一種抗b細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體和用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 淋巴瘤屬原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴組織的惡性腫瘤，有淋巴細(xì)胞和（或）組織細(xì)胞的 大量增生，占我國常見惡性腫瘤的第八位，且年輕化趨勢(shì)明顯，近年發(fā)病率由2-4/10萬升 至6. 91/10萬，并以每年5%的速度上升，每年新發(fā)患者約5萬人，死亡人數(shù)超過2萬。一般 認(rèn)為霍奇金淋巴瘤主要來源于B細(xì)胞，大多數(shù)的非霍奇金淋巴瘤也來源于B細(xì)胞，因此通過 清除B細(xì)胞治療淋巴瘤已成為一種新的治療方案。
[0003] 臨床研究發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤等惡性B細(xì)胞可以合成和分泌一種名為B淋巴細(xì)胞刺激因 子（B cells-activating fact BAFF)的蛋白，屬腫瘤壞死因子超家族成員，其可與表達(dá)在B 細(xì)胞表面的受體結(jié)合，進(jìn)而激活NF-kB途徑，誘導(dǎo)抗細(xì)胞凋亡基因：Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)， 減少成熟B細(xì)胞的凋亡。不同亞型B-細(xì)胞淋巴瘤患者血清可溶性BAFF含量較正常對(duì)照者 是明顯升高的，且BAFF血漿水平與基因變異及疾病的進(jìn)展、嚴(yán)重程度及治療敏感性呈正相 關(guān)關(guān)系。
[0004] 納米抗體是由羊駝血液中發(fā)現(xiàn)的缺失輕鏈的重鏈抗體，經(jīng)比利時(shí)科學(xué)家應(yīng)用分子 生物學(xué)技術(shù)結(jié)合納米粒子科學(xué)的方法，而研發(fā)出來的最新及分子量最小的抗體分子。其具 有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，穿透力強(qiáng)，易于純化和表達(dá)，親和力及穩(wěn)定性高，無毒副反應(yīng)等一系列優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 目前尚未有針對(duì)BAFF的納米抗體的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗BAFF的納米抗體及其編碼基因序列。
[0007] 本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供抗BAFF的納米抗體的用途。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] 一種抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體，其氨基酸序列為序列表SEQ ID NO. 1 所示。該序列包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)；互補(bǔ)決定區(qū)為CDRl-CDR3 ;框架區(qū)為分別為 FR1-FR4 ;互補(bǔ)決定區(qū)具有選自下組的氨基酸序列，具體為：
[0010] CDRl的氨基酸序列：MSAVA
[0011] CDR2 的氨基酸序列：VAAISKSSISTYYADSVKG
[0012] CDR3 的氨基酸序列：NSALNGRLPGRH
[0013] 框架區(qū)的FR1-FR4的氨基酸序列，具體為：
[0014] FRl 的氨基酸序列：QVQLVDSGGGLVKAGGSLRLSCAASGRTFS
[0015] FR2 的氨基酸序列：WFRQAPGKEREF
[0016] FR3 的氨基酸序列：RFTISRDNARNTVNLQMNSLKPEDTAVYYC
[0017] FR4 的氨基酸序列：WGQGTQVTVSS
[0018] 所述抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體其氨基酸組成順序：FR1，⑶Rl，F(xiàn)R2,⑶R2， FR3, CDR3, FR4。（序列表SEQ ID NO. 1)命名為抗BAFF納米抗體G3。
[0019] 所述的抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體，其氨基酸序列與序列表SEQ ID NO. 1 所不的氨基酸序列的同源性大于80%，優(yōu)選大于90%，最優(yōu)選大于95%。
[0020] -種多肽，選自上述納米抗體，或稱單域抗體片段，或稱結(jié)構(gòu)域抗體片段，或"dAb， VHJHH'
[0021] 編碼上述抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體的基因序列。
[0022] 所述基因序列為序列表SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的抗BAFF納米抗體可變區(qū)中特異性核苷酸或氨基酸序列，可在體外 人工合成與此相同的抗體輕重鏈基因的核苷酸序列或編碼相同氨基酸的核苷酸序列，從而 獲得相同的抗體基因或用于相關(guān)基因的改造，而獲得抗BAFF納米抗體或相關(guān)蛋白或多肽 產(chǎn)物。
[0024] 包含所述基因序列的表達(dá)載體。載體可以為原核細(xì)胞表達(dá)載體、真核細(xì)胞表達(dá)載 體或昆蟲細(xì)胞表達(dá)載體。
[0025] 包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞可以為原核表達(dá)細(xì)胞、真核表達(dá) 細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，所述原核表達(dá)細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌。
[0026] 通過所述宿主細(xì)胞制備抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體的方法。
[0027] 藥用組合物，其包含一種或多種所述的抗BAFF納米抗體分子作為活性成份，并包 含可藥用載劑。
[0028] 所述藥物載劑選自細(xì)胞毒素、放射性同位素、免疫調(diào)諧劑、抗血管生成劑、抗增殖 劑、促凋亡劑、化學(xué)治療劑或治療性核酸的治療劑。
[0029] 所述藥物組合物也可以采用包含包裝的藥物試劑盒的形式提供，所述包裝包含在 分開容器內(nèi)的或在單一容器內(nèi)的一種或多種所逸拮抗劑。
[0030] 所述的抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體用于制備檢測(cè)BAFF的試劑的用途。包 括但不限于用于雙抗體夾心酶標(biāo)免疫檢測(cè)BAFF ELISA試劑中的捕獲抗原用納米抗體包被 ELISA板和檢測(cè)抗原用的生物素標(biāo)記納米抗體。
[0031] 所述的抗B細(xì)胞生長刺激因子的納米抗體用于制備治療BAFF表達(dá)異常相關(guān)疾病 的藥物的用途；所述BAFF表達(dá)異常相關(guān)疾病為B細(xì)胞非霍奇金氏淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma)、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、涉及B細(xì)胞的自身免疫病或炎性疾 病。
[0032] 本發(fā)明構(gòu)建了 BAFF胞外區(qū)多肽重組基因克隆的pET30a表達(dá)載體，獲得帶有His 標(biāo)簽的BAFF胞外區(qū)（BAFFE⑶）高純化蛋白，與能高親和力結(jié)合帶有His標(biāo)簽蛋白的Ni+磁 珠結(jié)合，展示多肽的正確空間結(jié)構(gòu)，以此形式的抗原免疫羊駝，構(gòu)建特異性的納米抗體基因 庫(納米抗體噬菌體展示基因庫)，篩選免疫納米抗體基因庫，而獲得了 B細(xì)胞刺激因子的 特異性的納米抗體(或稱單域抗體片段，single domainantibody fragment),將此基因與 表達(dá)載體連接重組，構(gòu)建了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株anti-BAFFG3。在實(shí)驗(yàn) 室進(jìn)行搖瓶小規(guī)模生產(chǎn)，經(jīng)Ni+樹脂凝膠親和層析純化，可得到SDS-PAGE電泳純達(dá)95%，約 100mg/L細(xì)菌培養(yǎng)物的納米抗體。
[0033] 本發(fā)明涉及了針對(duì)BAFF的不同形式納米抗體(單體、雙體或五聚體)、制備B細(xì) 胞生長刺激因子（BAFF)的納米抗體的所有技術(shù)(技術(shù)參考：Tanha J，Dubuc G，Selection by phage display of llama conventional V(H) fragments with heavy chainantibody V(H)H properties. J Immunol Methods. 2002, 263(1-2):97-109) (Gueorguieva DjLi S. Identifi