專利名稱：核酸分子nrn1sr12及其在制備抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備抗腫瘤藥物中 的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤疾病現(xiàn)已上升為世界第2號(hào)〃殺手"，其死亡人數(shù)僅次于心血管病。幾 年來，國(guó)外醫(yī)學(xué)界對(duì)于腫瘤疾病的發(fā)病機(jī)理在細(xì)胞基礎(chǔ)上又有了新的認(rèn)識(shí)?；?于對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步理解，人們利用各種途徑來研制和開發(fā)能夠特異，有 效地殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無毒性的藥物。目前，對(duì)于癌癥的治療仍以化 療及放療為首選，兩者雖對(duì)腫瘤的治療取得了相當(dāng)?shù)寞熜?，但由于缺乏?duì)腫瘤細(xì) 胞的特異性因而具有較大的毒副作用以及某些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療處理的不 敏感，因此在很大程度上限制了它們?cè)谂R床中的應(yīng)用。近年來，為了開發(fā)出能 特異性地殺傷癌細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無毒負(fù)作用的藥物，人們對(duì)癌癥的發(fā)病機(jī)制從 細(xì)胞,分子水平上的研究予以高度重視和巨額投資。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分亍。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述核苷酸分子的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子，它具有抑制腫瘤生 長(zhǎng)的活性并且其序列包括5' - AGAGTTCGAATAAGCTGCC -3， 或者5' -AGAGULJCGAAUAAGCUGCC -3，，在本發(fā)明中被稱為NRN1SR12。
其中，A、 U、 G和C分別是腺嘌呤核苷酸、尿啼啶核苷酸、鳥嘌呤核苷酸和 胞嘧啶核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子NRN1SR12"指具有抑制NRN1蛋白活性、并 且含有與5' - AGAGUUCGAAUMGCUGCC -3，序列高度同源的核酸序列。該術(shù)語還 包括與5， - AGAGUUCGAAUAAGCUGCC-3，的同源性至少70%，較佳地至少80%，更 佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括5' - AGAGUUCGAAUAAGCUGCC -3'的核苷酸序列變異形式。這 些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為l-15個(gè)，較佳地1-10個(gè)，更佳 地1-5個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通 常為10個(gè)以內(nèi)，較佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。例如，在 5' -AGAGUUCGAAUAAGCUGCC-3'后(3 '端)加入若干dT (脫氧胸苷)后形成的 序列。
'在本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括5' -Af}AGTTCGAATAAGCTGCC-3， 或者5， -AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT-3 ，。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括 5' -AGAGUUCGAAUAAGCUGCC-3'。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括 5' -AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT-3'。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以包括5， - AGAGTTCGAATAAGCTGCC-3， 或者5， -AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT-3，。
本發(fā)明中的核苷酸分子，其序列可以是 5， -AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT-3'。
本發(fā)明還提供了一種載體，它含有序列包括5' - AGAGTTCGAATAAGCTGCC-3' 或者5， -AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT-3，的核苷酸分子。
本發(fā)明的上述載體，其序列中可以包括5' -AGAGTTCGAATAAGCTGCC-3，或者 5' - AGAGUUCGAAUAAGCUGCC -3，。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用 市售的載體，然后將含有本發(fā)明NRN1SR12核苷酸序列的 5' -AGAGUUCGAAUAAGCUGCC-3，，可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成重組載 體。例如，可以采用慢病毒、腺病毒或者森林腦炎病毒表達(dá)系統(tǒng)(Semliki Forest Virus)。慢病毒(Lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬，以人類免疫缺陷病毒 (human immunod efficiency virus, HIV)為代表.慢病毒不僅具有感染分 裂靶細(xì)胞并整合其基因組中，尤其是具有感染包括神經(jīng)元細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肝細(xì) 胞、心肌細(xì)胞和干細(xì)胞等在內(nèi)的多種非分裂細(xì)胞能力，因而，慢病毒載體已作為 基因轉(zhuǎn)移的有效工具，被廣泛應(yīng)用于基因功能尤其是基因治療的研究。
如本文所用，"可操作地連于"指這樣一種情況，即線性RNA序列地某些部 分能夠影響同一線性RNA序列其他部分地活性，例如，如果信號(hào)肽RNA作為前體 表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)RNA就是可操作地連于多 肽RNA;如果啟動(dòng)子控制序列地轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯地位置時(shí)，那么它是可操作連于編碼序列。 一般， "可操作連于"意味著相臨近，而對(duì)于本發(fā)明的核酸分子則意味著相鄰且不影響 功能。
本發(fā)明中還提供了一種宿主細(xì)胞，它含有序列包括 5' -AGAGTTCGAATAAGCTGCC-3'或者5' - AGAGUUCGAAUAAGCUGCC -3，的核苷酸分子。
在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細(xì)胞"主要是真核細(xì)胞。常用的有CH0細(xì)胞、C0S-7、 293細(xì)胞，等等。
另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子NRN1SR12的制備方法，即按 NRN1SR12的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。
本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR12可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明 的核苷酸分子NRN1SR12序列通常可以用酶解法或人工合成的方法獲得。
本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子NRN1SR12在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。 體內(nèi)和體外結(jié)果均驗(yàn)證，本發(fā)明的NRN1SR12可明顯削減NRN1的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)證明，NRN1 (NCBI登陸號(hào)NM_016588)可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，因此，削 減NRN1的表達(dá)就意味著抑制腫瘤生長(zhǎng)。
將含有NRN1SR12的細(xì)胞注射裸鼠的腫瘤中，與相同培養(yǎng)條件下不注射 NRN1SR12的裸鼠相比，瘤體的增長(zhǎng)明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時(shí)間的推 移日益明顯。這說明，本發(fā)明的NRN1SR12可以作為腫瘤抑制劑。
所述的腫瘤可以是肝臟、肺或者乳腺部位的良性或者惡性腫瘤。 本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR12及其類似物，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)， 可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受 的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可 隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通 過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或 局部給藥。
以本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR12為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的 載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦 形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR12可以 被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥 物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是 治療有效量，例如每天約l微克/千克體重-約10毫克/千克體重。此外，本發(fā)明 的NRN1SR12還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR12被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多 肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在 大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素， 這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明中，所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療量的核苷酸分子NRN1SR12和 藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片 劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至10亳克/千克體重。
本發(fā)明中，所述藥物可以是針劑、粉劑或者片劑。
本發(fā)明的核苷酸分子NRN1SR12注射入裸鼠的腫瘤中，與相同培養(yǎng)條件下不 注射NRN1SR12的裸鼠相比，瘤體的增長(zhǎng)明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時(shí)間 的推移日益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑和手段。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l NRN1促裸鼠腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
1) 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A^V7的細(xì)胞株b6和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)
2) 用胰酶消化細(xì)胞，離心1000rpmX5rain
3) PBS洗兩遍，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)
4) 用PBS稀釋細(xì)胞懸液至2xl06細(xì)胞/200微升
5) 在裸鼠(上海中國(guó)科學(xué)院藥物所動(dòng)物中心，BALB/c)腋下進(jìn)行皮下接種， 一次注射200ix l細(xì)胞懸液。同一只裸鼠左邊腋下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體的穩(wěn)定細(xì)胞 株Vl,右邊注射穩(wěn)定表達(dá)外源AKW的細(xì)胞株N1。
6) 約2周后，接種的裸鼠長(zhǎng)出細(xì)胞瘤，經(jīng)頸椎處死后取出瘤體，測(cè)量瘤體 長(zhǎng)短徑和重量。
結(jié)果顯示，NRN1組腫瘤生長(zhǎng)明顯快于空載體組，在注射裸鼠兩周后，NRN1 組瘤體體積大于對(duì)照組，三周后出現(xiàn)顯著性差異。這表明過表達(dá)NRN1可以促進(jìn)腫 瘤生長(zhǎng)。實(shí)施例2 內(nèi)源篩選NRN1抑制劑
按照NRN1的序列，設(shè)計(jì)序列為5， -AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT-3'的核 苷酸分子作為NRN1候選抑制劑。稱為NRN1SR12。
1. 種293T細(xì)胞于24孔板中，種板密度2*107孔
2. 于種板后24h (小時(shí))、72h、 120h重復(fù)轉(zhuǎn)染NRN1SR12片段，以O(shè)pti-MEM (Opti-MEM I Reduced Serum Medium, invitrogen公司，31985-070)為溶劑
溶解，使終濃度達(dá)到40nM。轉(zhuǎn)染試劑使用lipofectamin2000 ( 11668-027, invitrogene公司)。
3. 于第一次轉(zhuǎn)染后24h、 72h、 120h消化細(xì)胞，收取72h和120h部分(可 以大概給一個(gè)數(shù)量級(jí)嗎5*104)細(xì)胞樣品。Western檢測(cè)，抗體用Anti-Neuritin (FL-142) (santa cruz公司)AKW內(nèi)源蛋白表達(dá)水平的變化。
結(jié)論與siRNA陰性片段NS (5， -UUCUCCGAACGUCACGUdTdT-3')比較， NRNlSR12轉(zhuǎn)染后72h即可見/W W蛋白表達(dá)水平下調(diào)約6(B。這說明，本發(fā)明的 NRN1SR12可以明顯抑制M A7,可以作為腫瘤抑制劑。
實(shí)施例3對(duì)NRN1基因表達(dá)的消減作用的細(xì)胞水平篩選實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 種293T細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)于96孔板中，種板密度0. 8*107
孔
2. 24h后將攜帶NRN1SR12的lentivirus (慢病毒，吉?jiǎng)P公司)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì) 胞。Lentivirus滴度為106TU/ul，取MOI為100,即每孔加入80ul病毒液。具 體轉(zhuǎn)導(dǎo)方法如下
給每孔細(xì)胞換上50ul新鮮培養(yǎng)基(PH7.0)，加入適量病毒液，7-8h后每孔 補(bǔ)加50ul培養(yǎng)基。24h后換液。48-72h觀察GFP (綠色熒光)熒光，檢測(cè)轉(zhuǎn)導(dǎo) 效率。
3. 將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行GFP綠色熒光分選，篩選 出病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)陽性細(xì)胞，并檢測(cè)其陽性率。
4. Western檢測(cè)陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞的MW7內(nèi)源蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)論
A. 48h觀察GFP熒光，陽性率為46%,說明病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)方法正確。
B. 流式細(xì)胞術(shù)分選轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，陽性組的轉(zhuǎn)導(dǎo)率90%。陰性組的(含有陰 性片段NS的細(xì)胞)轉(zhuǎn)導(dǎo)率96% (流式細(xì)胞儀顯示數(shù)據(jù))。
C. Western檢測(cè)陽性細(xì)胞/W/V/蛋白表達(dá)水平較陰性細(xì)胞降低89%。實(shí)施例4 NRN1抑制劑抑制裸鼠腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
一、 實(shí)驗(yàn)材料
1. 裸鼠上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司
2. Lentivirus vector (慢病毒載體)上海吉?jiǎng)P基因技術(shù)有限公司
二、 實(shí)驗(yàn)步驟
1. 將裸鼠放入SPF級(jí)動(dòng)物房(無特定病原體級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房)，使其適應(yīng)培養(yǎng) 環(huán)境約一個(gè)星期。
2. 用DMEM (Dulbecco' s Medified Eagle Medium, invitrogene公司， 12800-82 ) +10% 85培養(yǎng)5羅(;一7721細(xì)胞。
3. 將S醒C一7721細(xì)胞(購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫)用胰酶消化后離心，去上 清，用無血清的DMEM重懸，然后去上清，加入適量PBS，制成每毫升約4X107 個(gè)細(xì)胞的懸液。
4. 向4-6周齡的裸鼠的腋下注射0. 2ml約含有8X 106個(gè)單位的細(xì)胞的PBS 懸液。
5. 待瘤體直徑達(dá)到3-5mm (毫米)時(shí)，按瘤體積大小將相同的2只分別歸 為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，并給這2組的每只小鼠都剪耳朵編號(hào)，記錄此時(shí)的每只小鼠 瘤體的長(zhǎng)徑短徑和體重。
6. 向2組小鼠的瘤體內(nèi)分別直接注射0. lml (毫升)的病毒和病毒空載體， 以注射病毒空載體為對(duì)照。每4天重復(fù)注射一次，共注射三次。
7. 從第一次注射病毒之日開始，每3天測(cè)量并記錄每只小鼠的瘤體的長(zhǎng)徑 短徑和體重，瘤體的體積^a62/2 (a長(zhǎng)徑長(zhǎng)度，b短徑長(zhǎng)度)。約4個(gè)星期后取 瘤。
結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射病毒(含有NRN1SR12)的裸鼠瘤體生長(zhǎng)明顯 減慢，在病毒注射后25天后NRN1SR12組瘤體是對(duì)照組瘤體的4(^左右。說明， 本發(fā)明的NRN1SR12可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種核苷酸分子，其特征在于，它具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的活性并且其序列包括5’-AGAGUUCGAAUAAGCUGCC-3’或者5’-AGAGTTCGAATAAGCTGCC-3’。
2. —種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-AGAGUUCGAA眼GCUGCCdTdT -3，。
3. —種如權(quán)利要求l所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-AGAGUUCGAAUAAGCUGCC -3，或者5， -AGAGTTCGAATAAGCTGCC -3，。
4. 一種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子，其特征在于，它的序列是5'-AGAGUUCGAAUAAGCUGCCdTdT -3， 。 _
5. —種如權(quán)利要求1一4中任何一種核苷酸分子的制備方法，其特征在于， 按權(quán)利要求l一4中任一種核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團(tuán)依次脫水縮和。
6. 如權(quán)利要求1 — 4中任何一種核苷酸分子在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7. 如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是所述的抗腫瘤藥物是由含有效治療 量的權(quán)利要求l一4中任一種核苷酸分子和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物 組合物。
8. —種如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征是，所述藥物是針劑、粉劑或者.片劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及NRN1SR12及其在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康。本發(fā)明提供了一種用于制備抗腫瘤藥物的核苷酸分子NRN1SR12，其序列包括5’-AGAGTTCGAATAAGCTGCC-3’或者5’-AGAGUUCGAAUAAGCUGCC-3’。含有NRN1SR12的裸鼠與相同培養(yǎng)條件下不含NRN1SR12的裸鼠相比，瘤體的增長(zhǎng)明顯受到抑制，而且這種現(xiàn)象隨著時(shí)間的推移日益明顯。本發(fā)明為腫瘤的治療和緩解提供了一種新的途徑和手段。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101302511SQ20081004016
公開日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2008年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月3日
發(fā)明者仙玲玲, 龍 余, 季國(guó)慶, 波 秦, 韓丁丁 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)