專利名稱：人表皮生長因子受體突變基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多種人表皮生長因子受體(EGFR)突變基因及應用，涉及藥物制備和基因診斷的應用，特別是在非小細胞肺癌靶向治療藥物的制備和非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因檢測的應用。
背景技術：
惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，其治療也成為人們關注的焦點。傳統(tǒng)的化療和放療由于缺乏特異性，取得療效的同時也往往給患者帶來較大的毒副作用。為此，抗腫瘤靶向藥物的研究日益引起人們的重視。
眾所周知，目前惡性腫瘤靶向治療常用的治療靶點主要有細胞受體、信號傳導和抗血管生成等。針對這些靶點，已有一些藥物投入臨床研究或者上市，這些藥物主要有Herceptin(Trastuzumab)、Rituximab、IMC-C225(cetuximab，Erbitux)和Bevacizumab(Avastin)等；小分子化合物常用的有Glivec(STI51)、Iressa(ZD1839，Gefitinib)和OSI774等。這些藥物均在臨床實驗中取得了較好的療效，并顯示了上市應用的良好前景。這些藥物的作用機理有著一個共同的特點，即針對腫瘤細胞的信號傳導途徑——表皮生長因子受體(EGFR)的信號傳導途徑(參見文獻①Tanovic，A.，et al.，Gefitinibcurrent status in the treatment ofnon-small cell lung cancer，Drugs Today(Barc)，2004，809-27；②Ross，J.S.，et al.，)Targeted therapies for cancer 2004.Am J Clin Pathol，2004，122，598-609)。
最近的基礎與臨床研究表明，EGFR信號傳導途徑是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因素，在細胞衍生、凋亡、腫瘤血管新生及轉移等過程中發(fā)揮著重要作用。目前在多種實體瘤如乳腺癌、肺癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、頭頸癌、卵巢癌、腦腫瘤中均發(fā)現有EGFR的過表達。通過抑制腫瘤細胞信號傳導通路，可抑制腫瘤細胞的增殖，促使其凋亡。信號傳導通路中的酪氨酸激酶(TK)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關。以EGFR作為藥物作用靶點是眾多惡性腫瘤靶向治療新藥研發(fā)的一個新思路。
在Iressa治療非小細胞肺癌(NSCLC)的III期臨床研究中發(fā)現，盡管Iressa是現有療效最為明顯的一種EGFR信號傳導途徑抑制劑，但只有10％的NSCLC白人患者和27％的日本患者對Iressa有效且見效快，而且其EGFR的表達水平與對ZD1839反應之間無明顯相關性(參見文獻Fukuoka M，et al.，Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinibfor previously treated patients with advanced non-small-cell lungcancer.，J Clin Oncol，2003，21，2237-46)。進一步研究發(fā)現，對Iressa有療效的患者中存在有明顯的EGFR突變現象，這種突變在韓、日及臺灣地區(qū)東方患者群中出現的幾率顯著高于世界上的其他地區(qū)(參見文獻①Huang，S.F.，et al.，High frequency of epidermal growth factorreceptor mutations with complex patterns in non-small cell lungcancers related to gefitinib responsiveness in Taiwan.Clin CancerRes，2004，10，8195-203；②Han，S.W.，et al.，2005，Predictive andPrognostic Impact of Epidermal Growth Factor Receptor Mutation inNon-Small-Cell Lung Cancer Patients Treated With Gefitinib.，J ClinOncol；③Shigematsu，H.，et al.，Clinical and biological featuresassociated with epidermal growth factor receptor gene mutations inlung cancers.J Natl Cancer Inst，2005，97，339-46)。據此，人們認為，EGFR的這種突變與包括Iressa在內的抗腫瘤靶向藥物療效之間有著密切的關系，并且各人群種族之間的這種突變存在明顯的特異性。
公認的研究成果認為，EGFR活性提高激活了EGFR信號傳導途徑，導致腫瘤細胞增殖。而EGFR活性提高的原因之一在于EGFR突變基因的表達。對于不同人種群甚至個體，這種EGFR突變基因存在著差異?，F有的靶向治療藥物，雖然針對了EGFR信號傳導途徑這一有效的抗腫瘤靶點，但因沒有利用這種EGFR突變的這種特異性，故沒有在不同的人類種群甚至個體之間形成個體化治療，影響了藥物的療效。
另外，目前針對NSCLC患者的靶向藥物治療，通常是直接服用靶向藥物，通過臨床觀察確認其療效，缺少有效的治療方法預后評價模式，急需要建立一種準確、敏感、可靠、快速的檢測EGFR突變體基因的診斷技術，用來指導臨床醫(yī)師開展靶向抗腫瘤藥物的個體化用藥治療。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供多種人表皮細胞生長因子受體(EGFR)突變基因及應用，涉及藥物制備和基因診斷的應用，特別是在非小細胞肺癌靶向治療藥物的制備和非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因檢測的應用。
本發(fā)明所提供的EGFR突變基因及應用，在于這種突變基因是發(fā)生在EGFR的酪氨酸激酶(TK)區(qū)的第19～21號外顯子上，有四種不同的基因序列，其基因序列分別如附圖2至附圖5所示，附圖6示出的是在第19～21號外顯子上同時發(fā)生突變的基因序列的一種情況，附圖7示出的是在第19～21號外顯子上同時發(fā)生突變的基因序列的另一種情況，上述的突變都屬于體細胞突變，正常人組織細胞中沒有這種突變。EGFR的野生型基因序列如附圖1所示。EGFR突變基因的突變方式包括有缺失突變，點突變和缺失加插入突變。特別需要指出的是，在這些突變中，第19號外顯子上的746～750位氨基酸非移碼缺失突變，在中國NSCLC患者群中屬于高頻突變，突變率達到80％；第21號外顯子上的L858R錯義突變，在中國NSCLC患者群中屬于低頻突變，突變率僅為10％。由于腫瘤細胞的胞內生化代謝依賴于EGFRTK區(qū)的信號傳導途徑的調節(jié)，通過抑制前述突變基因的表達，可以降低EGFR的活性表達，調控惡性腫瘤細胞的生化代謝，從而遏制惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，達到靶向治療惡性腫瘤的目的。還可以通過基因診斷來檢測前述突變基因，對惡性腫瘤患者實施個體化的抗腫瘤用藥治療。
本發(fā)明通過隨機抽取中國惡性腫瘤患者的基因組DNA獲取病例樣本，利用人癌細胞系進行基因突變的篩查，針對EGFR第19至21號外顯子，設計了三對引物，用于擴增癌細胞系cDNA中EGFR-TK區(qū)，對基因組DNA中的EGFR進行篩查。引物的設計詳見表1。并進行中國人NSCLC的EGFR TK突變頻率與國外其他地區(qū)的對比研究。
EGFR酪氨酸激酶區(qū)突變基因的篩查方法是采用Trizol試劑對各種癌細胞進行總RNA的提取，通過SuperScrip III進行逆轉錄，取適量合成的cDNA，經PCR擴增后進行DNA測序。測序包括正向引物測序和反向引物測序(見附圖3)，確定突變位點(見附圖4)，結果表明，EGFR第19號外顯子上為(E746-A750缺失)突變和(L747-T751缺失)突變，第21號外顯子上為(L858R錯義)突變，第20號外顯子上為(DN(770-771)缺失&AGG插入)突變。
EGFR TK區(qū)突變基因在大腸桿菌中的表達；設計引物(詳見表3)，從EGFR的全長基因中擴增出TK區(qū)突變基因，通過限制性內切酶將其克隆到大腸桿菌的表達載體pET15b上，轉化大腸桿菌DH5a得到重組子。再將得到的重組子轉入大腸桿菌表達菌株BL21中，得到表皮生長因子受體EGFR TK區(qū)突變基因的表達菌株rBL21-ETK。
表3 EGFR TK區(qū)突變基因擴增引物

接種菌株rBL21-ETK，將其培養(yǎng)到OD0.8時加入終濃度1mM的IPTG，誘導表達4個小時后，離心收菌，加入裂菌緩沖液重懸，然后在冰浴中進行超生波破菌。破菌后離心的沉淀用8M的尿素溶液溶解，掛鎳柱進行蛋白純化。純化的蛋白在復性緩沖液中復性24個小時后離心，將上清液再次掛柱，洗脫后得到EGFR TK區(qū)突變基因的表達蛋白(附圖15、附圖16、附圖17)。
EGFR TK區(qū)突變基因在昆蟲細胞中的表達；設計引物(詳見表4)，從EGFR的全長基因中擴增出TK區(qū)突變基因，通過限制性內切酶將其克隆到含昆蟲多角體病毒啟動子的載體pRESEVER-1a中，形成重組質粒。將重組質粒轉座DH10Bac，藍白斑篩選得到轉座成功的白斑，堿裂解法抽提該菌斑中的含目的基因的Bacmid質粒，用PCR驗證該質粒(附圖18)。轉染昆蟲細胞sf9，得到所需的病毒粒子。
表4 EGFR TK區(qū)突變基因擴增引物

將得到的病毒粒子循環(huán)感染兩次，提高病毒粒子的滴度。將三次感染后的病毒粒子按1∶100大量感染昆蟲細胞sf9，四天后收集細胞。超生波破碎細胞后，上清液用Western-Blot(WB)驗證蛋白的表達(附圖19)。
EGFR TK區(qū)突變對胞內EGFR活性表達的影響EGFR TK區(qū)的突變可導致其活性的增強，在細胞水平可表現為磷酸化形式的EGFR表達量提高，進而影響其信號傳導通路下游靶標的表達量變化，并最終影響細胞的增殖，分化等過程。
首先構建帶有野生型EGFR基因的真核表達載體和EGFR TK區(qū)突變基因載體，將等量的上述載體分別轉染人的非小細胞肺癌細胞株SPC-A-1中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)20～24小時后，血清饑餓18～24小時，在培養(yǎng)基中加入100ng/uL的EGF，于37℃進行刺激反應，同時設置不刺激的陰性對照。然后在不同時間點收集細胞，取等量細胞裂解液，用Western-Blot法檢測，考察在EGFR總表達量一致的前提下，活性形式(磷酸化形式)EGFR的表達變化情況及其在野生型和突變體之間的變化差異，結果見附圖20、21。
本發(fā)明指出了EGFR的突變基因，特別是中國人NSCLC的EGFR突變基因，為藥物制備和基因診斷的應用，特別是在非小細胞肺癌靶向治療藥物的制備和非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因檢測的應用。
抑制前述突變基因的表達，能降低EGFR的活性表達，達到抑制腫瘤細胞的信號傳導通路，遏制腫瘤細胞的增殖，促使其凋亡的目的。為抑制前述突變基因的表達，可以采用制備抑制劑，也可以采用制備抗體，或是其他類型的能夠抑制前述基因表達的藥物，來遏制腫瘤細胞的生長。附圖13給出了應用本發(fā)明進行惡性腫瘤治療的實施流程。
通過檢測前述突變基因，可以建立準確、敏感、可靠、快速的EGFR基因診斷技術，用來指導臨床醫(yī)師開展靶向抗腫瘤藥物的個體化用藥治療。附圖14給出了應用本發(fā)明進行惡性腫瘤基因診斷的實施流程。
本發(fā)明的特點在于，提供了制備惡性腫瘤靶向治療藥物所需要的基因靶位，特別是制備用于中國人NSCLC靶向治療藥物的基因靶位，同時提供了用于基因診斷用的靶位，特別是用于非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因檢測的基因靶位，使得惡性腫瘤，特別是NSCLC的靶向藥物和基因診斷試劑的開發(fā)具有明確的作用位點，從而使靶向治療更加具有針對性，能夠進行惡性腫瘤的個體化治療。


附圖1是人表皮生長因子受體基因正常型的序列結構。
附圖2是人表皮生長因子受體基因在第19號外顯子發(fā)生缺失突變后的序列結構。
附圖3是人表皮生長因子受體基因的酪氨酸激酶區(qū)的第19號外顯子發(fā)生缺失突變后的另一種序列結構。
附圖4是人表皮生長因子受體突變基因的酪氨酸激酶區(qū)的第20號外顯子發(fā)生缺失加插入突變的序列結構。
附圖5是人表皮生長因子受體突變基因的酪氨酸激酶區(qū)的第21號外顯子發(fā)生點突變后具有的序列結構。
附圖6是人表皮生長因子受體突變基因的酪氨酸激酶區(qū)的第19～21號外顯子發(fā)生突變后一種序列結構。
附圖7是人表皮生長因子受體突變基因的酪氨酸激酶區(qū)的第19～21號外顯子發(fā)生突變后另一種序列結構。
附圖8是中國人NSCLC患者的EGFR TK第19號外顯子的缺失突變。
附圖9是中國人NSCLC患者的EGFR TK第19號外顯子的另一種缺失突變。
附圖10是中國人NSCLC患者的EGFR TK第20號外顯子的缺失加插入突變。
附圖11是中國人NSCLC患者的EGFR TK第21號外顯子上的點突變。
附圖12是中國人NSCLC患者EGFR TK突變的類型。
附圖13是應用EGFR TK區(qū)突變基因進行惡性腫瘤治療的原理流程附圖14是應用EGFR TK區(qū)突變基因檢測實施惡性腫瘤個體化治療的原理流程附圖15是EGFR TK區(qū)突變基因在大腸桿菌內表達過程中PCR擴增的結果。其中，A表示樣品，B表示Marker。
附圖16是EGFR TK區(qū)突變基因在大腸桿菌內蛋白表達的結果。其中，A表示Marker，B表示誘導前的表達蛋白，C表示誘導后的表達蛋白。
附圖17是EGFR TK區(qū)突變基因在大腸桿菌內表達蛋白復性后的純化結果。其中，A表示Marker，B表示復性后的表達蛋白。
附圖18是EGFR TK區(qū)突變基因在昆蟲細胞內表達過程中Bacmid重組質粒的PCR驗證結果。其中，A表示λ/Hind III Marker，B表示對照(空載體)轉座，C表示第19號外顯子L747-T751的缺失突變，D表示第21號外顯子L858R的錯義突變，E表示第20號外顯子DN770-771的缺失突變，F表示第20號外顯子DN770-771的AGG插入突變，G表示第19號外顯子E746-A750的缺失突變，H表示15000 Marker。
附圖19是EGFR TK區(qū)突變基因蛋白表達的Western-Blot驗證結果。其中，A表示Marker，B表示對照，C第19號外顯子L747-T751的缺失突變，D表示第21號外顯子L858R的錯義突變，E表示第20號外顯子DN770-771的缺失突變，F表示第20號外顯子DN770-771的AGG插入突變，G表示第19號外顯子E746-A750的缺失突變。
附圖20是EGFR TK區(qū)突變基因對胞內EGFR活性表達影響的Western-Blot檢測結果。其中，A表示野生型對照，B表示第21號外顯子L858R的錯義突變，C表示第19號外顯子L747-T751的缺失突變。
附圖21是EGFR TK區(qū)突變基因對胞內EGFR活性表達影響隨時間變化的結果。其中，A表示野生型對照，B表示第21號外顯子L858R的錯義突變，C表示第19號外顯子L747-T751的缺失突變。
具體實施例方式
實施例1EGFR TK區(qū)基因突變的篩查篩查樣本主要為原始腫瘤樣本基因組DNA及癌細胞系cDNA。
設計針對EGFR第19至21號外顯子的三對引物，對基因組DNA中的EGFR進行篩查。用于擴增癌細胞系cDNA中EGFR-TK區(qū)(酪氨酸激酶區(qū))的引物詳見表1。
表1 EGFR TK外顯子的引物擴增

采用Trizol試劑對各種癌細胞進行總RNA的提取。用不含RNase的DNase I(購自TaKaRa)對其中的基因組DNA進行消化后，取5ug總RNA以SuperScrip III(購自Invitrogen)進行逆轉錄。取適量合成的cDNA用于EGFR-TK區(qū)的PCR擴增。
在40μL的PCR體系中，以相應于50ng總RNA獲得的cDNA為模板，采用Pyrobest DNA聚合酶進行擴增。PCR產物經過瓊脂糖凝膠回收后，用于DNA序列測定。
對于擴增自腫瘤基因組DNA的PCR產物，先用初篩所用的正向引物進行測序，再用反向引物測序以確定突變位點；對于擴增自癌細胞系cDNA的PCR產物，同時用正反向引物進行測序(序列測定由ABI 377測序儀完成)。
如附圖8至附圖11，測序包括正向引物測序和反向引物測序，確定突變位點如附圖12，結果表明，EGFR第19號外顯子上為缺失突變，第21號外顯子上為點突變，第20號外顯子上為缺失加插入突變。
實施例2中國人NSCLC的EGFR TK突變頻率與國外其他地區(qū)的對比隨機抽取41例中國NSCLC患者的腫瘤基因組DNA，以及10例非腺癌組織的DNA樣本。41例樣本中，30例為男性，11例為女性。男性患者的年齡從43歲到77歲(平均57歲)，而女性患者的年齡從31歲到64歲(平均48歲)。17例為肺腺癌，21例為鱗癌，3例為腺鱗癌。20例有吸煙史，而21例無吸煙史。
用于基因突變篩查的7種人類癌細胞系，主要包括2例肺癌細胞系95D，NCI-H460，2例前列腺癌細胞系PC-3，Du-145，以及Hela，HT-1080和MCF-7等其它細胞系。
表2中國人NSCLC的3種EGFR TK突變頻率與國外其他地區(qū)的對比

實施例3EGFR TK區(qū)突變基因(舉例具體的突變位點)在大腸桿菌中的表達設計引物(詳見表3)，從EGFR的全長基因中擴增出TK區(qū)突變基因，通過限制性內切酶將其克隆到大腸桿菌的表達載體pET15b上，轉化大腸桿菌DH5a得到重組子。再將得到的重組子轉入大腸桿菌表達菌株BL21中，得到表皮生長因子受體EGFR TK區(qū)突變基因的表達菌株rBL21-ETK。
表3 EGFR TK區(qū)突變基因擴增引物

接種菌株rBL21-ETK，將其培養(yǎng)到OD0.8時加入終濃度1mM的IPTG，誘導表達4個小時后，離心收菌，加入裂菌緩沖液重懸，然后在冰浴中進行超生波破菌。破菌后離心的沉淀用8M的尿素溶液溶解，掛鎳柱進行蛋白純化。純化的蛋白在復性緩沖液中復性24個小時后離心，將上清液再次掛柱，洗脫后得到EGFR TK區(qū)突變基因的表達蛋白(附圖15、附圖16、附圖17)。
實施例4EGFR TK區(qū)突變基因(舉例具體的突變位點)在昆蟲細胞中的表達設計引物(詳見表4)，從EGFR的全長基因中擴增出TK區(qū)突變基因，通過限制性內切酶將其克隆到含昆蟲多角體病毒啟動子的載體pRESEVER-1a中，形成重組質粒。將重組質粒轉座DH10Bac，藍白斑篩選得到轉座成功的白斑，堿裂解法抽提該菌斑中的含目的基因的Bacmid質粒，用PCR驗證該質粒(附圖18)。轉染昆蟲細胞sf9，得到所需的病毒粒子。
表4 EGFR TK區(qū)突變基因擴增引物

將得到的病毒粒子循環(huán)感染兩次，提高病毒粒子的滴度。將三次感染后的病毒粒子按1∶100大量感染昆蟲細胞sf9，四天后收集細胞。超生波破碎細胞后，上清液用Western-Blot(WB)驗證蛋白的表達(附圖19)。
實施例5EGFR TK區(qū)突變(舉例具體的突變位點)對胞內EGFR活性表達的影響EGFR TK區(qū)的突變可導致其活性的增強，在細胞水平可表現為磷酸化形式的EGFR表達量提高，進而影響其信號傳導通路下游靶標的表達量變化，并最終影響細胞的增殖，分化等過程。
首先構建帶有野生型EGFR基因的真核表達載體和EGFR TK區(qū)突變基因載體，將等量的上述載體分別轉染人的非小細胞肺癌細胞株SPC-A-1中，于37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)20～24小時后，血清饑餓18～24小時，在培養(yǎng)基中加入100ng/uL的EGF，于37℃進行刺激反應，同時設置不刺激的陰性對照。然后在不同時間點收集細胞，取等量細胞裂解液，用Western-Blot法檢測，考察在EGFR總表達量一致的前提下，活性形式(磷酸化形式)EGFR的表達變化情況及其在野生型和突變體之間的變化差異，結果見附圖20、21。
實施例6藥物抑制含有EGFR TK區(qū)突變基因的細胞生長使用含EGFR TK區(qū)突變基因的人非小細胞肺癌細胞株SPC-A-1/EGFR，構建自穩(wěn)定轉染人全長EGFR基因的SPC-A-1細胞系。將藥物Tressa溶解于有機溶劑二甲基亞砜(DMSO)中，半數稀釋于96孔細胞培養(yǎng)板，起始濃度為20mg/L，連續(xù)稀釋6次至終濃度為0.312mg/L，陰性對照采用生理鹽水，96孔板每孔接種SPC-A-1/EGFR細胞3000個，置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，然后用MTT染色法測定細胞活性，與陰性對照比較計算藥物對SPC-A-1/EGFR細胞的生長抑制率(％)，回歸計算藥物的半數抑制濃度IC50，與SPC-A-1母系比較評價EGFR-TK區(qū)突變狀態(tài)和其對藥物的敏感性的關系。研究結果顯示，含EGFR-TK區(qū)突變基因的肺癌細胞IC50和不含突變基因的細胞相比具有統(tǒng)計學差異(P＜0.001)，表明含EGFR TK區(qū)突變基因的細胞對ZD 1839更敏感。
表5 藥物不同濃度對兩種細胞的生長抑制作用

實施例7Iressa抑制人肺癌(SPC-A-1/EGFR)細胞株荷瘤裸鼠移植瘤生長將40只5～6周齡的SPF級BALB/C裸鼠按雌雄各半分組后，用培養(yǎng)后的人肺癌SPC-A-1/EGFR細胞懸液接種于裸鼠右側腋窩皮下，培養(yǎng)7天后按照腫瘤體積大小隨機分組，腹腔注射Iressa(100mg/kg)，連續(xù)5天，每2天測量各只裸鼠腫瘤大小，用藥結束后2天，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重后，按如下公式計算抑瘤率抑瘤率(％)＝(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100％。實驗結果見表6和表7。
表6 Iressa抑制人肺癌(SPC-A-1/EGFR)細胞株荷瘤裸鼠移植瘤生長——治療后各組裸鼠腫瘤體積的動態(tài)變化

表7 Iressa抑制人肺癌(SPC-A-1/EGFR)細胞株荷瘤裸鼠移植瘤生長——治療結束后各組平均瘤重

實施例8抑制前述突變基因的表達，能降低EGFR的活性表達，達到抑制腫瘤細胞的信號傳導通路，遏制腫瘤細胞的增殖，促使其凋亡的目的。為抑制前述突變基因的表達，可以采用制備抑制劑，也可以采用制備抗體，或是其他類型的能夠抑制前述基因表達的藥物，來遏制腫瘤細胞的生長。(應列出具體制備方法！)附圖13給出了應用本發(fā)明進行惡性腫瘤治療的實施流程。
實施例9通過檢測前述突變基因，可以建立準確、敏感、可靠、快速的EGFR基因診斷技術，用來指導臨床醫(yī)師開展靶向抗腫瘤藥物的個體化用藥治療。(應列出具體檢測前述突變基因的方法！)附圖14給出了應用本發(fā)明進行惡性腫瘤基因診斷的實施流程。
權利要求
1.人表皮生長因子受體(EGFR)的突變基因，其特征是這種突變基因是發(fā)生在EGFR的酪氨酸激酶(TK)區(qū)的第19～21號外顯子上。
2.根據權利要求1所述的突變基因，其特征在于是中國人非小細胞肺癌NSCLC的EGFR突變基因。
3.根據權利要求1和2所述的突變基因，其特征在于EGFR突變基因的突變方式包括有缺失突變，點突變和缺失加插入突變。
4.根據權利要求3所述的突變基因，其特征在于EGFR第19號外顯子上為(E746-A750缺失)突變和(L747-T751缺失)突變。
5.根據權利要求3所述的突變基因，其特征在于EGFR第21號外顯子上為(L858R錯義)突變。
6.根據權利要求3所述的突變基因，其特征在于EGFR第20號外顯子上為(DN(770-771)缺失&AGG插入)突變。
7.根據權利要求1和2所述的突變基因在大腸桿菌中表達的蛋白的制備方法，其特征在于IPTG誘導表達后，鎳柱進行蛋白純化。
8.根據權利要求1和2所述的突變基因在昆蟲細胞中表達的蛋白的制備方法，其特征在于采用含昆蟲多角體病毒啟動子的載體。
9.根據權利要求1和2所述的突變基因的應用，其特征在于提供了腫瘤治療藥物的制備的基因靶位。
10.據權利要求9所述的突變基因的應用，其特征在于提供了非小細胞肺癌靶向治療藥物的制備的基因靶位。
11.據權利要求9所述的突變基因的應用，其特征在于提供了中國人非小細胞肺癌靶向治療藥物的制備的基因靶位。
12.根據權利要求1和2所述的突變基因的應用，其特征在于可以采用制備抑制劑，制備抗體，或是其他類型的能夠抑制基因表達的藥物的方式。
13.根據權利要求1和2所述的突變基因的應用，其特征在于在腫瘤治療中人表皮生長因子受體基因檢測的應用。
14.根據權利要求13所述的突變基因的應用，其特征在于在非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因的檢測中的應用。
15.根據權利要求13所述的突變基因的應用，其特征在于在中國人非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因的檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及藥物制備和基因診斷的應用，特別是在非小細胞肺癌靶向治療藥物的制備和非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因檢測的應用。提供多種人表皮細胞生長因子受體(EGFR)突變基因，制備了用于中國人非小細胞肺癌(NSCLC)靶向治療藥物的基因靶位、基因診斷用靶位，特別是用于非小細胞肺癌治療中人表皮生長因子受體基因檢測的基因靶位，使得惡性腫瘤，特別是NSCLC的靶向藥物和基因診斷試劑的開發(fā)具有明確的作用位點，從而使靶向治療更加具有針對性，能夠進行惡性腫瘤的個體化治療。
文檔編號A61P35/00GK101070538SQ20051011590
公開日2007年11月14日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權日2005年3月28日
發(fā)明者裴端卿, 秦寶明, 陳曉 申請人:裴端卿