一種用于治療肺癌的藥物組合物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種組合藥物，具體涉及一種用于治療肺癌的藥物組合。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是最常見(jiàn)、對(duì)人類健康與生命危害最大的的惡性腫瘤之一。藥物治療是晚期肺癌治療的重要方法之一，但是目前治療效果有待于進(jìn)一步的提高，探索理想的治療方案是當(dāng)前抗肺癌藥物研究的主要方向和迫切要求。
[0003]近年來(lái)，聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)抗腫瘤療效而備受關(guān)注。姜黃素是從姜科植物的根莖中提取的一種酚性化合物。近年來(lái)體外實(shí)驗(yàn)表明姜黃素能夠抑制包括結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌等在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞增殖，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。芬維A胺是人工合成的全反式維甲酸衍生物，對(duì)多種致癌物所誘導(dǎo)的腫瘤有抑制作用，包括卵巢癌、前列腺癌、子宮癌、肺癌、腎癌、膀胱癌、皮膚癌、膠質(zhì)瘤、腦瘤和頸瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤和尤因氏肉瘤，是一種具有潛在開(kāi)發(fā)價(jià)值的抗腫瘤藥物。由于芬維A胺具有抗乳腺癌的效力，其在發(fā)揮作用時(shí)會(huì)優(yōu)先堆積在脂肪組織，因此多用于乳腺癌的研究。而臨床第三期試驗(yàn)結(jié)果也表明，芬維A胺可以降低絕經(jīng)前女性乳腺癌的復(fù)發(fā)。其可能作用機(jī)制主要為作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
[0004]迄今為止，尚未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外有對(duì)姜黃素和芬維A胺協(xié)同抗肺癌腫瘤作用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療肺癌的藥物組合物，其包含姜黃素(curcumin)和芬維A胺(fenretinide)，該組合物具有協(xié)同抗肺癌作用，可應(yīng)用于抗肺癌的藥物開(kāi)發(fā)。
[0006]優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物中含有的姜黃素和芬維A胺的摩爾比值為10~30:4~6。
[0007]優(yōu)選地，本發(fā)明藥物組合物中姜黃素的有效劑量為80 mg/kg,芬維A胺的有效劑量為 I mg/kg。
[0008]本發(fā)明的用于治療肺癌的藥物組合物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯增強(qiáng)芬維A胺的抗肺癌效果，兩者具有協(xié)同抗肺癌作用。該組合物可應(yīng)用于抗肺癌的藥物開(kāi)發(fā)。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1為本發(fā)明的藥物組合物對(duì)肺癌細(xì)胞存活率的影響；
其中，A為在普通光學(xué)顯微鏡下本發(fā)明的組合物對(duì)A549肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，B和C分別為本發(fā)明的藥物組合物在不同劑量作用下對(duì)A549和LLC (Lewis lung carcinoma)兩種肺癌細(xì)胞的細(xì)胞存活干預(yù)示意圖。
[0010]圖2為本發(fā)明的藥物組合物對(duì)C57BL/6小鼠體內(nèi)的肺癌腫瘤的抑制作用；
其中，A為本發(fā)明的組合藥物對(duì)小鼠體內(nèi)的肺癌腫瘤體積的抑制作用，并且呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系，B為本發(fā)明的組合藥物對(duì)荷瘤小鼠存活率的影響，C為不同藥物對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響，D為不同藥物對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)重量的影響。
[0011]圖3為本發(fā)明的藥物組合物降低了由姜黃素誘導(dǎo)引起的GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)的升尚;
其中，A和B顯示了組合物中芬維A胺顯著降低由姜黃素誘導(dǎo)升高的GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)，C為GRP78 siRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，明顯下調(diào)了由姜黃素誘導(dǎo)表達(dá)升高的GRP78蛋白；D為GRP78 siRNA轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞，協(xié)同增強(qiáng)姜黃素抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面將結(jié)合具體實(shí)施例或附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不作為對(duì)保護(hù)范圍的限制依據(jù)；在本發(fā)明權(quán)利要求范圍內(nèi)的任何改進(jìn)方案，均應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0013]實(shí)施例1:
一種用于治療肺癌的藥物組合物，該藥物組合物包含姜黃素(curcumin)和芬維A胺(fenretinide)。
[0014]實(shí)施例2:
A549細(xì)胞和LLC細(xì)胞的培養(yǎng)
兩種肺癌細(xì)胞株A549和LLC購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)。培養(yǎng)基為DMEM(Gibco公司，美國(guó))添加10%胎牛血清(Hyclone公司，美國(guó))，于37°C、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基隔天更換一次。
[0015]本發(fā)明的藥物組合物對(duì)肺癌細(xì)胞存活的檢測(cè) 1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及藥物處理
用姜黃素(購(gòu)自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)10 μΜ-30 μ Μ，芬維A胺4 μ Μ-6μ M(購(gòu)自阿拉丁試劑上海有限公司)及它們的組合物溶解于培養(yǎng)基中預(yù)處理細(xì)胞24小時(shí)，然后更換培養(yǎng)基，用顯微鏡拍照片和四甲基偶氮唑藍(lán)(ΜΤΤ，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司)法檢測(cè)肺癌細(xì)胞的存活率。
[0016]2.肺癌細(xì)胞存活率的檢測(cè)方法
(I)MTT 法
將含有I X 14個(gè)/100 μ? Α549細(xì)胞和LLC細(xì)胞的培養(yǎng)液分別接種于96孔板的每孔上，培養(yǎng)24小時(shí)后，用含不同濃度的姜黃素、芬維A胺、姜黃素和芬維A胺的組合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，然后用MTT方法測(cè)定細(xì)胞存活率。
[0017](2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
顯微鏡下觀察，姜黃素單獨(dú)預(yù)處理表現(xiàn)出了一定的細(xì)胞抑制作用；而單獨(dú)的芬維A胺則表現(xiàn)的抑制作用不明顯；用姜黃素(20 μ Μ)和芬維A胺(4 μΜ)、(20 μ Μ)和芬維A胺(6 μΜ)、(30 μ Μ)和芬維A胺(4 μΜ)、(30 μ M )和芬維A胺(6 μ M )聯(lián)合處理A549肺癌細(xì)胞時(shí)，顯著地增強(qiáng)了肺癌細(xì)胞的抑制作用，如圖1A所示。當(dāng)姜黃素(20 μ M-30μ Μ)與芬維A胺(4 μΜ-6 μ M )聯(lián)合用藥時(shí)，與單一藥物處理組相比，顯著增強(qiáng)了對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用，如圖1B (A549肺癌細(xì)胞)和IC (LLC肺癌細(xì)胞)所示。聯(lián)合用藥組與相應(yīng)濃度的姜黃素或芬維A胺單一用藥組比較，分別為#? < 0.05和*P < 0.05。即當(dāng)藥物組合物中姜黃素和芬維A胺的摩爾比值為10~30:4~6時(shí)，組合用藥組的細(xì)胞存活率顯著低于單一化合物用藥組的細(xì)胞存活率，提示在體外組合藥物可以協(xié)同增強(qiáng)抗肺癌細(xì)胞的效果。
[0018]實(shí)施例3:
本發(fā)明的藥物組合物抑制小鼠Levis肺癌的生長(zhǎng) (O實(shí)驗(yàn)方法
以C57BL/6小鼠(雌性，18?20克，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)，于右側(cè)前肢腋下皮下注射(1.6 X 16個(gè)細(xì)胞/μ?，100 μ?/只)，建立C57BL/6小鼠Levis肺癌移植模型。模型建立5天后將小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。藥物用聚乙二醇400 (PEG400)溶解，分別設(shè)對(duì)照組(PEG-400)、姜黃素組(40 mg/kg)、芬維A胺組(I mg/kg)及聯(lián)合用藥組(40 mg/kg姜黃素組+1 mg/kg芬維A胺)，分別以腹腔注射的方式給藥。每2天給藥I次并測(cè)量瘤徑。給藥25天后以安樂(lè)法處死小鼠，解剖取出腫瘤，并稱量拍照。
[0019](2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
小鼠在第5-7天成瘤，成瘤率100%。不同藥物處理對(duì)C57BL/6小鼠腫瘤生長(zhǎng)曲線如圖2A所示。接種腫瘤25天后，小鼠其存活率如圖2B所示:本發(fā)明的藥物組合物處理組與姜黃素處理組相比，小鼠的存活率有所增加，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。小鼠腫瘤重量比較如圖2D所示:本發(fā)明的藥物組合物處理組的小鼠腫瘤重量顯著低于對(duì)照組(P <
0.05);藥物組合物處理組的小鼠腫瘤重量低于姜黃素單一處理組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >
0.05);藥物組合物處理組的小鼠腫瘤重量顯著低于芬維A胺處理組(P < 0.05)。以上結(jié)果提示，本發(fā)明的藥物組合物對(duì)小鼠肺癌腫瘤的抑制率有一定的增加。與芬維A胺單一處理組比較，本發(fā)明的組合藥物可以顯著降低小鼠體內(nèi)肺癌腫瘤的重量。
[0020]實(shí)施例4:
本發(fā)明的組合藥物降低了由姜黃素誘導(dǎo)引起的GRP78蛋白表達(dá)的升高 Cl)實(shí)驗(yàn)方法
分別用姜黃素(20 μ M)、芬維A胺(4 μ M )或兩個(gè)藥的組合物處理Α549肺癌細(xì)胞12個(gè)小時(shí)后，收集細(xì)胞后，將細(xì)胞用200 μ?含有1%的蛋白酶抑制劑(購(gòu)自Roche公司)的RIPA裂解液(購(gòu)自碧云天公司)，冰上裂解30分鐘后，12，000 g離心10分鐘，收集上清。各個(gè)樣品的總蛋白濃度和體積調(diào)整后，加入2XSDS loading buffer于95°C煮5分鐘。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳和用Western blot方法檢測(cè)GRP78蛋白表達(dá)的變化。
[0021](2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
與姜黃素單一處理相比，藥物組合物處理組顯著下調(diào)了 A549細(xì)胞中的GRP78蛋白質(zhì)表達(dá)，提示本發(fā)明的藥物組合物能有效的減少由姜黃素誘導(dǎo)GRP78蛋白表達(dá)的增加，如圖3A、圖3B所示。與姜黃素處理組比較，_? < 0.0Ol0
[0022]實(shí)施例5:
GRP78 siRNA下調(diào)了由姜黃素誘導(dǎo)引起肺癌細(xì)胞的GRP78蛋白表達(dá)增加，并增加了姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Cl)實(shí)驗(yàn)方法
用GRP78 siRNA進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，(A)用20 μ M姜黃素處理Α549肺癌細(xì)胞12小時(shí)。隨后提取蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析GRP78蛋白的表達(dá)量的變化。(B)用0-30 μ M姜黃素處理Α549肺癌細(xì)胞24小時(shí)，用MTT的方法分析細(xì)胞的存活率。
[0023](2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3C所示，GRP78 siRNA顯著降低由姜黃素誘導(dǎo)升高GRP78的蛋白表達(dá)。在細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)中，GRP78 siRNA顯著增強(qiáng)了姜黃素對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用，siRNA陰性對(duì)照處理組(Scr siRNA)，對(duì)細(xì)胞的存活率未產(chǎn)生明顯的作用，如圖3D所示，與相應(yīng)濃度的姜黃素處理組比較，_p < 0.0Ol0
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于治療肺癌的藥物組合物，其特征在于:該藥物組合物包含姜黃素(curcumin)和芬維 A 胺(fenretinide)。2.如權(quán)利要求1所述的用于治療肺癌的藥物組合物，其特征在于:所述藥物組合物中姜黃素和芬維A胺的摩爾比值為10~30:4~6o3.如權(quán)利要求1所述的用于治療肺癌的藥物組合物，其特征在于:所述藥物組合物中姜黃素的有效劑量為80 mg/kg，芬維A胺的有效劑量為I mg/kg。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于治療肺癌的藥物組合物，其包含姜黃素（curcumin）和芬維A胺（fenretinide），姜黃素和芬維A胺的摩爾比值為（10~30）：（4~6）。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明姜黃素能明顯增強(qiáng)芬維A胺的抗肺癌效果，兩者具有協(xié)同抗肺癌作用。該藥物組合物可應(yīng)用于抗肺癌的藥物開(kāi)發(fā)。
【IPC分類】A61K31/167, A61K31/12, A61P11/00, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105030746
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510356089
【發(fā)明人】崔國(guó)禎, 李銘源, 王亮, 陳煥嫌
【申請(qǐng)人】遵義醫(yī)學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年11月11日
【申請(qǐng)日】2015年6月25日