專利名稱：核酸分子cryl1si2及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號〃殺手〃，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。幾年來， 國外醫(yī)學(xué)界對于腫瘤疾病的發(fā)病機(jī)理在細(xì)胞基礎(chǔ)上又有了新的認(rèn)識?；趯δ[瘤發(fā) 病機(jī)制的進(jìn)一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發(fā)能夠特異，有效地殺傷腫瘤細(xì) 胞而對正常細(xì)胞無毒性的藥物。目前，對于癌癥的治療仍以化療及放療為首選，兩 者雖對腫瘤的治療取得了相當(dāng)?shù)寞熜?，但由于缺乏對腫瘤細(xì)胞的特異性因而具有較大 的毒副作用以及某些腫瘤細(xì)胞對化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了 它們在臨床中的應(yīng)用。近年來，為了開發(fā)出能特異性地殺傷癌細(xì)胞而對正常細(xì)胞無 毒負(fù)作用的藥物，人們對癌癥的發(fā)病機(jī)制從細(xì)胞，分子水平上的研究予以高度重視和 巨額投資。藥物耐受(drug resistance)是腫瘤治療過程中的一個難題。腫瘤細(xì)胞對藥物 的耐受性不僅使得抗癌藥物達(dá)不到治療的目的，同時還會產(chǎn)生副作用，讓正常細(xì)胞更 容易受到藥物的損傷，直接危害到病人的生命。因此，尋找能夠降低抗藥性的化合物 一種是腫瘤研究領(lǐng)域的熱點之一。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子。 本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋 亡的活性并且其序列包括 5' -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3， 或者 5， -CCATGCATCTCAATGCAGA -3'。在本發(fā)明中被稱為CRYL1SI2。其中，A、 T、 U、 G和C分別是腺嘌呤核苷酸、胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、 鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子CRYL1SI2 "該術(shù)語還包括 5' -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3'或者5， - CCATGCATCTCAATGCAGA -3'的核苷酸序列 變異形式。這些變異形式包括若干個(通常為l-15個，較佳地1-10個，更佳地1-5 個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為IO個以 內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在5' -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3，后(3 '端) 加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的序列。本發(fā)明中，CRYL1SI2可以是具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性并且包括 5' -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3' dTdT的序列。本發(fā)明中，CRYL1SI2可以是具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性并且是 5， -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3， dTdT的序列。本發(fā)明中，CRYL1SI2可以是具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性并且是5' -CCATGCATCTCAATGCAGA -3' 的序列。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，與CRYL1SI2連接 成為重組載體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達(dá)系統(tǒng)(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒 (human immunod efficiency virus, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分裂耙 細(xì)胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌 細(xì)胞和干細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂細(xì)胞能力，因而，慢病毒載體已作為基因轉(zhuǎn)移的有 效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子CRYL1SI2的制備方法，即按 CRYL1SI2的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。本發(fā)明的核苷酸分子CRYL1SI2可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的核 苷酸分子CRYL1SI2序列通?？梢杂妹附夥ɑ蛉斯ず铣傻姆椒ǐ@得。本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子CRYL1SI2在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 上述的核苷酸分子CRYL1SI2可以與柔紅霉素聯(lián)用，應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。 本發(fā)明的CRYL1SI2顯著促進(jìn)了 H印3B細(xì)胞在柔紅霉素作用條件下凋亡的發(fā)生， 將CRYL1SI2與柔紅霉素聯(lián)用，可以大大降低腫瘤細(xì)胞對柔紅霉素的抗藥性。本發(fā)明的核苷酸分子CRYL1SI2及其類似物，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時，可 提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性 載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物 質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行 給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的核苷酸分子CRYL1SI2為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體 聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這 類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥 物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子CRYL1SI2可以被制成針劑形式， 例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑 和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片 劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約l微克 /千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的CRYL1SI2還可與其他治療劑一起 使用。當(dāng)本發(fā)明的核苷酸分子CRYL1SI2被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施 用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情 況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體 重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技 能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量的核苷酸分子CRYL1SI2和藥學(xué) 上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有 效治療量可以為每天l微克/千克至10毫克/千克體重。所述藥物可以是針劑、粉劑 或者片劑。柔紅霉素(daunorubicin)，自被開發(fā)以來一直被臨床上廣泛和有效的用于對 白血病，乳腺癌，惡性淋巴瘤，軟組織瘤等腫瘤疾病的治療當(dāng)中。但是耐藥性比較高。本發(fā)明給腫瘤細(xì)胞加藥時，柔紅霉素終濃度為0.4 tM。本發(fā)明的CRYL1SI2顯著促進(jìn)了 H印3B細(xì)胞在柔紅霉素作用條件下凋亡的發(fā)生， 將CRYL1SI2與柔紅霉素聯(lián)用，可以大大降低腫瘤細(xì)胞對柔紅霉素的抗藥性，因此， 本發(fā)明為腫瘤的治療提供了一種新的途徑和方法。
具體實施方式
CRYL1SI2對細(xì)胞周期的影響采用上海吉凱基因技術(shù)有限公司的GeneChem Easy-siRNA合成的CRYL1SI2。 用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染siRNA的實驗操作步驟(1) 細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于24孔板，所加培養(yǎng)基體積為500ul。轉(zhuǎn)染時細(xì)胞 融合率應(yīng)為40%-50%.(2) 配制工作母液2. 5訓(xùn)1 (l.OOD)的雙鏈siRNA中加入125ul lXUniversal Buffer,得到濃度為20uM的siRNA母液。(3) 以下稀釋步驟(4和5)中可以用不含血清的Opti-MEM(Invitrogen)，也可以用其他不含血清的培養(yǎng)基。(4) 對于24孔板的每個孔，用O. 84ug siRNA雙鏈。把3ul20uM的siRNA雙鏈 與50ulOpti-MEM混合。(5) 將Lipofectamine 2000試劑盒輕柔搖勻，取lul Lipofectamine 2000試 劑在另一管中與50ul Opti-MEM混合，室溫下孵育5分鐘。(6) 把稀釋后的siRNA與稀釋后的Lipofectamine 2000進(jìn)行混合，輕輕混勻。 室溫下溫育20分鐘。(7) 把siRNA與Lipofectamine 2000的混合液加入培養(yǎng)細(xì)胞，輕輕混勻然后將 細(xì)胞放入培養(yǎng)箱。(8) 轉(zhuǎn)染24小時后的細(xì)胞或不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用柔紅霉素刺激細(xì)胞規(guī)定時間 后用胰酶消化細(xì)胞，收獲細(xì)胞于流式細(xì)胞儀樣品管中。(9) PBS清洗卜2次，室溫離心(1000rpm， 5min),棄上清。(10) 加入PI (終濃度為50ug/ml)，室溫暗處反應(yīng)3min后，流式細(xì)胞儀檢測。 結(jié)果表明，CRYL1SI2顯著促進(jìn)了H印3B細(xì)胞在柔紅霉素作用條件下發(fā)生凋亡。
權(quán)利要求
1.一種核苷酸分子，其特征在于，它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性并且其序列包括5’-CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3’或者5’-CCATGCATCTCAATGCAGA-3’。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 凋亡的活性并且其序列包括5' -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3， dTdT。
3. 如權(quán)利要求l所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 凋亡的活性并且其序列是5， -CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3' dTdT。
4. 如權(quán)利要求1所述的一種核苷酸分子，其特征在于，它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 凋亡的活性并且其序列是5， - CCATGCATCTCAATGCAGA -3'。
5. —種如權(quán)利要求1-4中任一種核苷酸分子的制備方法，其特征在于，按權(quán) 利要求1-4中任一種核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團(tuán)或者脫氧核糖核酸基團(tuán) 依次脫水縮合。
6. 如權(quán)利要求1-4中任一種核苷酸分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求1-4中任一種核苷酸分子的應(yīng)用，其特征在于，將該核苷酸分 子與柔紅霉素聯(lián)用，應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性并且其序列包括5′-CCAUGCAUCUCAAUGCAGA-3′或者5′-CCATGCATCTCAATGCAGA-3′。在本發(fā)明中被稱為CRYL1SI2。本發(fā)明的核苷酸分子CRYL1SI2與柔紅霉素聯(lián)用，可以大大降低腫瘤細(xì)胞的抗藥性。
文檔編號C07H21/02GK101225098SQ20081003358
公開日2008年7月23日 申請日期2008年2月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月5日
發(fā)明者龍 余, 琳 張 申請人:復(fù)旦大學(xué)