專利名稱：通過p－選擇素配體(psgl)拮抗劑抑制細(xì)胞素t細(xì)胞的分化的制作方法
背景技術(shù)：
P-選擇素是在血管內(nèi)皮細(xì)胞等上表達(dá)的細(xì)胞粘附分子。P-選擇素與其配體PSGL(也已知為“PSGL-1”，在嗜中性白細(xì)胞等上表達(dá))的相互作用導(dǎo)致血管系統(tǒng)中循環(huán)的，表達(dá)PSGL的細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，由其它粘附分子介導(dǎo)外滲至周圍組織。因此，經(jīng)文獻(xiàn)記載，P-選擇素/PSGL相互作用是產(chǎn)生炎性和免疫反應(yīng)的步驟之一。
如國際申請WO98/08949(列入本文作為參考)所述，已克隆并較好鑒定了PSGL。該申請公開了編碼多種PSGL形式，包括多種PSGL功能性可溶形式的多核苷酸。因此，PSGL是一種已被詳細(xì)鑒定的分子，其可溶性形式尤其適于作為治療劑給藥。
因此，需要確定PSGL是否參與其它細(xì)胞相互作用，在所述相互作用中，多種PSGL形式或其它PSGL拮抗劑可用作抑制劑。
發(fā)明簡述申請人首次測定可溶性PSGL或抗PSGL抗體能抑制激活的處于增殖中的T-細(xì)胞分化為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞。因此，可溶性PSGL，PSGL抗體和其它PSGL拮抗劑可以抑制這種分化和由此產(chǎn)生的相伴的免疫和炎性反應(yīng)。結(jié)果，可使用這些拮抗劑治療由不合乎需要的或過度的免疫和炎性反應(yīng)導(dǎo)致的疾病和其它病癥，例如變應(yīng)性反應(yīng)和自身免疫病。
本發(fā)明提供了抑制哺乳動(dòng)物受試者的激活的T-細(xì)胞分化為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
其它實(shí)施方案提供了治療或緩解自身免疫病的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
其它實(shí)施方案提供了治療或緩解變應(yīng)性反應(yīng)的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
其它實(shí)施方案提供了治療或緩解哮喘的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
在上述每一種方法中，所述PSGL拮抗劑優(yōu)選選自可溶形式的PSGL，抗PSGL抗體，抗sLex抗體，抗硫酸化酪氨酸抗體，sLex，抑制sLex結(jié)合的模擬物和小分子的PSGL結(jié)合抑制劑。最優(yōu)選可溶形式的PSGL和抗PSGL抗體。在可溶形式的PSGL中，優(yōu)選含有PSGL成熟氨基酸序列前19個(gè)氨基酸的可溶形式的PSGL，更優(yōu)選含有PSGL成熟氨基酸序列前47個(gè)氨基酸的可溶形式的PSGL。在某些其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述47個(gè)氨基酸與免疫球蛋白鏈的Ig部分融合。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本文提及的所有專利和參考文獻(xiàn)都全文列入本文作為參考。
國際申請WO98/08949中公開了多種可溶形式的PSGL，包括含有PSGL序列的融合蛋白?？筛鶕?jù)該文獻(xiàn)中公開的方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法制備可溶形式的PSGL。
本文所用術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，CDR-移植抗體，人源化抗體或其能與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的片斷。該術(shù)語還包括由抗體或能與所述蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體序列衍生得到的任何其它種類的抗體。
可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法產(chǎn)生抗特定蛋白質(zhì)的抗體。例如，可根據(jù)已知方法(例見Goding，1983，單克隆抗體理論和實(shí)踐，Academic出版公司，紐約；Yokoyama，1992，“單克隆抗體的產(chǎn)生”，最新免疫學(xué)方法，第2.5單元，Greene Publishing Assoc.和John Wiley&Sons)制備能產(chǎn)生抗體的雜交瘤，從而產(chǎn)生單克隆抗體。根據(jù)已知方法，用相關(guān)蛋白質(zhì)或其片斷免疫接種哺乳動(dòng)物受試者，可以產(chǎn)生多克隆血清和抗體。根據(jù)已知方法(例見Goding，文獻(xiàn)同上；Andrew等，1992.“免疫球蛋白的片斷化”，最新免疫學(xué)方法，第2.8單元，Greene PublishingAssoc.和John Wiley&Sons)裂解和收集所需片斷，可由相應(yīng)抗體產(chǎn)生抗體的片斷，受體或其它活性肽。也可以根據(jù)已知的重組方法(例見美國專利5,169,939，5,194,594和5,576,184)產(chǎn)生嵌合抗體和單鏈抗體?？筛鶕?jù)眾所周知的方法(例見美國專利5,530,101，5,585,089和5,693,762)由相應(yīng)的鼠抗體制備人源化抗體。
“sLex”是參與PSGL結(jié)合的糖類，即唾液酸路易斯x(例見WO98/08949)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知制備sLex的方法?！耙种苨Lex結(jié)合的模擬物”包括糖類和肽/糖類，它們以抑制sLex結(jié)合的方式與同sLex結(jié)合的決定簇結(jié)合(例見美國專利5,614,615)。本領(lǐng)域已知制備這種模擬物的其它方法。通過在本文所述的檢測可溶性PSGL和PSGL抗體的模型中檢測這些模擬物，即可測定所述模擬物能否在本發(fā)明的方法中發(fā)揮作用。
通過在本文所述的模型中檢測候選物質(zhì)也可鑒定抑制PSGL結(jié)合的小分子?？蓪Χ喾N化合物進(jìn)行試驗(yàn)以測定何種化合物能完成本發(fā)明。
可用于實(shí)施本發(fā)明方法的，含有PSGL拮抗劑的藥物組合物也可含有可藥用的載體，稀釋劑，填充劑，鹽，緩沖液，穩(wěn)定劑和/或本領(lǐng)域眾所周知的其它物質(zhì)。術(shù)語“可藥用的”指的是物質(zhì)不會(huì)干擾活性成分的生物活性效力，而且對給藥的宿主不會(huì)產(chǎn)生毒性。載體或其它物質(zhì)的特性取決于給藥的途徑。
本發(fā)明希望多種藥物組合物應(yīng)含有約0.1微克至約1毫克/毫升的活性成分。
可以用多種常規(guī)的方法給藥。腹膜內(nèi)注射是優(yōu)選的給藥方法。也可使用靜脈內(nèi)，皮膚或皮下注射。為了進(jìn)行注射，優(yōu)選以無-熱原，非腸道可接受的水溶液形式施用PSGL拮抗劑。具有適當(dāng)pH，等滲性，穩(wěn)定性等的所述非腸道可接受的蛋白質(zhì)溶液制品是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于制備的。
治療所用的PSGL拮抗劑的量取決于疾病的嚴(yán)重程度，給藥的途徑，拮抗劑的反應(yīng)性或拮抗劑的活性，最終由治療的提供者決定。實(shí)施本發(fā)明的治療方法時(shí)，需施用治療有效量的PSGL拮抗劑。術(shù)語“治療有效量”指的是方法或組合物中足以顯示出有意義的患者利益(如治愈，緩解，抑制疾病，延遲或防止疾病發(fā)作，防止疾病再現(xiàn)或復(fù)發(fā))的各活性成分總量。一個(gè)通用的確定給定患者的治療有效量的技術(shù)是周期性地施用逐步增加的劑量直至治療提供者觀察到有意義的患者利益。當(dāng)用于單獨(dú)施用的各個(gè)活性成分時(shí)，該術(shù)語僅指該成分。當(dāng)用于組合成分時(shí)，該術(shù)語指的是導(dǎo)致治療效果的活性成分的總量，而不論所述成分是混合施用的，連續(xù)施用的，還是同時(shí)施用的。設(shè)想本發(fā)明中PSGL拮抗劑的治療有效劑量范圍約為0.05mg/kg至約25mg/kg，優(yōu)選約為1mg/kg至約20mg/kg，更優(yōu)選約為2mg/kg至約10mg/kg。給藥的次數(shù)根據(jù)各個(gè)患者和自身免疫病的嚴(yán)重程度而有所變化。
參照下述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可進(jìn)一步舉例說明和支持本發(fā)明。
本文所提及的所有參考文獻(xiàn)都全文列入本文作為參考。
實(shí)施例1選擇素配體上的糖類組成成分的α(1，3)巖藻糖基化是選擇素結(jié)合所必需的，因此，α(1，3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV和VII雙缺損(FT-/-)小鼠的內(nèi)皮細(xì)胞和T細(xì)胞上缺乏功能性選擇素配體1，2。當(dāng)被痘苗病毒(vv)感染時(shí)，盡管FT-/-小鼠的CD8+T細(xì)胞能強(qiáng)有力地進(jìn)行病毒-特異性增殖并產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)，但該小鼠不會(huì)產(chǎn)生病毒-特異性的細(xì)胞毒性。CTL殺傷缺陷不是由選擇素介導(dǎo)的T細(xì)胞運(yùn)輸受損的結(jié)果，因?yàn)長-，P-和E-選擇素三重缺損的小鼠3能產(chǎn)生正常的抗病毒細(xì)胞毒性?？扇苄灾亟MP選擇素糖蛋白-1(rec-PSGL-1)和PSGL-1單克隆抗體2PH-13部分阻斷致敏野生型T細(xì)胞在體外產(chǎn)生效應(yīng)CTL。這些結(jié)果表明抗原-特異性CD8+T細(xì)胞殺傷功能的產(chǎn)生不依賴于它們增殖和分泌細(xì)胞因子的能力，而必需依賴于α(1，3)-巖藻糖基化PSGL-1相關(guān)分子。
選擇素及其配體是相互表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上的表面分子，通過它們的相互作用可以啟動(dòng)白細(xì)胞滾動(dòng)，這是白細(xì)胞通過血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移所需的第一個(gè)步驟6-8。選擇素的凝集素結(jié)構(gòu)域由細(xì)胞蛋白質(zhì)支架上呈遞的與唾液酸路易斯x(sLex)相關(guān)的糖類識別，sLex組成成分通過糖基化，唾液酸化，巖藻糖基化和硫酸化所作的寡糖修飾決定了選擇素-配體相互作用的良好特異性9-13。已在FTIV和VII-雙重缺損的小鼠中證實(shí)了巖藻糖基化對選擇素結(jié)合的重要性，在所述小鼠中，L-，P-以及E-選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞滾動(dòng)嚴(yán)重受損，導(dǎo)致對外周抗原攻擊的DTH反應(yīng)受損1，2。尚不清楚缺損的選擇素配體功能是如何影響全身性抗原識別的。
痘苗病毒在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)急性感染，導(dǎo)致健全T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，無需在體外重新刺激，直接由新分離的脾細(xì)胞和PEL即可闡明病毒-特異性細(xì)胞毒性14。因此，vv感染提供了便利的急性感染模型，該模型可用于研究體內(nèi)T細(xì)胞反應(yīng)的產(chǎn)生。我們使用此模型研究了FT-/-小鼠的T細(xì)胞反應(yīng)。經(jīng)由外周(尾根部皮下(sc))或全身途徑(腹膜內(nèi)(Ip))用vv感染野生型和FT-/-小鼠，使用在注射后(pf)第10天(sc途徑)或第7天(Ip途徑)獲得的腹膜溢泌液淋巴細(xì)胞(PEL)和/或脾細(xì)胞評估病毒特異性細(xì)胞毒性。野生型小鼠顯示出高水平的細(xì)胞毒性，而經(jīng)任一種途徑注射的FT-/-小鼠的脾細(xì)胞和PEL未表現(xiàn)出可測的細(xì)胞毒性(圖1a)。為了測定缺損DTL反應(yīng)的程度，我們嘗試在體外用vv刺激致敏脾細(xì)胞(感染后7天所得)來富集病毒-特異性CTL。培養(yǎng)5至7天之后評估CTL活性。在野生型而不是FT-/-培養(yǎng)物中可檢測到等數(shù)目的大細(xì)胞(圖1b)。用野生型或FT-/-肺成纖維細(xì)胞靶細(xì)胞可得到類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，這表明這些觀察結(jié)果不是早期試驗(yàn)中所用MC57G靶細(xì)胞的獨(dú)特性的必然結(jié)果。為了了解FT-/-T細(xì)胞的殺傷能力是全面缺損，還是局限于病毒-特異性殺傷，我們在體外檢測了淋巴細(xì)胞激活的殺傷(LAK)功能和葡萄球菌腸毒素A(SEA)誘導(dǎo)的CTL活性。在這兩個(gè)試驗(yàn)中，F(xiàn)T-/-動(dòng)物的殺傷功能未嚴(yán)重受損(圖1c)。因此，在FT-/-動(dòng)物中，I類-限制性抗原-特異性效應(yīng)CTL的產(chǎn)生存在嚴(yán)重的和特異性的缺陷。
除了強(qiáng)CTL反應(yīng)外，痘苗病毒感染引發(fā)天然殺傷(NK)細(xì)胞功能，由NK細(xì)胞，CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素，并引發(fā)強(qiáng)體液免疫應(yīng)答15。盡管CD8+CTL反應(yīng)可能是正常動(dòng)物中保護(hù)作用的主要介體16，17，但在缺乏CD8+T細(xì)胞的小鼠以及CTL機(jī)制的重要組分缺損的小鼠中，穿孔素能清除vv，這表明NK細(xì)胞功能，γ干擾素分泌和正?？贵w反應(yīng)能補(bǔ)償抗-病毒CTL的缺乏15，18-20。FT-/-小鼠中的這些參數(shù)無缺損(未顯示)。因此，盡管抗-病毒CTL的產(chǎn)生嚴(yán)重缺損，F(xiàn)T-/-小鼠仍能按照與野生型小鼠類似的方式清除vv(未顯示)。這些結(jié)果表明α(1，3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶缺損選擇性地影響效應(yīng)CTL的產(chǎn)生。我們進(jìn)一步分析了這些小鼠以闡明其CTL反應(yīng)缺損的原因。
FT-/-小鼠的淋巴細(xì)胞歸巢至外周淋巴結(jié)的能力嚴(yán)重受損1，21，這表明由于內(nèi)臟淋巴結(jié)外周的T細(xì)胞致敏缺損，反過來導(dǎo)致脾臟中vv-特異性CTL的水平降低，從而可能在FT-/-小鼠中無法發(fā)現(xiàn)抗-病毒CTL。還有一種可能是，由于運(yùn)輸至腹膜腔的T細(xì)胞減少，使得FT-/-小鼠的PEL沒有可測的CTL。為了闡明這些可能性，我們比較了得自野生型和FT-/-小鼠的脾細(xì)胞和PEL的T細(xì)胞亞型表現(xiàn)度及其激活狀況。得自野生型和FT-/-小鼠的脾細(xì)胞和PEL具有比例相當(dāng)?shù)腃D4+和CD8+T細(xì)胞(圖2a)。另外，CD4+和CD8+T細(xì)胞位于表現(xiàn)出相似水平的L-選擇素，LFA-1和CD44的PEL和脾臟中(圖2b)。相對于野生型小鼠而言，從FT-/-小鼠腹膜腔中所回收細(xì)胞的絕對數(shù)目平均減少50％，這說明細(xì)胞運(yùn)輸至腹膜腔的過程存在一些缺陷。然而，這并不能解釋FT-/-小鼠的CTL功能缺損，因?yàn)樵跍y定E∶T比例的CTL試驗(yàn)中，總細(xì)胞數(shù)目等于野生型小鼠的總細(xì)胞數(shù)。因此，盡管在CTL試驗(yàn)中檢測到數(shù)目相似的激活CD8+T細(xì)胞，在FT-/-小鼠中仍檢測不到病毒-特異性細(xì)胞毒性。這些結(jié)果暗指在FT-/-小鼠中，脾臟和PEL中的CD8+細(xì)胞被激活，但它們不能介導(dǎo)細(xì)胞裂解功能。
在類似于病毒感染的炎癥疾病過程中，除了抗原-特異性細(xì)胞外，非-特異性的T細(xì)胞也可被激活并運(yùn)送至入侵位點(diǎn)22，23。然而，使用TCR轉(zhuǎn)基因小鼠和MHC-肽四聚體的最新數(shù)據(jù)表明大多數(shù)激活細(xì)胞實(shí)際上是抗原-特異性的24-26。為了測定脾臟和PEL中激活的CD8+T細(xì)胞是否是抗原-特異性的，可使被感染小鼠的細(xì)胞免疫磁性耗盡CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并檢測vv-特異性增殖。野生型和FT-/-CD8+T細(xì)胞對vv刺激作出反應(yīng)，進(jìn)行大體相當(dāng)?shù)模禺愋缘脑鲋?圖2c)。由于T細(xì)胞增殖需要產(chǎn)生IL-2，此結(jié)果表明FT-/-CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生可能無缺損。我們還分析了經(jīng)vv-刺激的主要CD8+T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，野生型和FT-/-CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素-γ大體相當(dāng)(圖2d)。這些結(jié)果表明FT-/-小鼠中病毒-特異性CD8+T細(xì)胞的產(chǎn)生，其病毒-特異性的增殖和細(xì)胞因子釋放沒有改變。
為了測定FT-/-小鼠中效應(yīng)CTL的缺乏是否是缺損的選擇素或是選擇素配體功能的結(jié)果，我們檢測了L-，P-和E-選擇素三重缺損的小鼠在vv感染之后產(chǎn)生抗病毒CTL的能力。三重選擇素缺損小鼠與野生型小鼠類似，與FT-/-小鼠不同，表現(xiàn)出強(qiáng)有力的CTL活性(圖3)。因此，F(xiàn)T-/-小鼠中效應(yīng)CTL產(chǎn)生的缺陷與選擇素功能缺損不相關(guān)，而是選擇素配體功能的結(jié)果。
總體看來，我們的結(jié)果表明FT-/-小鼠中細(xì)胞毒性的產(chǎn)生受損，F(xiàn)T-/-小鼠中α(1，3)-巖藻糖基化缺陷可能導(dǎo)致缺乏CTL效應(yīng)子功能。因此，我們推理T細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞(APC)上的Fuc-T-依賴型巖藻糖基化結(jié)構(gòu)可能是產(chǎn)生/介導(dǎo)CTL效應(yīng)子功能所必需的。PSGL-1是APC和T細(xì)胞上表達(dá)的顯著的α(1，3)-巖藻糖基化糖蛋白27。在FT-/-小鼠中，該分子為功能缺損的分子1，2，它代表CTL激活所需的Fuc-T-依賴型分子的一個(gè)候選者。因此，我們研究了可溶性重組PSGL-1和PSGL-1功能阻斷抗體2PH-1在體外再刺激得自野生型小鼠的致敏的病毒-特異性CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)。用vv感染野生型小鼠，在感染后第7天，在缺乏或存在可溶性PSGL-1或其非-巖藻糖基化突變體和，或阻斷PSGL-1的單克隆抗體(2PH-1)5或?qū)φ湛贵w(抗-L選擇素Mel14或抗-人PSGL-1抗體PL-128)時(shí)，用vv體外刺激小鼠的脾細(xì)胞。相對于對照抗體而言，受試的可溶性PSGL-1和能阻斷功能的抗-鼠PSGL-1抗體，而不是非-巖藻糖基化的可溶性PSGL-1或?qū)φ湛贵w能部分抑制病毒-特異性CTL的產(chǎn)生(圖4a，4b，數(shù)據(jù)未顯示)。然而，當(dāng)在CTL試驗(yàn)過程中加入時(shí)，可溶性PSGL-1或抗-鼠PSGL-1抗體都沒有抑制作用(未顯示)。因此，α(1，3)-巖藻糖基化PSGL或密切相關(guān)的分子似乎為產(chǎn)生功能性CTL所必需，而不是裂解靶細(xì)胞所必需。
為了測定APC或T細(xì)胞上是否需要該巖藻糖基化分子，我們想知道野生型APC是否能激活vv-致敏的FT-/-CD8+T細(xì)胞的裂解功能，或者FT-/-APC激活致敏野生型CD8+T細(xì)胞的CTL的能力是否受損。用vv感染野生型和FT-/-小鼠，在感染后第7天，選擇脾臟CD8+T細(xì)胞，用T細(xì)胞耗盡的，經(jīng)vv-感染的，γ-照射的野生型FT-/-脾細(xì)胞進(jìn)行刺激。當(dāng)用野生型APC刺激時(shí)，在野生型和FT-/-CD8+細(xì)胞中都能檢測到細(xì)胞裂解功能，而FT-/-APC不能對野生型或FT-/-小鼠的CD8+細(xì)胞產(chǎn)生CTL活性(圖4c)。因此，類似于PSGL-1并由APC表達(dá)的巖藻糖基化分子似乎是產(chǎn)生效應(yīng)CTL所必需的。
總的說來，我們的結(jié)果表明APC-CD8 T細(xì)胞通過α(1，3)-巖藻糖基化分子的相互作用是產(chǎn)生抗原-特異性CD8 CTL效應(yīng)子功能所必需的，但不是抗原-特異性CD8 T細(xì)胞增殖或細(xì)胞因子分泌所必需的?？?鼠PSGL-1以及可溶性PSGL-1抑制野生型CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)子功能，而在選擇素-缺損的小鼠中未觀察到類似缺陷，這一事實(shí)表明需要PSGL-1識別與選擇素不同的反受體。盡管PSGL-1最初被鑒定為P選擇素的配體，但目前看來，糖類修飾顯然對其結(jié)合具有意義深遠(yuǎn)的作用。是激活的Ta1細(xì)胞，而不是靜息T細(xì)胞或激活的Th-2細(xì)胞結(jié)合P-選擇素，盡管所有這些細(xì)胞類型所表達(dá)的PSGL-1量相當(dāng)29。賦予對HECA 452(抗皮膚淋巴細(xì)胞抗原(CLA)的抗體)的結(jié)合能力的糖類修飾調(diào)制PSGL-1與E-選擇素的結(jié)合30。我們的結(jié)果暗示了以下的可能性，即存在另一種不依賴于選擇素的PSGL-1受體。受體的鑒定可能會(huì)導(dǎo)致對效應(yīng)CTL產(chǎn)生機(jī)制的深入研究，并提供選擇性修飾CTL殺傷功能的工具，修飾的目的是增強(qiáng)CTL殺傷功能以抗病毒感染和腫瘤，或者是為了抑制自身免疫病中的CTL殺傷功能。


-圖1FT-/-小鼠產(chǎn)生病毒-特異性效應(yīng)CTL的能力嚴(yán)重受損，但實(shí)際上仍具有正常的LAK和SEA誘導(dǎo)的CTL活性。1a.通過4小時(shí)Cr釋放試驗(yàn)，檢測被vv皮下感染的野生型或FT-/-小鼠的脾細(xì)胞，和被vv腹膜內(nèi)感染的小鼠的脾細(xì)胞&PEL對被vv感染的MC57G(H2b)靶的細(xì)胞裂解。1b.通過與被vv感染的自身脾細(xì)胞保溫5天，體外再刺激被vv腹膜內(nèi)感染的小鼠的脾細(xì)胞，并檢測抗病毒的細(xì)胞毒性。對所有試驗(yàn)而言，計(jì)算特異性殺傷百分比時(shí)需減去未被感染的MC57G靶的背景殺傷(＜3％)。1c.在200IU/ml重組IL-S的存在下體外培養(yǎng)脾細(xì)胞3天并檢測其對Yac-1靶細(xì)胞的裂解(LAK活性)，或者在10μg/ml SEA的存在下培養(yǎng)脾細(xì)胞，選擇CD8+細(xì)胞，檢測其裂解被SEA包被的Raji細(xì)胞的能力。

-圖2FT-/-小鼠產(chǎn)生激活的CD8+T細(xì)胞，該細(xì)胞可以增殖并以病毒-特異性的方式產(chǎn)生細(xì)胞因子。通過流式細(xì)胞術(shù)分析被vv感染的小鼠的脾細(xì)胞和PEL，所述細(xì)胞被與FTTC-綴合的小鼠Thy1.2，CD4或CD8單克隆抗體(2a)染色，或者被CD8 FTTC或PE和CD62-LFTTC，CD11αFTTC或CD44 PE(2b)雙染色。對2c和d而言，vv感染小鼠的脾細(xì)胞被免疫磁性耗盡CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并如圖1c所述被vv刺激。3天后，檢測培養(yǎng)物上清液的IFN-γ水平(2c)，用3H胸苷脈沖細(xì)胞3小時(shí)，計(jì)數(shù)3H摻入(2d)。顯示了3對小鼠的平均+/-SEM。

-圖3FT-/-而不是選擇素-/-小鼠不能產(chǎn)生病毒-特異性效應(yīng)CTL。用vv感染野生型小鼠和L-，P-和E-選擇素缺損的小鼠，按圖1所述，在感染后第7天檢測其脾細(xì)胞的抗病毒細(xì)胞毒性。

-圖4
可溶性PSGL-1和抗-鼠PSGL-1抗體能在體外抑制致敏野生型CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)CTL。在缺乏或存在(20μg/ml)可溶性重組PSGL-1或非-巖藻糖基化PSGL-1(無活性的PSGL-1)(4a)或抗-鼠PSGL-1抗體2PH-1，或抗-人PSGL-1抗體PL-1(4b)時(shí)，用vv刺激經(jīng)痘苗病毒感染后7天從野生型小鼠體內(nèi)收集的脾細(xì)胞。5天后測定病毒-特異性細(xì)胞毒性。4c.FT-/-APC消除，野生型APC恢復(fù)效應(yīng)CTL的產(chǎn)生。用vv感染野生型和FT-/-小鼠，在感染后第7天，正選擇CD8+T細(xì)胞(效應(yīng)器)，并用經(jīng)vv感染和γ-照射的野生型或FT-/-APC(耗盡T細(xì)胞的脾細(xì)胞)進(jìn)行刺激。5天后，測定病毒-特異性細(xì)胞毒性。
方法痘苗病毒感染。在血液研究中心的SPF條件下維持FTIV和VII-/-，L-，P-和E-選擇素-/-小鼠及其野生型相應(yīng)小鼠。研究中使用了性別相配的6至8周齡小鼠。用vv的WR毒株(ATCC)在尾根部皮下或腹膜內(nèi)感染小鼠(溶于0.2ml PBS中，105pfu/小鼠)。
細(xì)胞毒性試驗(yàn)。為了檢測病毒-特異性細(xì)胞毒性，在感染后第7天，通過用3ml PBS沖洗以收集腹膜溢泌液細(xì)胞，和/或收集脾臟。通過在0.17M氯化銨中裂解以耗盡脾細(xì)胞和PEL的RBC，按早先的描述檢測細(xì)胞殺傷經(jīng)51Cr標(biāo)記的MC57G靶的能力31，所述靶未經(jīng)感染或被vv所感染。為了進(jìn)行LAK試驗(yàn)，在200IU/ml重組IL2的存在下培養(yǎng)正常小鼠的脾細(xì)胞，3天后，檢測細(xì)胞殺傷經(jīng)51Cr標(biāo)記的Yac-1靶的能力。為了進(jìn)行SEA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性試驗(yàn)，在10μg/ml SEA(Sigma)的存在下培養(yǎng)脾細(xì)胞，選擇CD8T細(xì)胞(見下文)，檢測其裂解被SEA包被的Raji細(xì)胞的能力(在檢測前用100ng/ml SEA包被30分鐘)。細(xì)胞毒性被定義為(試驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)×100。從經(jīng)感染/包被靶的殺傷百分?jǐn)?shù)中減去未經(jīng)感染靶(vv細(xì)胞毒性)或未經(jīng)包被靶(SEA誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性)的殺傷百分?jǐn)?shù)，以計(jì)算出病毒-特異性的細(xì)胞毒性。
抗體染色，流式細(xì)胞術(shù)和免疫磁性耗盡。為了測定T細(xì)胞亞型的數(shù)目，獨(dú)自用與FTTC-綴合的抗-小鼠CD3，CD4或CD8單克隆抗體(Pharmingen)染色脾細(xì)胞和PEL。通過用PE CD8×FTTC Mel-14，F(xiàn)TTCCD11α或FTTCCD8×PE CD44(Pharmingen)雙重染色，分析被定義為L-選擇素低，LFA-1高和CD44高的激活CD8+T細(xì)胞。為了耗盡CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，用純化的大鼠抗-小鼠CD4和NK1.1抗體染色細(xì)胞，洗滌，并與被山羊抗大鼠IgG包被的磁性珠(Dunai，10個(gè)珠/細(xì)胞)保溫。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)測定，耗盡的群體含有＜3％CD4或NK細(xì)胞。
在體外用vv再刺激。對APC而言，使用被抗-CD3包被的Dynal珠耗盡用痘苗病毒感染后6至7天收集的脾細(xì)胞中的T細(xì)胞，用vv感染(10pfu/細(xì)胞，37℃2小時(shí))，照射(400拉德)和按文獻(xiàn)32所述用UV-處理。在24孔培養(yǎng)板中將5×106個(gè)感染細(xì)胞與5×106個(gè)自身未感染脾細(xì)胞一起培養(yǎng)4至5天，然后檢測CTL活性。在一些實(shí)驗(yàn)中，按上述耗盡CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞。在一些其它的實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)廠商說明，使用CD8+milteny珠正選擇CD8+細(xì)胞。在一些實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行體外刺激時(shí)，以20μg/ml的終濃度加入可溶性重組pSGL-1Ig嵌合體，其非-巖藻糖基化變體(無活性的PSGL-1)(遺傳研究所，Cambridge，MA饋贈(zèng))，抗-鼠PSGL-1抗體2PH-1，抗-人PSGL-1抗體PL-1(贈(zèng)品)和抗-鼠L-選擇素抗體Mel-14(贈(zèng)品)。
淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ分析。在96孔板的三份孔中將2×105個(gè)按上述耗盡了CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的脾細(xì)胞與相同數(shù)目的，未經(jīng)感染或經(jīng)vv感染的，經(jīng)γ-照射的脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。刺激3天后，收集50μl上清液進(jìn)行IFN-γ分析，用3H胸苷(0.5μCi/孔)脈沖培養(yǎng)物6至8小時(shí)，按文獻(xiàn)27所述收集并計(jì)數(shù)3H摻入。根據(jù)廠商方法，使用經(jīng)IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)的IFN-γ微量分析試劑盒(Antigen，MA，USA)分析上清液中的IFN-γ。
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實(shí)施例2α(1，3)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FT-IV和FT-VII雙重缺損的小鼠(FT-/-小鼠)的白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上缺乏功能性的選擇素配體。此處，我們研究了FT缺損對CD8+T細(xì)胞對痘苗病毒感染之反應(yīng)的影響。相對于野生型小鼠而言，F(xiàn)T-/-小鼠產(chǎn)生了顯著較少的細(xì)胞毒T細(xì)胞，但兩個(gè)小鼠品系的感染位點(diǎn)所積累的CD8+T細(xì)胞的數(shù)目差不多，該細(xì)胞能進(jìn)行強(qiáng)有力的病毒-特異性增殖。這種CTL產(chǎn)生的缺陷不是選擇素-依賴型T細(xì)胞運(yùn)輸受損所致，因?yàn)長-，P-和E-選擇素三重缺損的小鼠能產(chǎn)生正常的抗病毒細(xì)胞毒性。與野生型APC共保溫可在FT-/-和野生型小鼠的致敏CD8+T細(xì)胞中誘導(dǎo)CTL活性，而FT-/-APC在任一種品系中都不能誘導(dǎo)CTL的產(chǎn)生?？?P-選擇素糖蛋白配體(PSGL)-1和與α(1，3)-巖藻糖基化PSGL-1/Ig嵌合體共保溫能抑制野生型APC產(chǎn)生CTL，而非-巖藻糖基化PSGL-1/Ig沒有此效應(yīng)。這些結(jié)果表明了PSGL-1和APC上可能存在的其它巖藻糖基化分子的新功能，即由抗原-特異性CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生CTL，這與它們結(jié)合選擇素的能力有所不同。
細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)是抗病毒感染的抗原-特異性宿主防御的重要介體。在CTL反應(yīng)增長之前，原初CD8+T細(xì)胞必須首先遭遇次級淋巴器官中專門的抗原-呈遞細(xì)胞(APC)上的病毒抗原。被抗原-激活的T細(xì)胞增殖幾天，最后遷移至病毒感染位點(diǎn)。最后，它們獲得了效應(yīng)子功能，即殺傷其它細(xì)胞的能力，所述細(xì)胞能表達(dá)I類MHC相關(guān)抗原，并能產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子，尤其是干擾素(IFN)-γ。因此，CTL反應(yīng)依賴于血管內(nèi)和血管外區(qū)室中白細(xì)胞的靶向移動(dòng)(歸巢)。攜有抗原的APC起初必須由感染位點(diǎn)遷移至具有機(jī)體構(gòu)造的淋巴組織。在這里，它們刺激由血液中歸巢至這些器官的原初T細(xì)胞。隨后，被激活的T細(xì)胞必須尋找它們返回血流的路徑，并由此進(jìn)入感染的外周組織。
白細(xì)胞遷移至很多淋巴和非淋巴器官需要3種選擇素(L-，E-和P-選擇素，CD62)中的一種或多種及其配體的協(xié)同作用，所述選擇素及其配體在內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞上相互表達(dá)(1-3)。選擇素通過與唾液酸-路易斯x(sLeX)和相關(guān)糖類結(jié)合來介導(dǎo)白細(xì)胞在微管中的滾動(dòng)，所述糖類常出現(xiàn)在唾液粘蛋白支架上，如PSGL-1(4，5)。與選擇素結(jié)合的糖類的重要方面是唾液酸化核心-2聚糖中的一個(gè)或多個(gè)N-乙酰基-葡糖胺殘基的α(1，3)-巖藻糖基化。迄今為止，已在哺乳動(dòng)物中鑒定出5種不同的α(1，3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FT)，但白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞僅表達(dá)FT-IV和FT-VII(6)。FT-VII缺損小鼠依賴于選擇素的白細(xì)胞滾動(dòng)和往急性炎癥位點(diǎn)的遷移也存在缺陷，歸巢至淋巴結(jié)的淋巴細(xì)胞顯著減少(7)。與之形成對照的是，F(xiàn)T-IV-/-小鼠的白細(xì)胞滾動(dòng)僅有輕微的缺陷，而FT-IV+VII雙重缺損(FT-/-)的小鼠具有比FT-VII-/-動(dòng)物更嚴(yán)重的表型(8)。
已在很多背景中記載了選擇素的重要性，所述背景包括急性炎癥，動(dòng)脈粥樣硬化和對外周抗原攻擊的皮膚過敏反應(yīng)(有關(guān)評論可參見2，4，5)。另外，據(jù)記載，在抗原識別之后，功能性的PSGL-1在很多T細(xì)胞上被上調(diào)，這是它們征集至發(fā)炎的腹膜所必需的(9)。相應(yīng)地，P-和E-選擇素抗體嚴(yán)重?fù)p害了CD4和CD8T細(xì)胞征集至小鼠急性炎癥位點(diǎn)(9)。然而，目前仍不清楚在體內(nèi)病毒感染的過程中，選擇素及其配體是如何影響T細(xì)胞征集和免疫應(yīng)答的。特別是，仍未檢驗(yàn)這些分子在針對病毒抗原攻擊的CTL反應(yīng)過程中的作用。為了解決這一問題，我們將痘苗病毒腹膜內(nèi)(i.p.)注射至FT-/-小鼠和L-，E-和P-選擇素三重缺損(選擇素-/-)的動(dòng)物(10)。已證實(shí)痘苗病毒能在野生型小鼠中誘導(dǎo)急性感染，導(dǎo)致產(chǎn)生強(qiáng)有力的T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，無需在體外重新刺激，直接由新分離的脾細(xì)胞和腹膜溢泌液淋巴細(xì)胞(PEL)即可闡明病毒-特異性細(xì)胞毒性(11)。
所有野生型和基因缺損的動(dòng)物都能在感染中存活，在感染后(p.i.)10天內(nèi)病毒水平變得檢測不到，這表明選擇素和被FT-IV和/或FT-VII修飾的糖類不是清除病毒所必需的。然而，針對痘苗病毒的免疫應(yīng)答是多層面的。除了強(qiáng)CTL反應(yīng)外，痘苗病毒感染引發(fā)了天然殺傷(NK)細(xì)胞功能，由NK細(xì)胞，CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，并引發(fā)強(qiáng)體液免疫應(yīng)答(11-17)。盡管CD8+CTL是正常動(dòng)物中的保護(hù)作用的主要介體(13)，但缺乏CD8+T細(xì)胞的小鼠以及穿孔素(CTL機(jī)制的重要組分)缺損的小鼠仍能清除痘苗病毒感染(12，15，17)。因此，F(xiàn)T或選擇素缺損的小鼠中的正常病毒清除并不排除這些分子在產(chǎn)生，遷移或行使抗-病毒CTL中的作用。
因此，我們分析了得自感染后第7天的野生型和敲除小鼠的外周血單核細(xì)胞(PBMC)，PEL和脾細(xì)胞的數(shù)目，組成和功能。與野生型小鼠相比，選擇素-/-和FT-/-小鼠的外周血和脾臟中具有更高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(表1)。這些結(jié)果與闡明選擇素在血細(xì)胞生成和白細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的作用的早期研究(7，8，10，18)相符。盡管所有品系中的CD4+T細(xì)胞在血液和脾臟中出現(xiàn)的頻率差不多，但在選擇素-/-和FT-/-小鼠中，這些區(qū)室中的CD8+T細(xì)胞組分和總細(xì)胞計(jì)數(shù)都有所提高。然而，在感染位點(diǎn)(腹膜)，白細(xì)胞數(shù)目大體相當(dāng)，從野生型和突變小鼠的PEL中回收到相似數(shù)目的CD4+和CD8+T細(xì)胞。所有品系的PEL中，最常見的亞型是CD8+T細(xì)胞，這可能反映了痘苗病毒感染中CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的顯性(13)。我們得出結(jié)論在此感染模型中，選擇素-配體的相互作用不是T細(xì)胞遷移至發(fā)炎的腹膜腔中所必需的。
表1也顯示出在血液，脾臟以及表達(dá)激活標(biāo)記(L-選擇素L0和CD44Hi)的PEL中存在等量的T細(xì)胞組分，這表明缺乏選擇素或其配體時(shí)也會(huì)正常出現(xiàn)抗原-特異性T細(xì)胞致敏。在諸如病毒感染的炎癥疾病過程中，不僅僅是抗原-特異性T細(xì)胞，一些非-特異性的旁觀者細(xì)胞也可被激活并運(yùn)輸至感染位點(diǎn)(19，20)。然而，使用TCR轉(zhuǎn)基因小鼠和MHC-肽四聚體的最新數(shù)據(jù)表明大多數(shù)激活細(xì)胞實(shí)際上是抗原-特異性的(21-23)。因此，選擇素-/-和FT-/-小鼠中的T細(xì)胞可能被暴露于痘苗病毒抗原，在選擇素不為歸巢所必需的脾臟內(nèi)更是如此(7，24)。
為了測定經(jīng)感染動(dòng)物中激活的CD8+T細(xì)胞究竟有多少是痘苗病毒-特異性效應(yīng)細(xì)胞，我們檢測了經(jīng)感染小鼠的PEL(在感染后第7天獲得)的病毒-特異性CTL活性(25)。選擇素-/-小鼠的PEL以類似于野生型對照的水平特異性裂解被病毒感染的靶細(xì)胞。與之形成對照的是，F(xiàn)T-/-小鼠的PEL T細(xì)胞表現(xiàn)出顯著降低的細(xì)胞毒性水平(11只動(dòng)物)，或者檢測不到CTL活性(5只動(dòng)物)(圖5A)。這一觀察結(jié)果表明體內(nèi)產(chǎn)生抗-病毒CTL活性需要的是FT，而不是選擇素。為了測定FT包括一種酶還是兩種酶，我們還檢測了僅有FT-IV缺損或僅有FT-VII缺損的小鼠。相對于野生型小鼠而言，這兩個(gè)品系具有顯著降低的CTL活性，但與FT-IV-/-小鼠相比，F(xiàn)T-VII-/-小鼠中的降低更加顯著(未顯示)。在FT-IV/FT-VII雙重缺損的小鼠中，CTL活性的降低最為顯著，這表明引發(fā)最佳的CTL活性必需這兩種酶。在另外的實(shí)驗(yàn)中，我們還檢測了P-或L-選擇素單缺損(26，27)或P-和E-選擇素雙缺損(18)的小鼠。在所有這些品系中，痘苗病毒-特異性CTL活性與野生型對照差不多，所述品系各衍生自獨(dú)立的ES細(xì)胞克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。
由于淋巴細(xì)胞運(yùn)輸受損看起來不象是FT-/-小鼠中CTL令人驚奇地減少的原因，我們提出了兩種其它假設(shè)。首先，F(xiàn)T-/-T細(xì)胞可能無法探測痘苗病毒抗原或與之反應(yīng)。另外，抗原-特異性FT-/-T細(xì)胞可能存在并被激活，但它們不能殺傷靶細(xì)胞。為了檢測FT-/-小鼠中的CD8+T細(xì)胞是否能識別得自痘苗病毒的抗原并與之反應(yīng)，免疫磁性耗盡脾細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并檢測痘苗病毒-特異性增殖。致敏小鼠的CD8+T細(xì)胞對抗原攻擊的反應(yīng)是進(jìn)行快速而特異性地增殖(圖5B)。FT-/-小鼠的CD8+T細(xì)胞和選擇素-/-或WT動(dòng)物的CD8+T細(xì)胞之間沒有區(qū)別。因此，針對抗原的增殖性T細(xì)胞反應(yīng)不需要FT，但在以后，當(dāng)激活的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)CTL時(shí)卻需要FT。
在獨(dú)立的研究中，我們還證實(shí)痘苗病毒-特異性CD8+T細(xì)胞的CTL活性與細(xì)胞對TCR參與作出反應(yīng)產(chǎn)生IFN-γ的能力密切相關(guān)(28)。實(shí)際上，當(dāng)用抗-CD3處理致敏FT-/-CD8+T細(xì)胞時(shí)，與平行刺激的野生型和選擇素-/-CD8+細(xì)胞相比，該細(xì)胞產(chǎn)生的該效應(yīng)細(xì)胞因子的量顯著減少(圖5C)。有趣的是，F(xiàn)T-/-CD4+細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ也有所減少，這表明FT缺損不只是影響CD8+亞型(數(shù)據(jù)未顯示)，因此，F(xiàn)T-/-CD8+細(xì)胞缺乏效應(yīng)細(xì)胞的至少兩個(gè)與眾不同的性質(zhì)CTL活性和產(chǎn)生IFN-γ。這些發(fā)現(xiàn)使我們提出以下假設(shè)FT可能是引發(fā)一個(gè)或多個(gè)決定性事件所必需的，所述事件必須在激活的T細(xì)胞產(chǎn)生分化的效應(yīng)細(xì)胞之前發(fā)生。
I類限制性CTL的產(chǎn)生需要CD8+T細(xì)胞與APC的相互作用。因此，我們想知道T細(xì)胞或APC是否需要FT來促進(jìn)CTL分化。我們用得自FT-/-動(dòng)物的APC(即T細(xì)胞-耗盡的，經(jīng)痘苗病毒感染的，γ-照射的脾細(xì)胞)再刺激得自野生型小鼠的純化的致敏T細(xì)胞，并且反過來用得自野生型小鼠的APC(即T細(xì)胞-耗盡的，經(jīng)痘苗病毒感染的，γ-照射的脾細(xì)胞)再刺激得自FT-/-動(dòng)物的純化的致敏T細(xì)胞(29)。在遭遇由野生型APC呈遞的痘苗病毒抗原的野生型和FT-/-T細(xì)胞中，可再現(xiàn)地誘導(dǎo)了細(xì)胞裂解活性，而FT-/-APC不能在野生型或FT-/-小鼠的CD8+細(xì)胞上引發(fā)CTL活性(圖6)。
這些結(jié)果強(qiáng)烈地暗示APC上的一種或多種α(1，3)巖藻糖基化分子誘導(dǎo)激活的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生CTL。一種候選分子被認(rèn)為是PSGL-1。唾液粘蛋白表達(dá)于骨髓和淋巴細(xì)胞表面，包括樹狀細(xì)胞的很多白細(xì)胞上的FT可對其進(jìn)行修飾(有關(guān)評論見文獻(xiàn)5)。PSGL-1蛋白以正常水平表達(dá)于FT-/-白細(xì)胞上，但由于其缺乏用作選擇素配體所需的巖藻糖基化，因此它在功能上是有缺陷的(8和未顯示數(shù)據(jù))。為了評估巖藻糖基化PSGL-1是否參與CTL分化，我們采取了兩種方法。首先，我們從被痘苗病毒感染7天的野生型小鼠中收集致敏脾細(xì)胞，在針對鼠PSGL-1N末端(氨基酸42至60)的單克隆抗體2PH-1的存在下，用野生型APC再刺激細(xì)胞5天(30，31)。該單克隆抗體顯著抑制CTL的產(chǎn)生，而針對鼠L-選擇素的單克隆抗體Mel-14沒有作用(圖7A)。其次，我們在可溶性蛋白質(zhì)的存在下，將致敏的CD8+T細(xì)胞暴露于被痘苗病毒感染的野生型APC，所述蛋白質(zhì)由與人Ig重鏈相連接的40個(gè)人PSGL-1N-末端氨基酸組成(PSGL-1/Ig)(33)。重組PSGL-1/Ig可在用核心-2酶和FT-VII共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中產(chǎn)生，以產(chǎn)生裝飾有sLeX-樣糖類的PSGL-1/Ig，或者也可由僅表達(dá)核心-2酶而不表達(dá)FT-VII的細(xì)胞產(chǎn)生(模擬FT-/-小鼠中的非-巖藻糖基化PSGL-1)。與巖藻糖基化的PSGL-1/Ig共保溫能部分阻斷病毒-特異性CTL的產(chǎn)生，而非-巖藻糖基化PSGL-1/Ig沒有此作用(圖7B)。重要的是，PSGL-1抑制劑只有在APC刺激T細(xì)胞的過程中出現(xiàn)時(shí)才有效。當(dāng)僅在CTL試驗(yàn)的過程中加入時(shí)，抗-PSGL-1和巖藻糖基化PSGL-1/Ig都不能抑制靶細(xì)胞裂解(未顯示)。
這些發(fā)現(xiàn)闡明了α(1，3)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FT-IV和FT-VII在APC中的新的生理學(xué)作用。我們的數(shù)據(jù)表明FT通過裝飾APC表面表達(dá)的糖蛋白來發(fā)揮其中樞作用，所述糖蛋白之一是PSGL-1。由于抗-PSGL-1和PSGL-1/Ig僅能部分有效地阻斷致敏野生型CD8+細(xì)胞體外產(chǎn)生CTL，不能排除APC上存在可發(fā)揮相似作用的其它巖藻糖基化分子。然而，單克隆抗體2PH-1起初是針對類似于鼠PSGL-1N末端的合成肽產(chǎn)生的，并且被選擇用于阻斷P-選擇素/PSGL-1相互作用(30)。選擇素-/-小鼠中的CTL活性正常，這一發(fā)現(xiàn)表明激活的CD8+細(xì)胞表達(dá)PSGL-1的反受體，它肯定與已知的選擇素有所不同。因此，假定的受體可能以不能被單克隆抗體2PH-1完全抑制的方式與PSGL-1結(jié)合。在任何事件中，我們的結(jié)果表明對APC上的FT或PSGL-1或者T細(xì)胞上推定的PSGL-1受體進(jìn)行操作可以有用地控制CD8+效應(yīng)T細(xì)胞的產(chǎn)生。經(jīng)證實(shí)這是進(jìn)一步了解體內(nèi)CTL的產(chǎn)生和功能的強(qiáng)有力的工具。另外，我們的發(fā)現(xiàn)提供了一種治療與CTL異常產(chǎn)生或CTL功能異常相關(guān)的人類病理學(xué)疾病的新方法。例如，選擇性修飾此重要步驟的能力可用于在病毒感染過程中增強(qiáng)CTL殺傷功能，或者用于對抗腫瘤，而CTL受抑對治療自身免疫病有利。
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24.M.L.Arbones，D.C.Old，K.Ley，H.Ratech，C.Maynard-Curry，G.Otten，D.J.Capon，T.F.Tedder.免疫1，247(1994)25.用vv的WR毒株(ATCC)(溶于0.2ml PBS中，105pfu/小鼠)在尾根部皮下或腹膜內(nèi)感染野生型，F(xiàn)T-/-和選擇素-/-小鼠(6至8周齡，性別匹配)。在感染后第7天，通過用3ml PBS沖洗以收集PEL，和/或收集脾臟。通過在0.17M氯化銨中裂解以耗盡脾細(xì)胞和PEL的RBC，在標(biāo)準(zhǔn)的鉻釋放試驗(yàn)中檢測細(xì)胞殺傷經(jīng)51Cr標(biāo)記的MC57G靶的能力，所述靶未經(jīng)感染或被vv所感染。細(xì)胞毒性被定義為(試驗(yàn)釋放-自發(fā)釋放)/(最大釋放-自發(fā)釋放)×100％。從經(jīng)感染靶的殺傷百分?jǐn)?shù)中減去未經(jīng)感染靶的殺傷百分?jǐn)?shù)，以計(jì)算出病毒-特異性的細(xì)胞毒性。
26.T.N.Mayadas，R.C.Johnson，H.Raybum，R.O.Hynes，D.D.Wagner.細(xì)胞74，541，(1993).
27.M.D.Catalina，M.C.Carroll，H.A.Arizpe，A.Takashima，P.Estess，M.H.Siegleman.實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志.184，2341(1996).
28.N.Manjunath，P.Shankar，3.Lieberman，U.H.von Andrian.已提交29.用vv腹膜內(nèi)感染小鼠，7天后，根據(jù)廠商說明，使用抗-CD8抗體-包被的milteny珠正選擇CD8+T細(xì)胞。對APC而言，使用被抗-CD3包被的milteny珠耗盡脾細(xì)胞中的T細(xì)胞，用vv感染(10pfu/細(xì)胞，37℃2小時(shí))，照射(400拉德)和按文獻(xiàn)34所述用UV-處理。在24孔培養(yǎng)板中將2×106個(gè)得自野生型或FT-/-小鼠的CD8+T細(xì)胞與5×105個(gè)野生型和FT-/-APC一起培養(yǎng)4至5天，然后檢測CTL活性。
30.E.Borges，R.Eytner，R，T.Moll，M.Steegmaier，A.Matthew，I.P.Campbel，K.Ley，H.Mossmann，D.Vestweber.血液90，1934(1997).
31.用vv腹膜內(nèi)感染野生型小鼠，7天后，按參考文獻(xiàn)29所述，在24孔板中用vv-感染的APC再刺激脾CD8+T細(xì)胞。在進(jìn)行體外刺激時(shí)，以20μg/ml的終濃度在一些培養(yǎng)物中加入可溶性重組pSGL-lIg嵌合體，其非-巖藻糖基化變體，抗-鼠PSGL-1抗體2PH-1或抗-鼠L-選擇素抗體Mel-14。培養(yǎng)5天后測定病毒-特異性細(xì)胞毒性。
32.W.M.Gallatin，I.L.Weissman，E.C Butcher.自然304，30(1983).
33.M.K.Takada，K.C.Nadeau，G.D.Shaw，K.A.Marquette，Tilney.J.Clin.Invest.99，2682(1997).
34.P.Shankar，J.Fabry，J.Lieberman.Immunol.Invest.24，489(1995).
表和

表1野生型，選擇素-/-和FT-/-小鼠的PEL，脾臟和外周血中的總白細(xì)胞計(jì)數(shù)，T細(xì)胞亞型頻率和CD8+T細(xì)胞的激活狀態(tài)。通過腹膜內(nèi)注射痘苗病毒(105pfu/小鼠)以感染小鼠，感染后第7天，取尾血以獲得外周血，收集PEL和脾臟。裂解RBC之后，使用血細(xì)胞計(jì)對所有樣品進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)。為了測定T細(xì)胞亞型的比例，用與FITC綴合的抗-CD4和與PE綴合的抗-CD8標(biāo)記細(xì)胞等分試樣，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法在流式細(xì)胞儀(FACScan，Becton Dickinson)上進(jìn)行分析。為了測定激活狀態(tài)，用抗-CD8 FITC和抗-L-選擇素PE或抗-CD8 FITC和抗-CD44 PE標(biāo)記細(xì)胞。所顯示的是L-選擇素低或CD44高的CD8+T細(xì)胞的百分比。未顯示出選擇素-/-小鼠的L-選擇素水平，因?yàn)樗屑?xì)胞皆為L-選擇素陰性。顯示出每組中6只小鼠的平均+/-SD。
圖5在FT-/-小鼠中，抗-病毒CTL活性和IFN-γ的產(chǎn)生而不是病毒-特異性增殖顯著降低。5A.FT-/-小鼠而不是選擇素-/-小鼠中的CTL活性降低。用vv腹膜內(nèi)感染野生型，三重選擇素-/-和FT-/-小鼠，7天后，檢測其PEL裂解經(jīng)vv感染，51Cr標(biāo)記的MC57G靶細(xì)胞的能力(25)。顯示了具有4個(gè)不同效應(yīng)子靶(E∶T)比例的16個(gè)野生型，16個(gè)FT-/-和10個(gè)選擇素-/-小鼠的散射圖。每個(gè)符號表示單個(gè)動(dòng)物的細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的(三次測定)平均百分比。5B.選擇素-/-和FT-/-小鼠中的病毒-特異性增殖差不多。用vv感染小鼠，7天后，免疫磁性耗盡其脾細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞和NK細(xì)胞。在96孔板的三份孔中將2×105個(gè)耗盡的脾細(xì)胞與相同數(shù)目的，未經(jīng)感染或經(jīng)vv感染的，T細(xì)胞-耗盡的和經(jīng)γ-照射的脾細(xì)胞一起培養(yǎng)。刺激2天后，用3H胸苷(0.5μCi/孔)脈沖培養(yǎng)物6至8小時(shí)，收集并計(jì)數(shù)3H摻入。顯示的是每個(gè)品系3只小鼠的平均cpm+/-S.D。5C.在FT-/-小鼠而不是選擇素-/-小鼠中誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生。在布雷菲德菌素A的存在下，用1μg/mlαCD3刺激感染后7天所得的PEL達(dá)6小時(shí)，用抗-CD8 Cychrome染色，固定，透化，然后使用細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒(Pharmingen)用抗-IFN-γPE染色，再在流式細(xì)胞儀中進(jìn)行分析。所顯示的是每個(gè)品系的1只小鼠的代表性結(jié)果(檢測了3只動(dòng)物，結(jié)果相似)。
圖6APC上需要α(1，3)-巖藻糖基化PSGL-1來誘導(dǎo)激活的CD8+細(xì)胞中的CTL活性。用vv感染野生型和FT-/-小鼠，7天后，免疫磁性選擇其脾CD8+T細(xì)胞，用vv-感染的野生型或FT-/-APC(T細(xì)胞耗盡的，γ-照射的脾細(xì)胞)進(jìn)行刺激。按圖5和參考文獻(xiàn)25所述培養(yǎng)5天之后測定細(xì)胞毒性。所顯示的是每個(gè)品系2只小鼠的結(jié)果。
圖7在PSGL-1阻斷抗體的存在下，或在重組α(1，3)-巖藻糖基化PSGL-1的存在下，特異性地減弱對致敏野生型CD8+T細(xì)胞中CTL活性的再次刺激。用vv感染野生型小鼠，7天后，收集脾細(xì)胞，在缺乏或存在20μg/ml阻斷抗-PSGL-1抗體，2PH-1或?qū)φ湛?L-選擇素抗體Mel-14(7A)時(shí)，或在可溶性重組巖藻糖基化或非-巖藻糖基化PSGL-1-Ig(7B)的存在下，用vv刺激脾細(xì)胞。按圖5和參考文獻(xiàn)25所述培養(yǎng)5天之后測定細(xì)胞毒性。7A顯示的是4只小鼠的結(jié)果，7B顯示的是3只小鼠的結(jié)果。
聲明此項(xiàng)工作得到了國立衛(wèi)生研究院基金HL54936，HL02881和HL41484的支持。
表1

權(quán)利要求
1.抑制哺乳動(dòng)物受試者的激活的T-細(xì)胞分化為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述PSGL拮抗劑選自可溶形式的PSGL，抗PSGL抗體，抗sLex抗體，抗硫酸化酪氨酸抗體，sLex，抑制sLex結(jié)合的模擬物和小分子的PSGL結(jié)合抑制劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述PSGL拮抗劑是可溶形式的PSGL。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述PSGL拮抗劑是抗PSGL抗體。
5.治療或緩解自身免疫病的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述PSGL拮抗劑選自可溶形式的PSGL，抗PSGL抗體，抗sLex抗體，抗硫酸化酪氨酸抗體，sLex，抑制sLex結(jié)合的模擬物和小分子的PSGL結(jié)合抑制劑。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述PSGL拮抗劑是可溶形式的PSGL。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述PSGL拮抗劑是抗PSGL抗體。
9.治療或緩解變應(yīng)性反應(yīng)的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述PSGL拮抗劑選自可溶形式的PSGL，抗PSGL抗體，抗sLex抗體，抗硫酸化酪氨酸抗體，sLex，抑制sLex結(jié)合的模擬物和小分子的PSGL結(jié)合抑制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述PSGL拮抗劑是可溶形式的PSGL。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述PSGL拮抗劑是抗PSGL抗體。
13.治療或緩解哮喘的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述PSGL拮抗劑選自可溶形式的PSGL，抗PSGL抗體，抗sLex抗體，抗硫酸化酪氨酸抗體，sLex，抑制sLex結(jié)合的模擬物和小分子的PSGL結(jié)合抑制劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述PSGL拮抗劑是可溶形式的PSGL。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述PSGL拮抗劑是抗PSGL抗體。
17.權(quán)利要求3的方法，其中所述可溶形式的PSGL含有PSGL成熟氨基酸序列前19個(gè)氨基酸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述可溶形式的PSGL含有PSGL成熟氨基酸序列前47個(gè)氨基酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述47個(gè)氨基酸與免疫球蛋白鏈的Ig部分融合。
20.權(quán)利要求7的方法，其中所述可溶形式的PSGL含有PSGL成熟氨基酸序列前19個(gè)氨基酸。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述可溶形式的PSGL含有PSGL成熟氨基酸序列前47個(gè)氨基酸。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述47個(gè)氨基酸與免疫球蛋白鏈的Ig部分融合。
23.權(quán)利要求11的方法，其中所述可溶形式的PSGL含有PSGL成熟氨基酸序列前19個(gè)氨基酸。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述可溶形式的PSGL含有PSGL成熟氨基酸序列前47個(gè)氨基酸。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述47個(gè)氨基酸與免疫球蛋白鏈的Ig部分融合。
全文摘要
本發(fā)明公開了抑制哺乳動(dòng)物受試者的激活的T－細(xì)胞分化為細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞的方法,所述方法包括給受試者施用治療有效量的PSGL拮抗劑。
文檔編號C07K16/28GK1342085SQ99815217
公開日2002年3月27日 申請日期1999年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月30日
發(fā)明者N·曼朱納斯, U·翰斯馮安德里安 申請人:遺傳研究所有限公司, Cbr實(shí)驗(yàn)室有限公司