用于篩選抗癌癥醫(yī)藥組合物的多肽分子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供至少一種多肽分子，用于檢測(cè)樣品中三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w的含量，進(jìn)而篩選出富含三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w的樣品，作為毒殺抗藥性癌細(xì)胞的抗癌癥醫(yī)藥組合物。
【專利說(shuō)明】用于篩選抗癌癥醫(yī)藥組合物的多化分子及其應(yīng)用 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于篩選癌癥醫(yī)藥組合物的多膚分子及其應(yīng)用，特別是涉及一 種用于篩選H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)的多膚分子及其應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 化學(xué)治療煙lemotherapy)是中晚期癌癥的主要治療方法。一般而言，癌癥病人在 經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的化學(xué)治療后，雖然大多數(shù)的癌細(xì)胞都會(huì)死亡，但仍有少數(shù)未被成功毒殺的 癌細(xì)胞會(huì)留存在體內(nèi)，數(shù)量約在1〇 8?1〇9之間。該些留存的癌細(xì)胞會(huì)表達(dá)大量的H磯酸 腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋTP binding-cassette transporter, W下簡(jiǎn)稱ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝?，并?ABC運(yùn)輸?shù)鞍走\(yùn)送到細(xì)胞膜上，W執(zhí)行排除細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療藥物的工作。亦即，留存的癌細(xì) 胞會(huì)利用ABC運(yùn)輸?shù)鞍讓┘?xì)胞內(nèi)的化學(xué)治療藥物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外，從而使化學(xué)治療藥物不 再能有效攻擊該些留存的癌細(xì)胞。此即臨床上所謂的癌細(xì)胞抗藥性，亟待找尋化學(xué)治療W 外的方法毒殺該些具有抗藥性的癌細(xì)胞。
[0003] 文獻(xiàn) Sarkadi B, Homolya L, Szakdcs G, Vdradi A. Human multidrug resistance ABCB and ABCG transporters:participation in a chemoimmunity defense system. Physiol 民ev. 2006, 86 (4) : 1179-1236中提及與癌細(xì)胞抗藥性有關(guān)的ABC運(yùn)輸?shù)鞍?，主要包括下列?家族（subfamily):
[0004] S鱗酸腺昔結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍讈喖易?B(ATP-binding cassette protein subfamily B) :例如ABCBl，又稱為多重抗藥性蛋白1 (multi drug resistance proteinl，簡(jiǎn)稱MDRl)，亦 稱為P酷蛋白（permeability glycoprotein);又例如ABCB4(又稱為MDR3);另外還有例如 ABCB11，是 Pgp 的同系家族（Sister of Pgp)。
[0005] S鱗酸腺昔結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍讈喖易?C(ATP-binding cassette protein subfamily C) :例如 ABCCl，又稱為多重抗藥性相關(guān)蛋白 1 (multi drug resistance related proteinl， 簡(jiǎn)稱MRP]_);又例如ABCC2,又稱為多重抗藥性相關(guān)蛋白2 (multi drug resistance related protein2,簡(jiǎn)稱 MRP2);可能還包括 ABCC3 -6、ABCC10 - 11。
[0006] S鱗酸腺昔結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍讈喖易?G(ATP-binding cassette protein subfamily G):例如ABCG2,又稱為雙層恩抗藥性蛋白（mitoxantrone resistance protein,簡(jiǎn)稱MXR)， 亦稱為乳癌抗藥性蛋白化reast cancer resistance protein,簡(jiǎn)稱BCRP)。
[0007] 美國(guó)專利US7785812揭露一種毒殺抗藥性癌細(xì)胞的方法，其利用表達(dá)在抗藥性 癌細(xì)胞表面的大量ABC運(yùn)輸?shù)鞍走M(jìn)行標(biāo)靴攻擊。其W人為方式制造ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w (anti-ATP binding-cassette transporter antibody)，且利用該 ABC 運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w攜帶足 W毒殺細(xì)胞么藥物，形成一抗體標(biāo)靴藥物。則，該抗體標(biāo)靴藥物藉由ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w而結(jié) 合在抗藥性癌細(xì)胞上，并W其所攜帶的藥物在抗藥性癌細(xì)胞周圍進(jìn)行毒殺作用。
[000引然而，無(wú)論是直接制備ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w或是先制備ABC運(yùn)輸?shù)鞍缀笤儆肳篩選 ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w，其中制備ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w/ABC運(yùn)輸?shù)鞍椎倪^(guò)程都必需考慮其是否能 被折疊成正確構(gòu)形，制備過(guò)程中要考慮的因素既困難又復(fù)雜，使成本難w降低。此外，依現(xiàn) 有技術(shù)所制備的ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w，僅能辨識(shí)一種ABC運(yùn)輸?shù)鞍?，難W適用于所有種類的抗 藥性癌細(xì)胞。再者，現(xiàn)有技術(shù)利用藥物對(duì)抗藥性癌細(xì)胞進(jìn)行毒殺，長(zhǎng)期下來(lái)，將對(duì)身體及腎 臟造成不小的負(fù)擔(dān)。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0009] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種制備簡(jiǎn)單的多膚分子，W取代結(jié)構(gòu)復(fù)雜的 ABC運(yùn)輸?shù)鞍?，作為篩選ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w的主要依據(jù)。
[0010] 另外，本發(fā)明提供多種多膚分子及其組合，使能篩選出含有多種ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓?體的醫(yī)藥組合物，從而能適用于各種不同種類的抗藥性癌細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明亦提供一種對(duì)身體及腎臟負(fù)擔(dān)較小的癌癥醫(yī)藥組合物，W對(duì)抗抗藥性癌細(xì) 胞。
[0012] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種多膚分子，該多膚分子的氨基酸序列如 下：
[0013] 包含 SEQ ID NO ;1 序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序列、 SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列W及SEQ ID NO ;7序列中之一者或其組合；或
[0014] 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后之一衍生 序列；其中，包含該衍生序列之一衍生多膚分子可與至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍?之抗體（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結(jié)合。
[0015] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該衍生多膚分子與該至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍?之抗體間的結(jié)合力，大于磯酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,簡(jiǎn)稱PBS ;抑7. 4)與 該至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w間的結(jié)合力。
[0016] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該可被結(jié)合之至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w 系一引發(fā)癌癥化學(xué)治療抗藥性之H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w。
[0017] 本發(fā)明亦提供一種多膚分子之用途，其系用于篩選出一癌癥醫(yī)藥組合物，其中該 多膚分子之氨基酸序列如下：
[0018] 包含 SEQ ID NO ;1 序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序列、 SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之一者或其組合；或
[0019] 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后之一衍生 序列；其中，包含該衍生序列之一衍生多膚分子可與至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍?之抗體（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結(jié)合。
[0020] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該被篩選之癌癥醫(yī)藥組合物系分離自人體之一血液、一血 漿、或一血清中之至少一者。
[0021] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，系用于篩選出含有至少一種引發(fā)癌癥化學(xué)治療抗藥性之H 磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w之一癌癥醫(yī)藥組合物。
[0022] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該被篩選出之該癌癥醫(yī)藥組合物，系可引發(fā)一免疫 細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用（antibody-dependent cell-mediated c}ftotoxicity)者，W攻擊一癌細(xì)胞。
[0023] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該被篩選之該癌癥醫(yī)藥組合物，系可引發(fā)一自然殺手細(xì)胞 (化化ral killer cells)之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用者，W攻擊具有化學(xué)治療 藥物抗藥性之一癌細(xì)胞。
[0024]本發(fā)明另外提供一種分離（或純化）之抗體或人工生產(chǎn)之抗體，可與如下所述之 多膚分子結(jié)合：
[00巧]包含 SEQ ID NO ;1 序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序列、 SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之一者或其組合之多膚分子； 或
[0026] 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后所衍生 之一衍生多膚分子，且該衍生多膚分子可與至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w (anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結(jié)合D
[0027] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，系可引發(fā)一免疫細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作 用者。
[0028] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，系可引發(fā)一自然殺手細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 殺作用。
[0029] 本發(fā)明更提供一種癌癥藥物或癌癥醫(yī)藥組合物，包含至少一種上述之分離之抗體 或人工生產(chǎn)之抗體。
[0030] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種檢測(cè)方法，系W-多膚分子作為一探 針，檢測(cè)一樣品中之H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)含量，其中該多膚分子之氨基酸序列如下：
[0031] 包含 SEQ ID NO ;1 序列、SEQ ID NO ;2 序列、SEQ ID NO ;3 序列、SEQ ID NO ;4 序列、 SEQ ID NO ;5序列、SEQ ID NO ;6序列、W及SEQ ID NO ;7序列中之一者或其組合；或
[0032] 包含將界定于（a)之氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后之 一衍生序列；其中，包含該衍生序列之一衍生多膚分子可與至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn) 輸?shù)鞍字贵w（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結(jié)合。
[0033] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，系利用酵素免疫吸附法、西方墨點(diǎn)法、生物芯片法、磁珠分 離暨定量方式、W及其它探針檢測(cè)方式之至少一者，檢測(cè)該樣本中之H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn) 輸?shù)鞍字贵w含量。
[0034] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，其至少包括下列步驟：
[00巧]涂覆（coating)該多膚分子至一容器中；
[0036] 去除該容器中之一第一息浮液；
[0037] 置入該樣品之一適當(dāng)濃度樣本至該容器中；
[0038] 去除該容器中之一第二息浮液；
[0039] 置入一第二抗體；
[0040] 去除該容器中之一第H息浮液；W及
[0041] 檢測(cè)該容器中之該第二抗體之含量。
[0042] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該容器系96孔盤(pán)。
[0043] 在一個(gè)較佳實(shí)施例中，該樣品系分離自人體之一血液、一血漿或一血清中之至少 一者。 【【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】】
[0044] 圖1 ;系一方塊流程圖，表示出本案檢測(cè)ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w含量之一方法實(shí)施例。
[0045] 圖2 ;系一方塊流程圖，表示出利用本案多膚分子純化ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w之一方法 實(shí)施例。 【【具體實(shí)施方式】】
[0046] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的限制及缺陷，本發(fā)明提供至少一種篩選癌癥醫(yī)藥組合物之多膚分 子及其應(yīng)用方法，系W構(gòu)形簡(jiǎn)單的多膚分子篩選富含抗體的醫(yī)藥組合物，并透過(guò)人體固有 之機(jī)制毒殺具有抗藥性之癌細(xì)胞。
[0047] 已知自然殺手細(xì)胞（化化ral killer cells ;通常被定義為CD3-CD56+亞群的淋己 細(xì)胞）在人類免疫系統(tǒng)上扮演對(duì)抗癌細(xì)胞的重要角色，主要系通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的 細(xì)胞毒殺作用（antibody-dependent cell-mediated c}ftotoxicity，簡(jiǎn)稱 ADCC)殺死癌細(xì) 胞。詳言之，當(dāng)癌細(xì)胞表達(dá)ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄒ蚨哂锌顾幮裕?，而被身體內(nèi)或外來(lái)的ABC運(yùn) 輸?shù)鞍卓贵w結(jié)合時(shí)，自然殺手細(xì)胞表面的CD16分子【化濁III ;系抗體固定區(qū)（化agment of constant region)之受體，會(huì)專一性結(jié)合于所有人類抗體之固定區(qū)】會(huì)辨識(shí)并結(jié)合至該ABC 運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w的固定區(qū)（例如IgG抗體的固定區(qū)），繼而引發(fā)自然殺手細(xì)胞之抗體依賴性細(xì) 胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用（ADCC作用），亦即，釋放丙型干擾素（IFN-Y )等細(xì)胞因子而毒殺該 抗藥性癌細(xì)胞。
[0048] 依發(fā)明人多年之經(jīng)驗(yàn)及研究結(jié)果，認(rèn)為應(yīng)能揃取現(xiàn)有技術(shù)W ABC運(yùn)輸?shù)鞍诪闃?biāo)祀 之優(yōu)點(diǎn)，去除需制備構(gòu)形復(fù)雜之抗體/蛋白質(zhì)W及利用藥物毒殺之兩種缺點(diǎn)，發(fā)展出一種 更簡(jiǎn)便、對(duì)身體負(fù)擔(dān)較小之毒殺癌細(xì)胞方法。亦即，研發(fā)一種線性多膚抗原，W篩選含有多 種ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w之醫(yī)藥組合物，并透過(guò)人體自然殺手細(xì)胞之自然機(jī)制攻擊抗藥性癌細(xì) 胞，W解決現(xiàn)有技術(shù)之各種問(wèn)題。
[0049] W下提供利用本發(fā)明之實(shí)施例之詳細(xì)說(shuō)明書(shū)，W及本發(fā)明之技術(shù)及特點(diǎn)。然本實(shí) 施例并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可作各 種之更動(dòng)與潤(rùn)飾。
[0050] 實(shí)施例一；ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子的設(shè)計(jì)
[0051] 利用生物信息學(xué)方法，從各種ABC運(yùn)輸?shù)鞍祝ㄏ的芤l(fā)化學(xué)治療抗藥性之該些ABC 運(yùn)輸?shù)鞍祝┬蛄兄?，找尋與人類白血球抗原化uman leukocyte antigen,簡(jiǎn)稱HLA ;即人類 之Major histocompatibility complex,簡(jiǎn)稱MHC)有較高親和力的序列位置。W此方法找 出的線性多膚序列較可能剛好位于ABC運(yùn)輸?shù)鞍妆砻?，而能取代ABC運(yùn)輸?shù)鞍?，專一性地與 ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w結(jié)合。
[005引經(jīng)過(guò)一系列的設(shè)計(jì)改良及實(shí)驗(yàn)篩選，研發(fā)出7種ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子（多 膚分子一般由20?50個(gè)氨基酸組成，但不W此為限），即SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3、沈Q ID NO ;4、沈Q ID NO ;5、沈Q ID NO ;6、W 及沈Q ID NO ;7。此 7 種 ABC 運(yùn)輸 蛋白線性多膚分子之其中一種或其組合，可與至少一種ABC運(yùn)輸?shù)鞍字贵w（anti-ATP binding-cassette transporter antibody)結(jié)合，而能篩選出癌癥醫(yī)藥組合物。尤其，此7 種ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子之其中一種或其組合，可與至少一種引發(fā)癌癥化學(xué)治療抗藥 性之ABC運(yùn)輸?shù)鞍字贵w結(jié)合，W篩選出能對(duì)抗抗藥性癌細(xì)胞之癌癥醫(yī)藥組合物。
[0053] 其中，該些ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子與該至少一種ABC運(yùn)輸?shù)鞍字贵w間的結(jié) 合力，大于磯酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline,簡(jiǎn)稱PBS ;抑7. 4)與該至少一種ABC 運(yùn)輸?shù)鞍字贵w間的結(jié)合力。
[0054] 實(shí)施例二；制備ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子
[00巧]W化學(xué)法合成該些ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子，純度須大于95%。可委巧勝膚 合成服務(wù)公司合成該些ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子。 申請(qǐng)人:系委巧明欣生物科技有限公 司（地址：臺(tái)北市南港區(qū)園區(qū)街3號(hào)10樓之1 ;電話；02-26557128 ;網(wǎng)址；http://www. missionbio. com. tw/)制備該7種ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子。
[0056] 將合成的ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子溶于67%的己酸中巧mg線性多膚分子/I血 之67%己酸），于-2(TC之低溫冰箱中保存。
[0057] 實(shí)施例H ;篩選癌癥醫(yī)藥組合物
[0058] 將上述7種ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子之至少一種與樣品（例如分離自人體之 一血液、一血漿、或一血清中之至少一者）混合，檢測(cè)樣品中ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子暨 ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w復(fù)合物（W下簡(jiǎn)稱多膚分子暨抗體復(fù)合物）之含量。多膚分子暨抗體 復(fù)合物含量較多者，代表原樣品中含有大量引發(fā)癌癥化學(xué)治療抗藥性之ABC運(yùn)輸?shù)鞍字?體，可作為癌癥醫(yī)藥組合物，W引發(fā)自然殺手細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用 (antibody-cbpendent cell-mediated 巧totoxicity)，殺死表現(xiàn) ABC 運(yùn)輸?shù)鞍字顾幮园?細(xì)胞。
[0059] 其中，可利用酵素免疫吸附法巧nzyme-linked immunosorbent assay,簡(jiǎn)稱EILISA) 或其它利用多膚分子為探針之檢測(cè)方式（例如西方墨點(diǎn)法、生物芯片法、磁珠分離暨定量 方式），檢測(cè)樣品中ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w之含量，W篩選適合作為癌癥醫(yī)藥組合物之樣品，尤 指W篩選含有至少一種引發(fā)癌癥化學(xué)治療抗藥性之ABC運(yùn)輸?shù)鞍字贵w的一種癌癥醫(yī)藥 組合物。W下W酵素免疫吸附法為例進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明：
[0060] 請(qǐng)參閱圖1，其系一方塊流程圖，表示出本案檢測(cè)ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w含量之一方法 實(shí)施例。本發(fā)明一種檢測(cè)ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w含量的較佳實(shí)施方法至少包括：
[006。 步驟S1 ;涂覆（coating)多膚分子至一容器中；
[0062] 步驟S2 ;去除該容器中之一第一息浮液；
[0063] 步驟S3 ;置入一樣品之一適當(dāng)濃度樣本至該容器中；
[0064] 步驟S4 ;去除該容器中的一第二息浮液；
[0065] 步驟S5 ;置入一第二抗體；
[006引步驟S6 ;去除該容器中的一第立息浮液；W及 [0067] 步驟S7 ;檢測(cè)該容器中之該第二抗體之含量。
[006引較佳者，步驟S1中之該容器，系96孔盤(pán)，但不W此為限。W 96孔盤(pán)為例，步驟S1 系在96孔盤(pán)的一第一孔及一第二孔中，加入100 y L之ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子，并在96 孔盤(pán)的一第H孔及一第四孔中，加入100 y L之植物性蛋白多膚分子，4C涂覆（coating) 8 小時(shí)（或 overnight)。
[0069] 其中，該ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子及該植物性蛋白多膚分子已先W磯酸鹽緩沖 液（Phosphate Buffered Saline,簡(jiǎn)稱 PBS ;抑7. 4)稀釋至 5 ?20 y g/mL。且該 ABC 運(yùn)輸?shù)?白線性多膚分子系 SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3、SEQ ID NO ;4、SEQ ID NO ;5、SEQ ID NO ;6、W及SEQ ID NO ;7中之至少一者或其組合。
[0070] W涂覆ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子之該第一孔為實(shí)驗(yàn)組，涂覆植物性多膚分子之 該第H孔為對(duì)照組，涂覆ABC運(yùn)輸?shù)鞍拙€性多膚分子之該第二孔為第一空白對(duì)照組，涂覆 植物性多膚分子之該第四孔為第二空白對(duì)照組。
[0071] 再則，步驟S2系去除該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第一息浮液。較佳者， 去除第一息浮液后，再W磯酸鹽緩沖液（PH7. 4)清洗H次。
[0072] 此外，步驟S3中之該樣品系分離自人體之一血漿（或一血液、一血清，但不W此 為限）。該適當(dāng)濃度樣本系該血漿（或該血液、該血清，但不W此為限）經(jīng)磯酸鹽緩沖液 (抑7. 4)稀釋100?200倍后所制成。步驟S3中，系于該第一孔及該第H孔中加入100 uL 該適當(dāng)濃度樣本，該第二孔及該第四孔中則加入100 y L磯酸鹽緩沖液（pH7. 4)，并于適當(dāng) 溫度下作用一段時(shí)間。較佳者，于室溫作用2小時(shí)。
[0073] 步驟S4系去除該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第二息浮液。較佳者，去除 第二息浮液后，再W磯酸鹽緩沖液（PH7. 4)清洗H次。
[0074] 步驟S5中的該第二抗體系可與人類ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w專一性結(jié)合之抗體，例如兔 抗人免疫球蛋白 G 抗體（Anti-Human 1肖6(化 specific) antibody produced in r油bit)或山 羊抗人免疫球蛋白 G 抗體（Anti-Human 1肖6(化 specific) antibody produced in goat)。步 驟S5中，系加入例如200 uL適當(dāng)濃度之該第二抗體（例如W磯酸鹽緩沖液（PH7. 4)稀釋 10000倍），并于適當(dāng)溫度下作用一段時(shí)間。較佳者，于室溫作用2小時(shí)。
[00巧]步驟S6系去除該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中之第H息浮液。較佳者，去除 第H息浮液后，再W磯酸鹽緩沖液（PH7. 4)清洗H次至五次。
[0076] 步驟S7之檢測(cè)原理，系利用該第二抗體攜帶的一酵素，將一化合物轉(zhuǎn)換為一 呈色化合物，則該第二抗體之含量與該酵素的量及呈色深淺呈正比，可藉由檢測(cè)顏色深 淺而回推該第二抗體之含量。較佳者，該第二抗體攜帶的該酵素，可將四甲基聯(lián)苯胺 (Tetramethy化enzidine，簡(jiǎn)稱TMB)轉(zhuǎn)換為藍(lán)色產(chǎn)物。抑或是，步驟S7之檢測(cè)原理，系利用 該第二抗體攜帶的一英光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，藉由檢測(cè)英光強(qiáng)度而回推該第二抗體的含量。
[0077] 于該第二抗體攜帶的酵素能將TMB轉(zhuǎn)換為藍(lán)色產(chǎn)物的實(shí)施例中，步驟S7之具體步 驟系于該第一孔、第二孔、第H孔、第四孔中加入100 y L TMB，反應(yīng)20分鐘，再加入50 y L2M H2SO4終止反應(yīng)。W 450nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，630nm為參考波長(zhǎng)，測(cè)定吸光值（0D值），并計(jì)算特 異性結(jié)合指數(shù)（specific binding index,簡(jiǎn)稱 SBI):
[0078] SBI =(實(shí)驗(yàn)組之吸光值一第一空白對(duì)照組之吸光值）/(對(duì)照組之吸光值一第二 空白對(duì)照組之吸光值）
[0079] W SBI作為篩選樣品（例如分離自人體之一血液、一血漿、或一血清之至少一者， 但不W此為限）之參考數(shù)值，凡是比值大于1. 5者，可作為治療癌癥的醫(yī)藥組合物，用于引 導(dǎo)自然殺手細(xì)胞之「抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用（即ADCC作用）」。
[0080] 為充分掲露利用本醫(yī)藥組合物之方法，依本發(fā)明人多年的經(jīng)驗(yàn)及發(fā)明研究結(jié)果可 知，該醫(yī)藥組合物之劑量及方法為；每次化學(xué)療程可輸入150?300mL該醫(yī)藥組合物一次。
[0081] 實(shí)施例四；純化ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w
[0082] 請(qǐng)參閱圖2,其系一方塊流程圖，表示出利用本案多膚分子純化ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w 之一方法實(shí)施例。
[0083] 步驟Sll ;制備帶有一多膚分子之一磁珠，形成一磁珠多膚分子；
[0084] 步驟S12 ;混合該磁珠多膚分子與一樣品，而得一混合液；
[0085] 步驟S13 ;將該混合液通過(guò)受有一磁力之一管柱（column);
[0086] 步驟S14 ;將一緩沖液注入該管柱中，W分離一磁珠多膚分子暨抗體復(fù)合物中的 該磁珠多膚分子及一 ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w。
[0087] 其中，步驟 S11 中之該多膚分子系 SEQ IDN0 ;1、SEQ IDN0 ;2、SEQ IDN0 ;3、SEQ ID NO ;4、SEQ ID NO ;5、SEQ ID NO ;6、W及SEQ ID NO ;7中之至少一者。步驟Sll可委巧磁珠廠 商代為執(zhí)行，例如委巧臺(tái)灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司（地址：桃園縣桃園市龍壽街81巷 12 弄 2 號(hào)；電話；03-3607555 ;網(wǎng)址；http://www. tanbead. com/)代為執(zhí)行。
[0088] 步驟S12中，該混合液中帶有一磁珠多膚分子暨抗體復(fù)合物。
[0089] 執(zhí)行步驟S13之過(guò)程中，該混合液中的該磁珠多膚分子暨抗體復(fù)合物會(huì)受磁力影 響而吸附在該管柱上。
[0090] 步驟S14中，該緩沖液應(yīng)選用能打斷該磁珠多膚分子與該ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w之連 結(jié)關(guān)系者。若步驟S11是委巧磁珠廠商進(jìn)行，則該廠商會(huì)一并提供合適的緩沖液。
[0091] W此方式純化之ABC運(yùn)輸?shù)鞍卓贵w，可引發(fā)自然殺手細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo) 的細(xì)胞毒殺作用，且可進(jìn)一步用于制備癌癥藥物或制備癌癥醫(yī)藥組合物。
[0092] 本案提供之一種用于篩選抗癌癥醫(yī)藥組合物之多膚分子即SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、沈Q ID NO ;3、沈Q ID NO ;4、沈Q ID NO ;5、沈Q ID NO ;6、W及沈Q ID NO ;7 中之至少一 者，亦或是，一種由20?50個(gè)氨基酸組成之多膚分子，其序列包含SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO : 2、SEQ ID NO ;3、SEQ ID NO ;4、SEQ ID NO ;5、SEQ ID NO ;6、W及沈Q ID NO ;7 中之至少一者。
[0093] 應(yīng)能理解的是，一種衍生多膚分子，系將界定于SEQ ID NO ;1、SEQ ID NO ;2、SEQ ID NO ;3、SEQ ID NO ;4、SEQ ID NO ;5、SEQ ID NO ;6、W及 SEQ ID NO ;7 中之序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè) 氨基酸之取代、刪除或添加后所衍生，且能與至少一種H磯酸腺巧結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w 結(jié)合者，亦應(yīng)包含于本案之申請(qǐng)專利范圍內(nèi)。
[0094] W上所述僅為本發(fā)明之較佳實(shí)施例，并非用W限定本發(fā)明之申請(qǐng)專利范圍，因此 凡其它未脫離本發(fā)明所掲示之精神下所完成之各種更動(dòng)或潤(rùn)飾等，均應(yīng)包含于本案之申請(qǐng) 專利范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種多肽分子，其氨基酸序列如下： (a) 包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、 SEQ ID NO :5序列、SEQ ID NO :6序列以及SEQ ID NO :7序列中之一者或其組合；或 (b) 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后之一衍生 序列；其中，包含該衍生序列之一衍生多肽分子可與至少一種三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍?之抗體結(jié)合。
2. 如權(quán)利要求1所述的多肽分子，其中該衍生多肽分子與該至少一種三磷酸腺苷結(jié)合 盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w間的結(jié)合力，大于PH7. 4的磷酸鹽緩沖液與該至少一種三磷酸腺苷結(jié)合 盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w間的結(jié)合力。
3. 如權(quán)利要求1所述的多肽分子，其中該可被結(jié)合之至少一種三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸 蛋白之抗體是一引發(fā)癌癥化學(xué)治療抗藥性之三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w。
4. 一種多肽分子的用途，其用于篩選出一癌癥醫(yī)藥組合物，其中該多肽分子之氨基酸 序列如下： (a) 包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、 SEQ ID NO :5序列、SEQ ID NO :6序列以及SEQ ID NO :7序列中之一者或其組合；或 (b) 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后之一衍生 序列；其中，包含該衍生序列之一衍生多肽分子可與至少一種三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍?之抗體結(jié)合。
5. 如權(quán)利要求4所述的多肽分子的用途，其中該被篩選之癌癥醫(yī)藥組合物是分離自人 體的血液、血漿和血清中至少一者。
6. 如權(quán)利要求4所述的多肽分子的用途，其用于篩選出含有至少一種引發(fā)癌癥化學(xué)治 療抗藥性之三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w之一癌癥醫(yī)藥組合物。
7. 如權(quán)利要求6所述的多肽分子的用途，其中被篩選出之該癌癥醫(yī)藥組合物，可引發(fā) 一免疫細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用，以攻擊一癌細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求6所述的多肽分子的用途，其中被篩選之該癌癥醫(yī)藥組合物，可引發(fā)一 自然殺手細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用，以攻擊具有化學(xué)治療藥物抗藥性之 一癌細(xì)胞。
9. 一種分離或純化的抗體或人工生產(chǎn)之抗體，可與如下所述之多肽分子結(jié)合： (a) 包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、 SEQ IDN0 :5序列、SEQ IDN0 :6序列、以及SEQ IDN0 :7序列中之一者或其組合之多肽分子； 或 (b) 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后所衍生之 一衍生多肽分子，且該衍生多肽分子可與至少一種三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w結(jié) 合。
10. 如權(quán)利要求9所述的分離或純化之抗體或人工產(chǎn)生之抗體，其可引發(fā)一免疫細(xì)胞 之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用。
11. 如權(quán)利要求10所述的分離或純化之抗體或人工產(chǎn)生之抗體，其可引發(fā)一自然殺手 細(xì)胞之抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒殺作用。
12. -種癌癥藥物或癌癥醫(yī)藥組合物，包含至少一種如權(quán)利要求9所述之分離的抗體 或人工生產(chǎn)之抗體。
13. -種檢測(cè)方法，其以一多肽分子作為一探針，檢測(cè)一樣品中之三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn) 輸?shù)鞍字贵w含量，其中該多肽分子之氨基酸序列如下： (a) 包含 SEQ ID NO :1 序列、SEQ ID NO :2 序列、SEQ ID NO :3 序列、SEQ ID NO :4 序列、 SEQ ID NO :5序列、SEQ ID NO :6序列、以及SEQ ID NO :7序列中之一者或其組合；或 (b) 包含將（a)的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸之取代、刪除或添加后之一衍生 序列；其中，包含該衍生序列之一衍生多肽分子可與至少一種三磷酸腺苷結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍?之抗體結(jié)合。
14. 如權(quán)利要求13所述的檢測(cè)方法，其利用酵素免疫吸附法、西方墨點(diǎn)法、生物芯片 法、磁珠分離暨定量方式以及其它探針檢測(cè)方式之至少一者，檢測(cè)該樣本中之三磷酸腺苷 結(jié)合盒運(yùn)輸?shù)鞍字贵w含量。
15. 如權(quán)利要求13所述的檢測(cè)方法，其至少包括下列步驟： (a) 涂覆該多肽分子至一容器中； (b) 去除該容器中的第一懸浮液； (c) 置入一樣品之一適當(dāng)濃度樣本至該容器中； (d) 去除該容器中的第二懸浮液； (e) 置入一第二抗體； (f) 去除該容器中的第三懸浮液；以及 (g) 檢測(cè)該容器中之該第二抗體之含量。
16. 如權(quán)利要求15所述的檢測(cè)方法，其中該容器是96孔盤(pán)。
17. 如權(quán)利要求13所述的檢測(cè)方法，其中該樣品是分離自人體的血液、血漿和血清中 之至少一者。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104513303SQ201410298474
【公開(kāi)日】2015年4月15日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月27日
【發(fā)明者】李光輝 申請(qǐng)人:李光輝