30、50和100μM化合物FN1-9U和FN1-9S時(shí)，沒有觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用或凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例9小分子化合物FN1-5和FN1-8在原代培養(yǎng)的NSCLC中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用和凋亡 也用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)本發(fā)明小分子化合物在原代培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞(由組織樣品新鮮制備)中誘導(dǎo)的凋亡。例如，用10、30和50μM FN1-8或30和50μM FN1-5處理3天后，觀察到原代培養(yǎng)的NSCLC細(xì)胞顯著凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。例如，在50μM FN1-8時(shí)觀察到約60％凋亡細(xì)胞。這些結(jié)果與采用原代培養(yǎng)NSCLC細(xì)胞以及化合物FN1-5和FN1-8進(jìn)行的細(xì)胞毒試驗(yàn)獲得的結(jié)果相一致(數(shù)據(jù)未顯示)。再一次發(fā)現(xiàn)相同濃度時(shí)FN1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例10小分子化合物FN1-5和FN1-8能誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡 用細(xì)胞毒試驗(yàn)和黑色素瘤細(xì)胞系LOX檢測(cè)小分子化合物FN1-5、FN1-8、FN1-7、FN1-9U和FN1-9S的作用。將LOX細(xì)胞接種于6孔板，用100μM各化合物(將母液溶解于DMSO，30mM)培育3天，如本文所述。一致的是，觀察到FN1-5和FN1-8的顯著細(xì)胞殺傷作用(圖7)。用小分子化合物FN1-7和FN1-9U培育LOX細(xì)胞時(shí)，也觀察到一些殺傷作用?；罴?xì)胞用0.5％結(jié)晶紫染色。
也用人黑色素瘤細(xì)胞系LOX和不同劑量的小分子化合物FN1-5和FN1-8檢測(cè)細(xì)胞殺傷作用。將LOX細(xì)胞接種于6孔板，用10、30和50μM各化合物培育3天，如本文所述。觀察到這兩種化合物在50μM時(shí)均有顯著的細(xì)胞殺傷作用。似乎FN1-8殺傷LOX細(xì)胞的效力高于FN1-5，因?yàn)榕c30μM FN1-5比30μM FN1-8的細(xì)胞殺傷作用更高(數(shù)據(jù)未顯示)。
用不同濃度的這兩種化合物和流式細(xì)胞術(shù)更詳細(xì)地分析用小分子化合物FN1-5和FN1-8處理LOX細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞殺傷作用。處理3天后，所有測(cè)試濃度的這兩種化合物均能誘導(dǎo)LOX細(xì)胞系顯著凋亡10μM小分子化合物FN1-5誘導(dǎo)14.0％凋亡，30μM誘導(dǎo)16.6％凋亡，50μM誘導(dǎo)58.1％凋亡；對(duì)照DMSO誘導(dǎo)10.9％(表2)；(b)10μM小分子化合物FN1-8誘導(dǎo)16.7％凋亡，30μM誘導(dǎo)19.0％凋亡，50μM誘導(dǎo)78.9％凋亡(對(duì)照DMSO誘導(dǎo)10.9％凋亡)(表3)。再一次，在相等劑量下小分子化合物FN1-8的凋亡誘導(dǎo)能力似乎稍高于FN1-5(表2和3)。
用黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28進(jìn)行小分子化合物FN1-8的劑量滴定實(shí)驗(yàn)。將A375細(xì)胞接種于6孔板，分別用DMSO(對(duì)照)或2μM、5μM、10μM、20μM和40μM FN1-8培育3天。加入10μM或更高濃度的FN1-8時(shí)觀察到對(duì)此細(xì)胞系產(chǎn)生顯著和劑量依賴性的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在黑色素瘤細(xì)胞系G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28中觀察到相似的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。用20μM FN1-8培育4天后，約20％Malme-3M細(xì)胞、28％SK-Mel-2細(xì)胞、36％SK-Mel-5細(xì)胞、41％A375細(xì)胞和17％G361細(xì)胞發(fā)生凋亡，而在相同條件下少于3％正常皮膚成纖維細(xì)胞發(fā)生凋亡(表3)。
小分子化合物FN1-8也會(huì)顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，這些細(xì)胞包括Malme-3M、A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28細(xì)胞系。通過以下方法證明這一點(diǎn)用5μM或10μM FN1-8培育細(xì)胞，在加入該化合物后按照生產(chǎn)商方案在不同時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行MTS試驗(yàn)。在Malme-3M、G361、SK-Mel-2和SK-Mewl-28中，10μM FN1-8處理1-2天后能抑制這些細(xì)胞的增殖，在A375和SK-Mel-5細(xì)胞中，1天后就已經(jīng)出現(xiàn)這種作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
給予小分子化合物FN1-8后，分析黑色素瘤細(xì)胞系(Malme-3M、A375、G361、SK-Mel-2、SK-Mel-5和SK-Mel-28)的細(xì)胞存活時(shí)程。用10μM或20μM FN1-8培育這些黑色素瘤細(xì)胞。然后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)上存活細(xì)胞和死細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。在所有檢測(cè)的黑色素瘤細(xì)胞中，20μM FN1-8作用2天后具有顯著的細(xì)胞殺傷作用(圖18A、B和C，數(shù)據(jù)未顯示)。
為了研究本發(fā)明小分子化合物如FN1-8能否特異性殺傷癌細(xì)胞，在給予10μM和20μM FN1-8后，也用人正常皮膚成纖維細(xì)胞細(xì)胞(Malme-3)進(jìn)行細(xì)胞存活的時(shí)程試驗(yàn)。用10μM和20μM FN1-8培育這些細(xì)胞，6天后沒有觀察到細(xì)胞殺傷作用(圖18D)。因此，將FN1-8給予正常皮膚成纖維細(xì)胞不能影響這些正常皮膚細(xì)胞的活力。這一發(fā)現(xiàn)表明，F(xiàn)N1-8的細(xì)胞殺傷作用是對(duì)癌細(xì)胞特異的。
實(shí)施例11小分子FN1-5和FN1-8能誘導(dǎo)間皮瘤細(xì)胞系211H和H290以及原代培養(yǎng)的間皮瘤細(xì)胞凋亡 也用間皮瘤細(xì)胞系H290、211H、MS1和REN以及不同劑量的小分子化合物FN1-5和FN1-8檢測(cè)細(xì)胞殺傷作用。將細(xì)胞接種于6孔板，如本文所述用1、10和30μM各化合物培育3天。觀察到這兩種化合物在30μM時(shí)對(duì)H290和211H細(xì)胞有顯著的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，這兩種化合物在測(cè)試濃度下對(duì)MS-1和REN細(xì)胞沒有顯著影響(數(shù)據(jù)未顯示)。
用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)經(jīng)小分子化合物FN1-5和FN1-8處理的間皮瘤細(xì)胞系211H的凋亡。用30μM FN1-5(37.5％；表2)或30μM FN1-8(30.7％；表3)處理3天后，觀察到間皮瘤細(xì)胞系211H顯著凋亡。
下一步，檢測(cè)不同小分子化合物對(duì)由組織樣品新鮮制備的原代培養(yǎng)的人間皮瘤細(xì)胞的影響。如本文所述將原代培養(yǎng)物接種于6孔板，用50和100μM各化合物(FN1-5、FN1-7、FN1-8和FN3-5；母液溶解于DMSO，30mM)培育3天。觀察到FN1-5和FN1-8的顯著細(xì)胞殺傷作用。再一次，在相同劑量下，小分子化合物FN1-8殺傷此原代培養(yǎng)物的效力高于FN1-5。沒有發(fā)現(xiàn)化合物FN1-7和FN3-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(圖8)。
下一步，用不同劑量(10μM、30μM和50μM)的小分子化合物FN1-5處理由組織樣品新鮮制備的原代培養(yǎng)的人間皮瘤細(xì)胞3天后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡。在中等劑量(30和50μM)的FN1-5和FN1-8(分別見表2和3)下，觀察到凋亡增加。與圖8所示染色結(jié)果相一致，在相同劑量下FN1-8的凋亡誘導(dǎo)效力高于FN1-5(表2和3)。
也用10、30、50和100μM化合物FN1-9U和FN1-9S培育間皮瘤細(xì)胞系MS-1。雖然用100μM FN1-9U觀察到一些細(xì)胞殺傷作用，用FN1-9S沒有觀察到細(xì)胞殺傷作用或凋亡(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例12小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系LnCAF的影響 采用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人前列腺癌細(xì)胞系LnCAP的影響。30和50μM FN1-5處理后以及10、30和50μM FN1-8處理后分析LnCAP細(xì)胞活力。在50μM FN1-8時(shí)觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。觀察到FN1-5的細(xì)胞殺傷作用小得多(數(shù)據(jù)未顯示)。
也利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小分子化合物FN1-5和FN1-8在LnCAP細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。用10、30和50μM FN1-8或者30和50μM FN1-5處理3天后，觀察到LnCAP細(xì)胞顯著凋亡(表2和3)。例如，在50μM FN1-8時(shí)觀察到約42％凋亡細(xì)胞。這些結(jié)果與上述細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果相一致。再一次，發(fā)現(xiàn)相同濃度下FN1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例13小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系的影響 利用本文所述細(xì)胞毒性試驗(yàn)測(cè)定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人胰腺癌細(xì)胞系L3.6sl、Panc4.21、BxPC3和CFPAC-1的影響。分析經(jīng)10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。觀察到50μM FN1-5或FN1-8對(duì)所有分析的人胰腺癌細(xì)胞系有顯著的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，與另外三種胰腺癌細(xì)胞系相比，F(xiàn)N1-5在Panc4.21中介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷作用較低。
也利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小分子化合物FN1-5和FN1-8在人胰腺癌細(xì)胞系L3.6sl、Panc4.21、BxPC3和CFPAC-1細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡。用10、30和50μM FN1-8或者30和50μM FN1-5處理3天后，在除Panc4.21以外的所有分析的人胰腺癌細(xì)胞系中觀察到顯著凋亡，在Panc4.21中FN1-5似乎無法誘導(dǎo)凋亡(表2和3)。例如，在50μM FN1-5和50μM FN1-8下觀察到約45％凋亡細(xì)胞。這些結(jié)果與上述細(xì)胞毒試驗(yàn)的結(jié)果相一致。而FN1-5和FN1-8在L3.6sl誘導(dǎo)的凋亡程度相似，相同濃度下FN1-5在CFPAC-1細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡的效力略高，F(xiàn)N1-8在Panc4.21和BxPC3細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)的效力高于FN1-5(表2和3)。
實(shí)施例14小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7的影響。用30和50μM FN1-5處理后，以及用10、30和50μM FN1-8處理后，分析MCF-7細(xì)胞的活力。在50μM FN1-8和50μM FN1-5時(shí)觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗(yàn)中，F(xiàn)N1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例15小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)Z23247的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)Z23247的影響。用10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后，分析AZ23247細(xì)胞活力。用30μM和50μM的這兩種化合物觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例16小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系786-O、Caki和OMRC3的影響。分析經(jīng)10、30和50μMFN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。在所有分析的人腎細(xì)胞癌細(xì)胞系中觀察到50μM FN1-8和50μM FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗(yàn)中FN1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例17小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人食道癌細(xì)胞系的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人食道癌細(xì)胞系SEG-1、TE-7、BIC-1和OE21的影響。分析經(jīng)10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。在所有分析的人食道細(xì)胞中觀察到50μM FN1-8和50μM FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗(yàn)中FN1-8的效力高于FN1-5。
通過半定量RT-PCR檢測(cè)人食道癌細(xì)胞系SEG-I、TE-7、BIC-I和OE21中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活。在這些細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Hh途徑，包括Ptch 1、Gli1、Gli2和Gli3的表達(dá)被激活(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例18小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人胃癌細(xì)胞系的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人胃癌細(xì)胞系NUGC3、MNK28和AGS的影響。分析經(jīng)10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。在所有分析的人胃細(xì)胞中觀察到50μMFN1-8和50μM FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗(yàn)中FN1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例19小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人肉瘤細(xì)胞系的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人肉瘤細(xì)胞系MG63和MNNG的影響。分析經(jīng)10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。在所有分析的肉瘤細(xì)胞中觀察到50μM FN1-8的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在這些肉瘤細(xì)胞系中沒有觀察到FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例20小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HEPG2和SK-Hep-1的影響。分析經(jīng)10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。在所有分析的人胃細(xì)胞中觀察到50μMFN1-8和50μM FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗(yàn)中FN1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例21小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞系的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HONE1的影響。分析經(jīng)10、30和50μM FN1-5或FN1-8處理后這些細(xì)胞的活力。在所有分析的人胃細(xì)胞中觀察到50μMFN1-8和50μM FN1-5的顯著細(xì)胞殺傷作用(數(shù)據(jù)未顯示)。在此試驗(yàn)中FN1-8的效力高于FN1-5。
實(shí)施例22小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的影響 利用本文所述的細(xì)胞毒性試驗(yàn)確定小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的影響。分析經(jīng)30和50μM FN1-5或10、30和50μMFN1-8處理后U87細(xì)胞的活力。觀察到50μM FN1-8的顯著細(xì)胞殺傷作用，用50μM FN1-5獲得的程度較低(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例23小分子化合物對(duì)正常人肌肉細(xì)胞的影響 在正常人肌肉細(xì)胞中檢測(cè)不同劑量的小分子化合物FN1-8、FN1-7和FN1-5的細(xì)胞殺傷作用。結(jié)構(gòu)與另外兩種化合物相似、但在所測(cè)試的癌細(xì)胞系中細(xì)胞毒性不高的FN1-7用作陰性對(duì)照。將正常肌肉細(xì)胞接種于6孔板中，用1、10、30和50μM各化合物培育3天(與本文所述其它相似實(shí)驗(yàn)的方式相同)。在所有劑量的所有化合物中，都沒有觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用，這表明FN1-5和FN1-8對(duì)正常肌肉細(xì)胞無毒性。FN1-5和FN1-8似乎能特異性殺傷癌細(xì)胞。
此外，用不同劑量的FN1-5或FN1-8處理正常人肌肉細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)。將正常肌肉細(xì)胞接種于6孔板，用1、10、30和50μM各化合物培育3天，如上所述。與DMSO對(duì)照相比，用所有劑量的這兩種化合物處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異，進(jìn)一步說明FN1-5和FN1-8對(duì)正常肌肉細(xì)胞均無毒性(表2和3)。這一結(jié)果也表明，F(xiàn)N1-5和FN1-8能特異性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
實(shí)施例24小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)正常人腎細(xì)胞的影響 檢測(cè)了不同劑量的小分子化合物FN1-5和FN1-8對(duì)正常人腎細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用。將正常腎細(xì)胞接種于6孔板，用30和50μM化合物FN1-5以及10、30和50μM FN1-8培育3天(與本文所述其它相似實(shí)驗(yàn)的方式相同)。在所有劑量的所有化合物中，都沒有觀察到顯著的細(xì)胞殺傷作用，這表明FN1-5和FN1-8對(duì)正常腎細(xì)胞無毒性(數(shù)據(jù)未顯示)。
此外，用不同劑量的FN1-5(30和50μM)或FN1-8(10、30和50μM)處理正常人腎細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡誘導(dǎo)。與DMSO對(duì)照相比，用所有劑量的這兩種化合物處理后，凋亡細(xì)胞數(shù)沒有顯著差異，進(jìn)一步說明FN1-5和FN1-8對(duì)正常腎細(xì)胞均無毒性(表2和3)。
實(shí)施例25小分子FN1-5的凋亡誘導(dǎo)作用小結(jié) 下表小結(jié)了用所示濃度的小分子化合物FN1-5處理后觀察到的凋亡細(xì)胞百分率。如本文所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。N.d.，未進(jìn)行。
表2用小分子化合物FN1-5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 實(shí)施例26小分子FN1-8的凋亡誘導(dǎo)作用小結(jié) 下表小結(jié)了用所示濃度的小分子化合物FN1-8處理后觀察到的凋亡細(xì)胞百分率。如本文所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。N.d.，未進(jìn)行。
表3用小分子化合物FN1-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 實(shí)施例27小分子在NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549中調(diào)節(jié)Wnt2啟動(dòng)子活性 為了檢測(cè)本發(fā)明小分子化合物的特異性，檢測(cè)該化合物調(diào)節(jié)Gli下游靶基因表達(dá)的能力。Gli激活后能激活下游Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，Hh/Gli信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能調(diào)節(jié)Wnt基因表達(dá)?？寺∪薟nt2啟動(dòng)子后發(fā)現(xiàn)在其啟動(dòng)子區(qū)中含有推定的Gli-DNA結(jié)合位點(diǎn)(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，用幾種本發(fā)明小分子化合物處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549(表達(dá)Wnt2)后，測(cè)定Wnt2啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道活性。用30μM處理18-24小時(shí)后，F(xiàn)N1-5和FN1-8均能顯著下調(diào)Wnt2啟動(dòng)子活性(圖9)。沒有類似于FN1-5和FN1-8的強(qiáng)效細(xì)胞殺傷作用的小分子化合物對(duì)Wnt2啟動(dòng)子活性的下調(diào)影響較低或無影響(圖9)。此結(jié)果與細(xì)胞毒性和凋亡分析相一致，強(qiáng)烈表明FN1-5和FN1-8均能通過抑制Wnt2表達(dá)的Gli轉(zhuǎn)錄來誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例28小分子化合物FN1-5和FN1-8能調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的Hedgehog途徑 為了進(jìn)一步檢測(cè)本發(fā)明小分子化合物的作用機(jī)制，在NSCLC細(xì)胞系H460和A549中檢測(cè)化合物FN1-5和FN1-8對(duì)Hedgehog(Hh)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響。用30μM各化合物(FN1-5或FN1-8)培育H460和A549細(xì)胞2天，然后分離全部RNA，用于半定量RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)Hh途徑的關(guān)鍵組件和直接靶基因(如Ptch1和GH1)被下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。GAPDH用作對(duì)照。
與上述內(nèi)容相似地，利用Wnt2啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FN1-8處理后Wnt2表達(dá)也下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，小分子化合物FN1-5和FN1-8可能是Hh和Wnt途徑的雙抑制劑。此外，似乎FN1-8對(duì)這兩條途徑的抑制作用高于FN1-5，這與這些細(xì)胞系的凋亡分析相一致(數(shù)據(jù)未顯示)。
如半定量RT-PCR所示，小分子化合物FN1-5和FN1-8也可調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞系LOX、結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480和由組織新鮮制備的原代培養(yǎng)的人間皮瘤細(xì)胞的hedgehog途徑(數(shù)據(jù)未顯示)。令人感興趣的是，在HT29細(xì)胞中沒有觀察到顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例29小分子化合物FN1-8在黑色素瘤細(xì)胞中能下調(diào)GLI1-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄 為了進(jìn)一步檢測(cè)小分子化合物FN1-8的特異性，具體說，在不存在和存在小分子化合物FN1-8的情況下檢測(cè)GLI-依賴性轉(zhuǎn)錄，以測(cè)定FN1-8調(diào)節(jié)Hh/Gli信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用。具體說，利用連接熒光素酶報(bào)道基因的6個(gè)GLI-結(jié)合位點(diǎn)重復(fù)單元(6xGLI BS；Sasaki等，Development 124(7)1313-22(1997))作為GLI依賴性轉(zhuǎn)錄替代測(cè)定的質(zhì)粒表達(dá)構(gòu)建物來檢測(cè)將FN1-8給予幾種黑色素瘤細(xì)胞系后的6xGLI BS-熒光素酶活性，所述黑色素瘤細(xì)胞系包括Malme-3M(圖15A)、A375(圖15B)、SK-Mel-2(圖15C)和SK-Mel-5(圖15D)。在所有測(cè)試的4種黑色素瘤細(xì)胞系中，共同表達(dá)GLI1(將本文所述的Gli1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到黑色素瘤細(xì)胞中)能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(圖15A-D，＂Gli+DMSO＂柱)。這驗(yàn)證了，過度表達(dá)(即外源性加入)的GLI1能特異性結(jié)合GLI-結(jié)合位點(diǎn)，并且功能性誘導(dǎo)熒光素酶報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。將不表達(dá)GLI1的對(duì)照載體也轉(zhuǎn)染到這些黑色素瘤細(xì)胞中，但不會(huì)產(chǎn)生高水平的熒光素酶活性(圖15A-D，＂對(duì)照載體+DMSO＂柱)。20μMFN1-8處理16-20小時(shí)后，觀察到熒光素酶活性水平顯著降低(圖15A-D，＂Gli+20μM FN1-8＂柱)。因此，小分子化合物FN1-8能顯著降低這些黑色素瘤細(xì)胞中GLI1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。此結(jié)果表明，F(xiàn)N1-8是GLI依賴性轉(zhuǎn)錄的抑制劑。這一發(fā)現(xiàn)也提供了抑制細(xì)胞中GLI依賴性轉(zhuǎn)錄的方法。
實(shí)施例30小分子化合物FN1-5和FN1-8能下調(diào)胰腺癌細(xì)胞中GLI1-和GLI2-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄 為了進(jìn)一步檢測(cè)小分子化合物FN1-5和FN1-8抑制Hh/Gli信號(hào)傳導(dǎo)途徑的特異性，也測(cè)定了不存在和存在這些化合物時(shí)胰腺癌細(xì)胞中的GLI依賴性轉(zhuǎn)錄。具體說，利用實(shí)施例29所述的(6xGli BS)熒光素酶報(bào)道基因構(gòu)建物測(cè)定單獨(dú)GLI1(將本文所述的Gli1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Panc4.21細(xì)胞中)或單獨(dú)GLI2(將本文所述的Gli2表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Panc4.21細(xì)胞中)的6xGLIBS-熒光素酶過度表達(dá)能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。這驗(yàn)證了過度表達(dá)(即外源性加入)的GLI1或GLI2多肽能特異性結(jié)合GLI-結(jié)合位點(diǎn)，并且功能性誘導(dǎo)熒光素酶報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。將不表達(dá)Gli1或Gli2或Gli3表達(dá)載體的對(duì)照載體轉(zhuǎn)染到這些胰腺癌細(xì)胞中時(shí)，不會(huì)產(chǎn)生高水平的熒光素酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。Gli3表達(dá)不導(dǎo)致熒光素酶活性升高的事實(shí)可能是由于GLI3中同時(shí)存在激活物和阻抑物結(jié)構(gòu)域。
20μM FN1-5或FN1-8處理16-20小時(shí)后，觀察到熒光素酶活性水平顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)。因此，小分子化合物FN1-5和FN1-8能顯著降低胰腺癌細(xì)胞中GLI1-和GLI2-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果表明，F(xiàn)N1-5和FN1-8可用作GLI1-和GLI2-依賴性轉(zhuǎn)錄的抑制劑。這一發(fā)現(xiàn)也提供了抑制細(xì)胞中GLI1-和GLI2-依賴性轉(zhuǎn)錄的方法。
在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)共同轉(zhuǎn)染TAFII31表達(dá)質(zhì)粒與GLI1或GlLI2表達(dá)質(zhì)粒也能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(數(shù)據(jù)未顯示)。加入FN1-5或FN1-8(20μM，16-20小時(shí))后，6xGLI BS-熒光素酶活性顯著降低(數(shù)據(jù)未顯示)。TAFII31表達(dá)質(zhì)粒含有通過PCR克隆到含有c-Myc標(biāo)簽的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(pCDNA3.1(-)B)的EcoRI(5′)和BamHI(3′)位點(diǎn)中產(chǎn)生的全長(zhǎng)TAFII31 cDNA。TAFII31的序列對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)U25112。
實(shí)施例31用小分子化合物調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116和SW480中的TOP/FOP活性 作為本發(fā)明小分子化合物的另一個(gè)特異性檢測(cè)，使用TOP/FOP實(shí)驗(yàn)測(cè)試了小分子化合物FN1-5、FN1-7、FN1-8、FN1-9U、FN1-9S、FN2-1和FN3-5可否調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。在這些實(shí)驗(yàn)中，使用通過TOP/FOP實(shí)驗(yàn)測(cè)定具有高TCF轉(zhuǎn)錄活性的結(jié)腸癌細(xì)胞系。圖10顯示了HCT116細(xì)胞的結(jié)果。用30μM處理18-24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)FN1-5和FN1-8能顯著下調(diào)TOP/FOP活性。使用不誘導(dǎo)顯著細(xì)胞殺傷作用的化合物在此試驗(yàn)中觀察到?jīng)]有顯著下調(diào)。此結(jié)果也與細(xì)胞毒性、凋亡和Wnt2啟動(dòng)子活性分析相一致，表明FN1-5和FN1-8能通過抑制Wnt2表達(dá)的Gli轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)凋亡，進(jìn)而抑制Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴性轉(zhuǎn)錄。
也分析了上述相同化合物在結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480中調(diào)節(jié)TOP/FOP活性的概況。雖然化合物FN1-5對(duì)此細(xì)胞系的影響較小，但與HCT116細(xì)胞中降低約36％相比，小分子化合物FN1-8在SW480細(xì)胞中使TOP/FOP活性降低了約32％(數(shù)據(jù)未顯示)(見圖10)。
實(shí)施例32由小分子化合物調(diào)節(jié)SOCS-3和Gremlin啟動(dòng)子活性 作為本發(fā)明小分子化合物的第三個(gè)特異性檢測(cè)，分析了這些化合物調(diào)節(jié)非Gli激活下游靶點(diǎn)的基因表達(dá)的能力。選擇JAK/STAT途徑的抑制劑和下游靶基因SOCS3進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。SOCS3的表達(dá)不受Gli和/或Wnt活化的控制。而且，在Jablons博士實(shí)驗(yàn)室(加州大學(xué)舊金山分校；數(shù)據(jù)未顯示)克隆的人SOCS3啟動(dòng)子中沒有發(fā)現(xiàn)GLI和TCF結(jié)合位點(diǎn)。因此，用小分子化合物FN1-5、FN1-7、FN1-8和FN1-9U處理NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549后測(cè)定SOCS3啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道活性。30μM處理18-24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)FN1-5和FN1-8都不能調(diào)節(jié)SOCS3啟動(dòng)子活性，類似于沒有細(xì)胞殺傷作用的其它化合物(如FN1-7和FN1-9U；圖11)。此結(jié)果表明，F(xiàn)N1-5和FN1-8是抑制GLI轉(zhuǎn)錄活性的特異性小分子抑制劑。
作為本發(fā)明小分子化合物的第四個(gè)特異性檢測(cè)，檢測(cè)了化合物FN1-5和FN1-8調(diào)節(jié)非Gli激活下游靶點(diǎn)的另一基因表達(dá)的能力。選擇BMP和TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑Gremlin進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。Gremlin表達(dá)不受Gli和/或Wnt激活的控制。因此，用化合物FN1-5、FN1-8或DMSO(對(duì)照)或空載體(對(duì)照)處理HEK293T細(xì)胞后，檢測(cè)了人Gremlin啟動(dòng)子-熒光素酶報(bào)道物的活性。30μM處理18-24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)FN1-5和FN1-8都不能調(diào)節(jié)Gremlin啟動(dòng)子活性(數(shù)據(jù)未顯示)。此結(jié)果也表明，F(xiàn)N1-5和FN1-8是抑制GLI轉(zhuǎn)錄活性的特異性小分子抑制劑。人Gremlin在Jablons博士實(shí)驗(yàn)室(加州大學(xué)舊金山分校；數(shù)據(jù)未顯示)進(jìn)行克隆。
實(shí)施例33GLI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的小分子化合物抑制劑能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞、NSCLC細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 為了檢測(cè)本發(fā)明小分子化合物能否用作GLI3激活域的小分子抑制劑并抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，用30μM的小分子化合物FN-15和FN1-8以及DMSO(對(duì)照)處理2天后，用Western印跡法分析結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、HT29和CaCO2中經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵組件(如Dvl-3和胞漿β-聯(lián)蛋白)，β-肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。與凋亡誘導(dǎo)結(jié)果一致，用化合物處理后觀察到這些細(xì)胞中Dvl-3和胞漿β聯(lián)蛋白顯著下調(diào)(圖12)。存活素、凋亡抑制蛋白和Wnt下游靶基因(Kim等，2003)也下調(diào)(圖12)。令人感興趣的是，注意到在HT29細(xì)胞中，F(xiàn)N1-8處理后沒有觀察到Dvl-3和胞漿β-聯(lián)蛋白的下調(diào)，這與HT29細(xì)胞活力不受FN1-8化合物影響的結(jié)果相一致。
為了檢測(cè)本發(fā)明小分子化合物能否用作GLI3激活域的小分子抑制劑并抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，用30μM的小分子化合物FN-15和FN1-8以及DMSO(對(duì)照)處理2天后，用Western印跡法分析NSCLC細(xì)胞H460、A549和H838中經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵組件(如Dvl-3和胞漿β-聯(lián)蛋白)，β-肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。與凋亡誘導(dǎo)結(jié)果一致，用化合物處理后觀察到這些細(xì)胞中Dvl-3和胞漿β聯(lián)蛋白顯著下調(diào)(圖13)。存活素，一種凋亡抑制蛋白和Wnt下游靶基因(Kim等，2003)也下調(diào)(圖13)。
在另一實(shí)驗(yàn)中，我們使用Western印跡分析檢測(cè)小分子化合物FN1-8能否通過抑制Wnt經(jīng)典途徑抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(見上)。用DMSO(對(duì)照)、10μM或20μM FN1-8處理后，由兩種黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375和SK-Mel-5以及人正常皮膚成纖維細(xì)胞(Malme-3)分離胞漿蛋白。β-肌動(dòng)蛋白用作對(duì)照。這些實(shí)驗(yàn)證明，用FN1-8處理后，黑色素瘤細(xì)胞中經(jīng)典Wnt激活途徑的關(guān)鍵指標(biāo)之一，即胞漿β-聯(lián)蛋白水平下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，沒有觀察到人正常皮膚成纖維細(xì)胞中胞漿β-聯(lián)蛋白水平的顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果表明，本發(fā)明小分子化合物如FN1-8能特異性抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并通過抑制經(jīng)典Wnt途徑誘導(dǎo)這些癌細(xì)胞凋亡。如本文所述，這些結(jié)果進(jìn)一步提示，F(xiàn)N1-8是Hh和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑的雙抑制劑。
實(shí)施例34GLI2的過度表達(dá)能拯救用小分子化合物抑制劑FN1-5和FN1-8處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480 如本文所述，GLI3似乎能激活Gli1和Gli2基因的轉(zhuǎn)錄。因此，本發(fā)明小分子化合物抑制GLI3活性也應(yīng)抑制GLI1和/或GLI2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如果是這樣，那么將GLI1和/或GLI2表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染到用本發(fā)明小分子化合物處理的細(xì)胞中應(yīng)能夠至少部分地拯救該小分子化合物介導(dǎo)的凋亡作用。因此，為了進(jìn)一步檢測(cè)小分子化合物FN1-5的特異性以及其抑制機(jī)制，檢測(cè)了過度表達(dá)GLI2蛋白可否減輕FN1-5的細(xì)胞殺傷作用。在此實(shí)驗(yàn)中，用空pCDNA3載體或Gli2 cDNA表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480。選擇后，將相同數(shù)量的轉(zhuǎn)染細(xì)胞再次接種于6孔板，然后將FN1-5加入培養(yǎng)基中，終濃度為50μM。5天后，發(fā)現(xiàn)FN1-5殺傷的Gli2轉(zhuǎn)染細(xì)胞少于空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示)。這一結(jié)果表明，F(xiàn)N1-5通過抑制GLI3轉(zhuǎn)錄激活功殺傷癌細(xì)胞。
為了進(jìn)一步研究小分子化合物FN1-8的特異性以及其抑制機(jī)制，我們檢測(cè)了過度表達(dá)GLI2蛋白可否減輕FN1-8的細(xì)胞殺傷作用。如上所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。5天后，用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡分析以定量測(cè)定該實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)與用Gli2表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞(27.7％)相比，用空載體轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞(48.1％)中凋亡細(xì)胞明顯更多。此結(jié)果也表明，F(xiàn)N1-8通過抑制GLI3轉(zhuǎn)錄激活功誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。
為了驗(yàn)證GLI2過度表達(dá)能降低FN1-5和FN1-8在結(jié)腸癌細(xì)胞SW480中的凋亡誘導(dǎo)能力的結(jié)果，進(jìn)行Western印跡分析以檢測(cè)經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵組件(胞漿β-聯(lián)蛋白)、其下游靶點(diǎn)(存活素)和凋亡途徑中一些關(guān)鍵因子(用作凋亡正向調(diào)節(jié)物的細(xì)胞色素c和活性PARP(切割形式)；用作凋亡抑制物的存活素)的表達(dá)。β-肌動(dòng)蛋白用作加樣對(duì)照。所得結(jié)果與上述凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析相一致(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了FN1-5和FN1-8均可通過抑制GLI3轉(zhuǎn)錄激活功能誘導(dǎo)一些癌細(xì)胞凋亡的其它數(shù)據(jù)。
為了驗(yàn)證Gli2過度表達(dá)能通過再次激活Hh信號(hào)傳導(dǎo)途徑降低FN1-5和FN1-8在結(jié)腸癌細(xì)胞中的凋亡誘導(dǎo)能力的結(jié)果，利用半定量RT-PCR分析Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵組件和其下游靶點(diǎn)(Shh、Ptch1、Gli1、Gli3)。GAPDH用作對(duì)照。已發(fā)現(xiàn)該結(jié)果與上述凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析相一致(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例35小分子化合物抑制GLI多肽和TAF蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致抑制GLI-TAF誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性 另外，如上所述，檢測(cè)了本發(fā)明化合物抑制GLI活性的特異性，并測(cè)定這些化合物能否阻斷GLI和TAFII31之間的相互作用。具體說，在此分析中，用化合物FN1-8處理NSCLC A549細(xì)胞后，利用將6個(gè)GLI-結(jié)合位點(diǎn)重復(fù)(6xGLI BS)連接于熒光素酶報(bào)道基因作為GLI依賴性轉(zhuǎn)錄替代測(cè)定的表達(dá)構(gòu)建物來檢測(cè)6xGLI BS-熒光素酶活性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單獨(dú)GLI1或GLI2過度表達(dá)能顯著提高6xGLI BS-熒光素酶活性(圖16)。共同表達(dá)TAFII31與GLI1或GLI2能將6xGLI BS-熒光素酶活性進(jìn)一步提高，其水平顯著高于單獨(dú)的GLI1或GLI2，而單獨(dú)TAFII31的過度表達(dá)沒有任何影響(圖16)。此發(fā)現(xiàn)再次確認(rèn)，GLI1和GLI2均能特異性結(jié)合GLI-結(jié)合位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄中有功能活性。此結(jié)果還說明，TAFII31可能作為輔助激活物與GLI蛋白相互作用。用20μM FN1-8處理A549細(xì)胞16-20小時(shí)后，單獨(dú)GLI和GLI/TAFII31誘導(dǎo)的6xGLI BS-熒光素酶轉(zhuǎn)錄降低。感興趣的是，雖然單獨(dú)GLI的轉(zhuǎn)錄活性降低約30％，用TAFII31與GLI2共同轉(zhuǎn)染時(shí)A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性降低約50％，用TAFII31與GLI1共同轉(zhuǎn)染時(shí)轉(zhuǎn)錄活性降低約70％。此結(jié)果表明，F(xiàn)N1-8可能是GLI蛋白和TAFII31相互作用的特異性抑制劑。
在共免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中，已證明小分子化合物FN1-8能阻斷GLI蛋白的TAF結(jié)合域與TAFII31蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用(圖23)。具體到此實(shí)驗(yàn)來說，由基因美得合成公司(Genemed Synthesis，Inc)定制合成GLI蛋白GLI1、GLI2和GLI3的生物素化TAF結(jié)合域(見下)。GLI-TAF結(jié)合域(GLI-TAFbd)肽序列如下 GLI1-TAFbd(NH2)-LDSLDLDNTQLDFVAILDEPQG-(COOH)； GLI2-TAFbd(NH2)-VDSQLLEAPQIDFDAIMDDGDH-(COOH)；和 G1LI-TAFbd(NH2)-LDSHDLEGVQIDFDAIIDDGDH-(COOH) 按照生產(chǎn)商方案利用TNT快速偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)(普洛麥格公司(Promega))制備TAFII31蛋白?？寺〉?c-myc-標(biāo)簽)pCDNA3.1表達(dá)載體中的全長(zhǎng)TAFII31 cDNA插入物用作此體外翻譯系統(tǒng)的模板?？?c-myc標(biāo)簽)pCDNA3.1表達(dá)載體用作對(duì)照。在存在或不存在小分子化合物FN1-8(20μM和50μM)的情況下用TAFII31蛋白培育生物素化GLI肽(即三種不同GLI蛋白的TAF結(jié)合域)。然后，用鏈霉親和素瓊脂糖沉淀生物素化GLI-肽-TAFII31復(fù)合物，然后用抗c-myc抗體(A-14；圣克魯斯生物技術(shù)公司(SantaCruz Biotech，Inc.)；Cao等，2001，Science 293115-120)進(jìn)行免疫印跡。在此實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入50μM FN1-8能減少GLI-肽-TAFII31復(fù)合物的形成(圖23)。具體說，似乎FN1-8阻斷TAFII31與GLI3和GLI1的TAF結(jié)合域的蛋白質(zhì)相互作用的效力高于阻斷TAFII31與GLI2的TAF結(jié)合域的蛋白質(zhì)相互作用的效力(圖23)。作為對(duì)照，(c-myc-標(biāo)簽)pCDNA3.1空表達(dá)載體用于體外翻譯系統(tǒng)時(shí)，所有三種GLI肽都沒有拉下(pull-down)TAFII31(圖23)。
總之，這些數(shù)據(jù)表明小分子化合物FN1-8能阻斷GLI蛋白(更優(yōu)選GLI1和GLI3)的TAF結(jié)合域與TAFII31蛋白之間的蛋白質(zhì)相互作用，與上述GLI/TAFII31依賴性轉(zhuǎn)錄報(bào)道實(shí)驗(yàn)相一致。也可利用此種GLI-肽/TAFII31蛋白-蛋白相互作用實(shí)驗(yàn)篩選抑制GLI蛋白(或上述GLI肽)之間的蛋白質(zhì)相互作用的物質(zhì)。在這一方法中，如上所述，用GLI蛋白(或GLI肽)和TAFII31蛋白培育準(zhǔn)備確認(rèn)或篩選的物質(zhì)。
實(shí)施例36小分子化合物FN1-8抑制腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)(小鼠異種移植瘤模型NSCLC H460) 用小鼠異種移植瘤模型(NSCLC H460)進(jìn)行小分子化合物FN1-8的體內(nèi)效力研究。在小鼠背部區(qū)域皮下注射體積100μl的3 x 106個(gè)細(xì)胞。(圖17，箭頭)。接種7天后，小鼠開始接受每日劑量50毫克/千克體重的FN1-8治療，共2 x 6天(n＝6)。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照(n＝7)。將FN1-8和DMSO調(diào)整為40μl體積，向小鼠腹腔進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。圖18A的箭頭表明每次注射的時(shí)間點(diǎn)。用游標(biāo)卡尺每三天測(cè)定一次腫瘤大小(根據(jù)其形狀確定的長(zhǎng)度和寬度)。用等式x2y計(jì)算腫瘤體積(其中x<y)。如圖17和18所示，用小分子化合物FN1-8治療后腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制。
初次接種腫瘤并進(jìn)行上述治療3周后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。用FN1-8化合物治療后瘤重顯著降低(圖18B和18C)。
實(shí)施例37小分子化合物FN1-8抑制腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)(小鼠異種移植瘤模型；黑色素瘤LOX) 利用小鼠異種移植瘤模型(黑色素瘤Lox)進(jìn)行小分子化合物FN1-8的體內(nèi)功效研究。在小鼠背部區(qū)域皮下注射體積100μl的3 x 106個(gè)細(xì)胞。圖17，箭頭)。接種7天后，小鼠開始接受每日劑量50毫克/千克體重的FN1-8治療，共2 x 6天(n＝9)。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照(n＝10)。將FN1-8和DMSO調(diào)整為40μl體積，向小鼠腹腔進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。圖19A的箭頭表明每次注射的時(shí)間點(diǎn)。如上所述計(jì)算腫瘤大小和腫瘤體積。如圖17和19所示，用小分子化合物FN1-8治療后腫瘤生長(zhǎng)被顯著抑制。
初次接種腫瘤并進(jìn)行上述治療3周后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。用FN1-8化合物治療后瘤重顯著降低(圖19B和19C)。
在小鼠異種移植瘤模型(NSCLC H460)中，利用較低劑量的化合物重復(fù)小分子化合物FN1-5和FN1-8的體內(nèi)功效研究。如上所述對(duì)小鼠進(jìn)行注射。接種9天后，小鼠開始接受每日劑量15毫克/千克體重的化合物治療，共2x 6天(n＝7)。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照(n＝7)。將FN1-8和DMSO調(diào)整為50μl體積，向小鼠腹腔進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。初次接種腫瘤24天后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。用小分子化合物FN1-8治療后瘤重降低(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，用低劑量化合物FN1-5治療的小鼠的瘤重與DMSO對(duì)照組相似。此低劑量體內(nèi)結(jié)果與本文所示的體外數(shù)據(jù)相一致。
實(shí)施例38小分子化合物FN1-8不影響腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)(小鼠異種移植瘤模型結(jié)腸癌HT29) 也利用陰性小鼠異種移植瘤模型(結(jié)腸癌HT29)進(jìn)行小分子化合物FN1-8的體內(nèi)功效研究。在小鼠背部區(qū)域皮下注射體積100μl的3 x 106個(gè)細(xì)胞。接種7天后，小鼠開始接受每日劑量50毫克/千克體重的FN1-8治療，共2 x 6天(n＝2)。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照(n＝4)。將FN1-8和DMSO調(diào)整為40μl體積，向小鼠腹腔進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。圖20A的箭頭表明每次注射的時(shí)間點(diǎn)。每三天用游標(biāo)卡尺測(cè)定腫瘤大小。用等式x2y計(jì)算腫瘤體積(其中x<y)。如圖16A所示，小分子化合物FN1-8治療后沒有影響腫瘤生長(zhǎng)。此結(jié)果與顯示FN1-8對(duì)HT29細(xì)胞的GLI3活化無影響且沒有Gli3 RT-PCR產(chǎn)物的體外數(shù)據(jù)(參見如圖12，數(shù)據(jù)未顯示)相一致。FN1-8治療后的瘤重類似于DMSO對(duì)照組(圖20B)。結(jié)果表示為平均值±SD(誤差線)。
在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，接種7天后，小鼠開始接受每日劑量15毫克/千克體重的FN1-8或FN1-5治療，共2 x 6天(n＝7)，然后進(jìn)行另一輪每日劑量30毫克/千克體重的治療，共1 x 6天。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照(n＝7)。將化合物和DMSO調(diào)整為50μl體積，向小鼠腹腔進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。初次接種腫瘤43天后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。發(fā)現(xiàn)FN1-8治療后HT29瘤重與DMSO對(duì)照組相似(數(shù)據(jù)未顯示)。還發(fā)現(xiàn)FN1-5治療略微降低了瘤重(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果與FN1-5、而非FN1-8能在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29中誘導(dǎo)細(xì)胞殺傷作用和凋亡的HT29細(xì)胞體外數(shù)據(jù)(見實(shí)施例7)相一致。
實(shí)施例39小分子化合物FN1-8能抑制腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)(小鼠異種移植瘤模型NSCLC A549 利用小鼠異種移植瘤模型(NSCLC A549)進(jìn)行小分子化合物FN1-8的體內(nèi)功效研究。在小鼠背部區(qū)域皮下注射體積100μl的3 x 106個(gè)細(xì)胞。接種10天后，小鼠開始接受每日劑量15毫克/千克體重的小分子化合物FN1-8治療，共2 x 6天(n＝5)，然后進(jìn)行另一輪每日劑量30毫克/千克體重的治療，共1x6天。單獨(dú)的DMSO用作對(duì)照(n＝5)。將FN1-8和DMSO調(diào)整為50μl體積，向小鼠腹腔進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。初次接種腫瘤43天后，從各組小鼠切下腫瘤，用天平稱重。與DMSO對(duì)照組相比，F(xiàn)N1-8化合物治療后瘤重降低(數(shù)據(jù)未顯示)。此低劑量體內(nèi)結(jié)果與本文所示的體外數(shù)據(jù)相一致。
實(shí)施例40小分子化合物FN1-8在體內(nèi)對(duì)腫瘤Hedgehog途徑的影響 為了檢測(cè)前導(dǎo)化合物FN1-8是否通過抑制Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)，用分離自異種移植瘤的總RNA通過半定量RT-PCR分析Hh途徑的關(guān)鍵組件和直接靶基因(如Shh、Ptch1、Gli1、Gli2、Gli3、Dvl-3)的表達(dá)。GAPDH用作對(duì)照。用各組中帶有適當(dāng)大小腫瘤的兩只隨機(jī)選擇的小鼠的腫瘤“集合”進(jìn)行此RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)在NSCLC腫瘤(H460)中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被FN1-8抑制(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，觀察到FN1-8體內(nèi)治療后陰性對(duì)照HT29腫瘤中Hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)未發(fā)生顯著改變。這些結(jié)果與體外結(jié)果相一致(參見例如表2和3，誘導(dǎo)H460和HT29細(xì)胞凋亡)，這表明小分子化合物FN1-8可通過抑制Hh途徑特異性抑制體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。
實(shí)施例41小分子化合物FN1-8在體內(nèi)對(duì)腫瘤的經(jīng)典Wnt途徑的影響 為了檢測(cè)前導(dǎo)化合物FN1-8能否通過抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)，用Western印跡分析了分離自H460和HT29異種移植瘤的胞漿蛋白。GAPDH用作對(duì)照。用各組中帶有適當(dāng)大小腫瘤的兩只隨機(jī)選擇的小鼠的腫瘤“集合”進(jìn)行此Western印跡分析。發(fā)現(xiàn)與DMSO治療組相比，F(xiàn)N1-8治療的H460腫瘤中經(jīng)典Wnt激活、Dvl-3和胞漿β-聯(lián)蛋白關(guān)鍵指標(biāo) 的表達(dá)下調(diào)(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，在體內(nèi)用FN1-8治療后，沒有觀察到陰性對(duì)照HT29腫瘤中Dvl-3和胞漿β-聯(lián)蛋白水平發(fā)生顯著改變(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例42體內(nèi)治療后小分子化合物FN1-8對(duì)小鼠體重的影響 作為一個(gè)FN1-8的初步體內(nèi)毒性研究，檢測(cè)了FN1-8治療后小鼠體重是否降低。如前述實(shí)施例所述初次接種腫瘤并進(jìn)行治療3周后，用天平稱量DMSO對(duì)照組(n＝11)和FN1-8治療組(n＝8)的體重。FN1-8治療后沒有觀察到顯著的體重?fù)p失(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例43小分子化合物FN1-5和FN1-8在小鼠中的藥代動(dòng)力學(xué)分析 向三只小鼠的腹腔腹膜內(nèi)注射30毫克/千克體重的小分子化合物FN1-5。在注射FN1-5后10分鐘、2小時(shí)，6小時(shí)和24小時(shí)，由各小鼠的尾靜脈采集血漿。用質(zhì)譜測(cè)定各血漿樣品中的FN1-5濃度，見圖21A。此分析顯示，注射化合物后FN1-5在10分鐘內(nèi)快速攝入到血漿中。在24小時(shí)內(nèi)血清中的FN1-5濃度消失，這表明FN1-5可體內(nèi)吸收。
相似地，分析了小分子化合物FN1-8的藥動(dòng)學(xué)特性(圖21B)。將FN1-8與FN1-5的攝入相比，腹膜內(nèi)注射后FN1-5的攝入似乎更好，提高約2倍。
在另一藥代動(dòng)力學(xué)研究中，三只小鼠口服給予劑量為30毫克/千克體重的小分子化合物FN1-5。然后，如上所述，由各小鼠的尾靜脈采集血漿，用質(zhì)譜測(cè)定各血漿樣品中的FN1-5濃度。結(jié)果見圖22A。此分析的結(jié)果表明，F(xiàn)N1-5快速攝入到血漿中(注射化合物后10分鐘內(nèi))，24小時(shí)內(nèi)消失。此結(jié)果再一次表明，可將FN1-5制備成適合口服給藥以治療癌癥。
相似地，分析了口服給藥的小分子化合物FN1-8的藥代動(dòng)力學(xué)特性(圖22B)。將FN1-8與FN1-5的攝入相比，口服給藥后FN1-5的攝入似乎更好，提高約7倍。
權(quán)利要求
1.一種具有下式的小分子化合物，及其鹽、水合物、溶劑合物、異構(gòu)體和前藥
式中X1和X2各自獨(dú)立地是N或C，式中X1和X2之一是N，X1和X2之一是C，因此環(huán)N與X1和X2中是C的那個(gè)形成雙鍵；
R1、R2和R3各自獨(dú)立地選自用0-3個(gè)R6基團(tuán)任選取代的C1-C6烷基、芳基、雜芳基、環(huán)烷基和雜環(huán)烷基，所述R6基團(tuán)各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-C6烷基、-OR7、-C(O)R7、-OC(O)R7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)R7、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、-N(R7)C(NR7)N(R7，R7)和S(O)mR7，其中下標(biāo)m是0、1或2；
Y是直接鍵或C1-C4烷基；
Z選自C1-C4烷基、芳基和雜芳基；
R4是氫、鹵素、-OR7、-OC(O)R7、-C(O)OR7、-N(R7，R7)、-NR7S(O)2R7、-C(O)N(R7，R7)、-N(R7)C(O)N(R7，R7)、-C(NR7)N(R7，R7)、NR7C(O)R7和S(O)mR7，式中下標(biāo)m是0、1或2；
R5是H、C1-C6烷基，或任選與Y組合形成5-6元雜環(huán)；
R7各自獨(dú)立地是H或C1-C6烷基。
2.如權(quán)利要求1所述的小分子化合物，其特征在于，R1、R2和R3各自是芳基。
3.如權(quán)利要求2所述的小分子化合物，其特征在于，R1、R2和R3各自是苯基。
4.如權(quán)利要求2所述的小分子化合物，其特征在于，R4是羥基。
5.如權(quán)利要求4所述的小分子化合物，其特征在于，Z是C1-C4烷基。
6.如權(quán)利要求4所述的小分子化合物，其特征在于，Z是芳基。
7.如權(quán)利要求6所述的小分子化合物，其特征在于，Z是苯基。
8.如權(quán)利要求1所述的小分子化合物，其特征在于，
R1、R2和R3各自是苯基；
Y是C1-C4烷基；
Z是C1-C4烷基或苯基；和
R4是羥基。
9.如權(quán)利要求8所述的小分子化合物，其特征在于，X1是C，X2是N。
10.如權(quán)利要求9所述的小分子化合物，具有以下結(jié)構(gòu)
11.如權(quán)利要求9所述的小分子化合物，具有以下結(jié)構(gòu)
12.如權(quán)利要求8所述的小分子化合物，其特征在于，X1是N，X2是C。
13.如權(quán)利要求12所述的小分子化合物，具有以下結(jié)構(gòu)
14.如權(quán)利要求12所述的小分子化合物，具有以下結(jié)構(gòu)
15.一種藥物組合物，其包含(i)權(quán)利要求1所述的小分子化合物；和(ii)藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體。
16.一種誘導(dǎo)表達(dá)GLI蛋白的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使所述腫瘤細(xì)胞與足量的權(quán)利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中所述接觸能誘導(dǎo)所述腫瘤細(xì)胞凋亡。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述腫瘤細(xì)胞選自結(jié)腸癌、黑色素瘤、間皮瘤、肺癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、前列腺癌、肉瘤、卵巢癌、食道癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、鼻咽癌、胰腺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述GLI蛋白是GLI1、GLI2或GLI3。
19.如權(quán)利要求16所述的方法，所述方法在體外實(shí)施。
20.如權(quán)利要求16所述的方法，所述方法在體內(nèi)實(shí)施。
21.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，給予所述小分子化合物作為癌癥治療方案的一部分。
22.一種抑制細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為的方法，所述方法包括以下步驟
(a)確定細(xì)胞是否表達(dá)Gli基因；和
(b)使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中步驟(b)導(dǎo)致細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中的至少一種行為受到抑制。
23.一種治療存在癌性病癥的對(duì)象的方法，所述方法包括以下步驟
(a)給予所述對(duì)象治療有效量的權(quán)利要求1所述的小分子化合物；
其中所述癌性病癥的特征是表達(dá)GLI蛋白；其中步驟(a)導(dǎo)致所述對(duì)象得到治療。
24.一種抑制細(xì)胞中GLI蛋白活性的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使所述細(xì)胞與權(quán)利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中所述接觸導(dǎo)致所述細(xì)胞中GLI蛋白的活性受到抑制。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，所述GLI活性是GLI蛋白和TAF蛋白之間的蛋白-蛋白相互作用。
26.一種抑制GLI蛋白DNA結(jié)合位點(diǎn)操作性連接于該基因啟動(dòng)子的基因表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使表達(dá)所述基因的細(xì)胞與權(quán)利要求1所述的小分子化合物相接觸；
其中所述接觸導(dǎo)致所述基因的表達(dá)受到抑制。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，所述基因是Wnt2基因。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述Wnt2基因是人基因。
29.如權(quán)利要求1所述小分子化合物在制備抑制細(xì)胞的不良生長(zhǎng)、過度增殖或存活中至少一種行為的藥物中的應(yīng)用。
30.權(quán)利要求1所述小分子化合物在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
31.權(quán)利要求1所述小分子化合物在制備誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
32.權(quán)利要求1所述小分子化合物在制備抑制細(xì)胞的GLI蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的藥物中的應(yīng)用。
33.一種鑒定能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白之間蛋白-蛋白相互作用的候選化合物的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使候選化合物與含有GLI蛋白和TAFII31蛋白的樣品相接觸；和
(b)確定GLI蛋白與TAFII31蛋白的結(jié)合，
其中，與不存在候選化合物時(shí)GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合相比，在候選化合物存在下GLI蛋白與TAFII31的結(jié)合水平降低表明該候選化合物能夠抑制GLI蛋白和TAFII31蛋白之間的相互作用。
34.一種鑒定能夠調(diào)節(jié)GLI-蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性的化合物的方法，所述方法包括以下步驟
(a)使樣品與候選化合物相接觸，其中所述樣品包含具有操作性連接于報(bào)道基因的一個(gè)或多個(gè)GLI DNA結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)報(bào)道構(gòu)建物；和
(b)如果有，則測(cè)定所述候選化合物對(duì)GLI蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄活性水平的影響。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述樣品包括細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了診斷和治療表達(dá)GLI多肽，特別是GLI1、GLI2或GLI3多肽的癌癥的組合物、方法和試劑盒。本發(fā)明提供了模擬GLI多肽的轉(zhuǎn)錄激活域的小分子化合物。本發(fā)明的小分子抑制劑能特異性阻斷GLI多態(tài)的激活功能，而不是GLI3的阻抑功能。
文檔編號(hào)A61K31/415GK101370498SQ200680052630
公開日2009年2月18日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者飚 何, 藤井直明, 亮 尤, 徐志東, D·M·雅布隆斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)