一種抑制血管新生或生長的融合蛋白及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種抑制血管新生或生長的融合蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002] 在正常生理條件下，血管的生成是一個受多個環(huán)節(jié)嚴密調(diào)節(jié)的過程，對修復(fù)和維 持機體的正常功能具有重要的作用。然而，如果腫瘤內(nèi)部血管快速生長，則是臨床常見的現(xiàn) 象之一。大量的動物模型和人體臨床試驗表明，阻斷腫瘤內(nèi)新生血管的形成可以有效地阻 止腫瘤的生長和引發(fā)腫瘤細胞的死亡，從而達到對腫瘤的治療作用。因此，抑制血管新生是 目前抗腫瘤新藥研宄的重要方向之一。大分子抗新生血管藥物如Avastin已經(jīng)過美國FDA 的上市批準，同時還有更多的藥物處于不同的臨床前和臨床研宄階段。另外，對于老年性視 網(wǎng)膜血管病變（Age-related macular degeneration，簡稱為AMD)、糖尿病視網(wǎng)膜病變、關(guān) 節(jié)炎等多種與血管新生相關(guān)的疾病，抑制血管新生的治療新藥也有廣泛和重要的作用。
[0003] 血管新生是一個由多種活性生物因子進行調(diào)控的復(fù)雜過程，其中一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)是 內(nèi)皮細胞表面受體與多種生長因子相結(jié)合從而被激活，然后經(jīng)細胞內(nèi)酪氨酸磷酸化的信號 傳遞系統(tǒng)控制內(nèi)皮細胞活動，從而促使血管新生。在多種生長因子中，血管內(nèi)皮細胞生長因 子（Vascular endothelial cell growth factor，簡稱為VEGF)是控制血管新生最重要的 因子，是誘導(dǎo)和促進血管形成作用最強、最專一的血管生長因子，在幾乎所有的人體腫瘤中 都過量表達，是抗癌研宄的一個重要分子靶標。VEGF在血管內(nèi)皮細胞表面上有多種受體，其 中包括VEGFR-I (又稱為Flt-I)和VEGFR-2 (又稱為KDR或Flk-I)，它們的細胞外部分均由 七個可與VEGF相結(jié)合的免疫球蛋白樣區(qū)域（D1-D7)組成，細胞內(nèi)部分均包括酪氨酸激酶基 團。當受體被VEGF激活后，細胞內(nèi)的酪氨酸激酶基團發(fā)生磷酸化，并導(dǎo)致一系列的信號傳 遞，最終引發(fā)血管新生。由于VEGF信號傳遞對血管新生的重要性，阻斷VEGF或VEGF受體 從而達到抑制血管新生具有重要的抗癌作用，同時也對其他包括視網(wǎng)膜血管病變等與血管 新生相關(guān)的疾病有著重要的治療作用。
[0004] 融合蛋白藥物的穩(wěn)定性對于生物技術(shù)應(yīng)用具有重要影響，也是提高藥物質(zhì)量以及 藥物能夠工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)在某些物理和化學(xué)因素作用下其特定的空間構(gòu)象被改 變，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性。變性作用是 蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素的影響，改變其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的作用。蛋白熱穩(wěn)定檢測能 夠有效的確定蛋白的變性，從而用于蛋白質(zhì)藥物研發(fā)過程中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的檢測，其主要 是采用紫外激發(fā)光照射蛋白質(zhì)樣品使其發(fā)射出熒光，由于蛋白質(zhì)所發(fā)射熒光的波長和光強 度與其結(jié)構(gòu)的變化是一一對應(yīng)的，所以據(jù)此可以精確地檢測出蛋白質(zhì)樣品的變性溫度Tm。 另外，同時采用紫外激發(fā)光應(yīng)用靜態(tài)光散射（Static Light Scattering)技術(shù)檢測蛋白質(zhì) 的聚集狀況，蛋白質(zhì)樣品聚集和非聚集狀態(tài)下其光強度有非常顯著的變化，所以據(jù)此可以 精確的檢測出蛋白質(zhì)樣品的聚集溫度Tagg(aggregation onset temperature);蛋白的變 性溫度Tm和聚集溫度Tagg能夠有效的反映生物蛋白分子的穩(wěn)定性。
[0005] 生物大分子藥物開發(fā)過程中制約因素包括藥物療效、藥物的穩(wěn)定性、藥物是否能 夠工業(yè)化生產(chǎn)等等，尋求一種療效確切、穩(wěn)定性高的抑制血管新生或生長的藥物是十分必 要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種療效確切、穩(wěn)定性高的抑制血管新生或生長的融合蛋 白，該融合蛋白通過阻斷VEGF信號傳遞，從而抑制血管新生或生長。
[0007] 為了達到上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明一方面提供一種抑制血管新生或生長的融合蛋白，該融合蛋白由人VEGF 受體片段與人免疫球蛋白Fc片段連接而形成，其中所述VEGF受體片段的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:5 所示。
[0009] 在進一步的實施方式中，所述融合蛋白的人免疫球蛋白Fc片段選自如下序列之 一 ：IgGlFc(氨基酸序列為SEQ ID N0:7)、IgG2Fc(氨基酸序列為SEQ ID N0:8)、IgG3Fc(氨 基酸序列為SEQ ID NO:9)和IgG4Fc(氨基酸序列為SEQ ID NO: 10)。
[0010] 在更進一步的實施方式中，本發(fā)明的融合蛋白為：
[0011] KH02,其氨基酸如 SEQ ID NO: 14 所示；
[0012] KH03,其氨基酸如SEQ ID NO: 16所示；或
[0013] KH04,其氨基酸如 SEQ ID NO: 18 所示。
[0014] 在另一方面，本發(fā)明提供編碼所述融合蛋白的核苷酸序列；優(yōu)選地，所述核苷酸序 列為：
[0015] kh02,編碼融合蛋白KH02,其核苷酸如SEQ ID NO: 13所示；
[0016] kh03,編碼融合蛋白KH03,其核苷酸如SEQ ID NO: 15所示；或
[0017] kh04,編碼融合蛋白KH04,其核苷酸如SEQ ID N0:17所示。
[0018] 在另一方面，本發(fā)明提供一種表達所述融合蛋白的表達載體或宿主細胞，所述表 達載體包含上述融合蛋白的核苷酸序列。所述表達載體可以是重組真核表達載體，優(yōu)選哺 乳動物細胞表達載體；也可以是重組病毒表達載體，優(yōu)選腺相關(guān)病毒或腺病毒載體。所述表 達載體能在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中復(fù)制表達，優(yōu)選地，所述宿主細胞為CHO細胞及其亞系或293 細胞及其亞系。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明提供一種制備所述融合蛋白的方法，包括將上述表達載體引 入合適的宿主細胞中，進行融合蛋白的表達。
[0020] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括本發(fā)明的融合蛋白和藥學(xué)上可 接受的載體或賦形劑；所述載體或賦形劑為本領(lǐng)域常規(guī)使用的載體或賦形劑。優(yōu)選地，所述 藥物組合物的制劑形式為注射劑、注射用凍干粉針或眼用凝膠；可以用本領(lǐng)域已知的方法 制備所述制劑。
[0021] 在另一方面，本發(fā)明提供了上述融合蛋白在制備治療由血管新生或生長引起的疾 病的藥物中的用途；其中所述由血管新生或生長引起的疾病優(yōu)選為腫瘤或眼部新生血管引 起的疾病，所述眼部新生血管引起的疾病優(yōu)選為年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病視網(wǎng)膜病變、 脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變等。
[0022] 本發(fā)明融合蛋白的熱穩(wěn)定性高，使得其在發(fā)酵過程中的蛋白聚合體形成率明顯下 降，顯著提高了蛋白純度和產(chǎn)量，同時本發(fā)明的融合蛋白具有較優(yōu)的生物學(xué)活性。
【附圖說明】
[0023] 圖1為VEGF受體融合蛋白的熱變性傾向性檢測結(jié)果圖；圖中曲線反映蛋白分子內(nèi) 在熒光峰值隨溫度升高情況，其中，縱坐標BCM(nm)為內(nèi)在熒光峰值，橫坐標為溫度。
[0024] 圖2為VEGF受體融合蛋白的熱聚合傾向性檢測結(jié)果圖；圖中曲線反映蛋白分子的 靜態(tài)光散射強度隨溫度變化情況，其中，縱坐標SLS at 266nm為靜態(tài)光散射強度，橫坐標為 溫度。
[0025] 圖3為VEGF受體融合蛋白抑制VEGF誘導(dǎo)HUVEC細胞增殖作用結(jié)果圖；其中，橫坐 標為融合蛋白濃度，縱坐標為CCK-8法檢測細胞活力的吸光值。
[0026] 圖4為VEGF受體融合蛋白抑制VEGF誘導(dǎo)HUVEC細胞迀移作用結(jié)果圖；其中，橫 坐標為融合蛋白與VEGF的摩爾濃度比，縱坐標為占總迀移的百分比總迀移率=(F fusim _in-Fbasal) AF t(rtal-Fbasal)，U培養(yǎng)基組的熒光均值，F(xiàn) total指VEGF組的熒光均值， Ffusim _ein指不同摩爾比的融合蛋白與VEGF組的熒光均值。
【具體實施方式】
[0027] 現(xiàn)通過以下實施例對本發(fā)明作進一步闡釋。應(yīng)當理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明而非對本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說明書的啟示下對本發(fā)明實施中所作 的任何變動都將落在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0028] 序列說明：
[0029] 人VEGF受體片段1 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 1，核苷酸序列為SEQ ID NO: 2 ;
[0030] 人VEGF受體片段2 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 3,核苷酸序列為SEQ ID NO: 4;
[0031] 人VEGF受體片段3 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 5,核苷酸序列為SEQ ID NO: 6 ;
[0032] 融合蛋白KHOl :氨基酸序列為SEQ ID NO: 12,核苷酸序列為SEQ ID NO: 11 ;
[0033] 融合蛋白KH02 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 14,核苷酸序列為SEQ ID NO: 13 ;
[0034] 融合蛋白KH03 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 16,核苷酸序列為SEQ ID NO: 15 ;
[0035] 融合蛋白KH04 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 18,核苷酸序列為SEQ ID NO: 17。
[0036] 融合蛋白KH05 :氨基酸序列為SEQ ID NO: 20,核苷酸序列為SEQ ID NO: 19。
[0037] 實施例1:融合蛋白的制備
[0038] 材料或試劑
[0039] PCR 試劑盒（含 5 X 緩沖液、dNTP 和 Phusion 酶）：M0530L，NEB 公司
[0040] 瓊脂糖凝膠電泳：IQ300, GE公司
[0041] 緩沖液 4 (lot :0101201) :NEB 公司
[0042] Avr II : ROl 74L，NEB 公司
[0043] BstZ17I :R0594L，NEB 公司
[0044] PCR產(chǎn)物純化試劑盒：QIAGEN公司，CAT: 28106
[0045] 10 X T4 緩沖液：B0202S，NEB 公司
[0046] T4DNA 連接酶：M0202L，NEB 公司
[0047] ToplO 大腸桿菌：CB104, TIANGEN 公司
[0048] 2YT (AMP)平板培養(yǎng)基：上海銳聰實驗室設(shè)備有限公司
[0049] Freedom?CH〇-STMKit 試劑盒：A13696-01，LIFE TECHNOLOGIES 公司
[0050] Clone Pix FL :Genetix 公司
[0051] HiTrap蛋白A瓊脂糖親和層析柱：HiTrap蛋白A HP，5x Iml ;GE公司
[0052] PBS緩沖液（20mM磷酸鹽，pH 7. 4) :SD117-500ml，上海生物工程有限公司
[0053] ForteBio生物分子相互作用儀：0ctet QKe, Pall公司
[0054] 蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性分析儀：0ptim2, Avacta公司
[0055] VEGF :R&D 公司
[0056] NHS-LCLC-Biotin :Thermo 公司
[0057] 1、包含融合蛋白編碼序列的質(zhì)粒的構(gòu)建
[0058] 1.1基因和引物合成
[0059] 由北京金唯智公司合成合成片段1(SEQ ID NO: 21)和2 (SEQ ID NO: 22)以及引 物Pl-PlO(序列分別如SEQ ID N0:23-32所示），并將合成片段1和2重組至質(zhì)粒載體 pUC19(北京金唯智公司）中。合成片段1包括編碼人VEGF受體片段的核苷酸序列和信號 肽序列，合成片段2包含人IgGlFc的編碼序列。合成片段1和2作為構(gòu)建各融合蛋白的模 板，利用下述引物通過PCR方法構(gòu)建出本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列。
[0060] 1. 2融合蛋白編碼序列的獲得
[0061] 每種融合蛋白的編碼序列分為兩個部分進行擴增，第一部分為人VEGF受體片段， 第二部分為人IgGlFc片