本發(fā)明涉及一種從人尿中大規(guī)模收集尿蛋白的方法，主要適用于人尿蛋白、人尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶、人尿激酶等尿蛋白原料粗制品的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
人尿液中的人體蛋白與人血白蛋白的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性質(zhì)相同，是同一物質(zhì)(Poortmars,J.etal.,Biochemica et Biophysica Acta,43(1966),380-389)。盡管尿液中白蛋白濃度很低，只有約10-20mg/L，但巨量的尿液來源，使其中的白蛋白含量也成為一個巨量。
醫(yī)藥界從人尿液中提取蛋白質(zhì)的做法由來已久，最有代表性的尿蛋白產(chǎn)品是尿激酶和人尿激肽原酶。提取尿激酶等尿蛋白的傳統(tǒng)方法是，在男性成人排尿處設(shè)置容器收集原尿液，運(yùn)輸?shù)郊庸c(diǎn)機(jī)構(gòu)集中進(jìn)行后續(xù)處理。在人口密度較高的城市的公共廁所收集尿液，收集與運(yùn)輸成本相對高，面且在收集、運(yùn)輸過程中很難避免尿液拋灑，對城市衛(wèi)生造成一定的影響。
目前，國內(nèi)外生產(chǎn)尿蛋白，均需先收集尿液，再提取尿蛋白，成本高、對環(huán)境有影響，再加上創(chuàng)建文明衛(wèi)生城市和城市衛(wèi)生化改造，尿液收集的難度越來越大，這嚴(yán)重影響了尿蛋白產(chǎn)品的市場發(fā)展。因此，尿蛋白原料的制備方法亟待突破，克服目前的限制。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種從人尿中大規(guī)模收集尿蛋白的方法，該方法適合規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)尿蛋白，提高尿蛋白的處理批量，在吸附有尿蛋白的吸附劑處理之前，進(jìn)行了相應(yīng)的預(yù)處理，保證了尿蛋白的活性，減少了尿蛋白的降解和微生物的滋生，提高了尿蛋白產(chǎn)品的質(zhì)量。
由于尿蛋白不穩(wěn)定，容易變性失活、甚至降解，且吸附尿蛋白的樹脂，也很容易出現(xiàn)微生物的大量滋生，所以，樹脂必須在收集后盡快解吸，而時間對處理的批量有極大的相關(guān)性。從收集到處理的時間短，就需要將剛收集的吸附劑及時運(yùn)輸?shù)郊庸S，運(yùn)輸?shù)呐啃?，單次處理批量小，蛋白變性或降解較少、微生物滋生較輕，但運(yùn)輸成本和生產(chǎn)成本極高，規(guī)模也嚴(yán)重受限；從收集到處理的時間跨度長，需要將收集后的吸附劑積累到一定數(shù)量后運(yùn)輸?shù)郊庸S，單次處理批量大，運(yùn)輸成本和生產(chǎn)成本低，但蛋白變性或降解嚴(yán)重、微生物滋生嚴(yán)重，難以生產(chǎn)出合格的產(chǎn)品。
未解決上述問題，本發(fā)明具體技術(shù)方案是：
一種從人尿中大規(guī)模收集尿蛋白的方法，包括以下步驟：
a)將分裝好用于吸附尿蛋白的吸附劑裝置放置在尿液流經(jīng)處，使尿液流經(jīng)吸附劑使尿蛋白被吸附；
b)收集和更換吸附尿蛋白的吸附劑；
c)對吸附有尿蛋白的吸附劑進(jìn)行預(yù)處理，防止吸附劑內(nèi)的尿蛋白失活或降解，減少微生物的滋生；
d)預(yù)處理后的吸附劑冷藏儲存；
e)將吸附有尿蛋白的吸附劑大批量冷藏運(yùn)至工廠進(jìn)行尿蛋白解吸處理，生產(chǎn)加工相應(yīng)的尿蛋白原料或尿蛋白制品。
步驟a)所述吸附劑裝置采用離子交換劑作為尿液流經(jīng)過濾裝置，將分裝好的用于吸附尿蛋白的吸附劑放置在尿液流經(jīng)部位，用于吸附收集尿蛋白；該尿液過濾裝置為通透性較好的尼龍濾布制作，置放于尿斗內(nèi)或小便槽內(nèi)，用以承接尿液從過濾裝置流過；尿液過濾裝置的形狀、大小與小便尿斗或小便槽相適應(yīng)；定時回收和更換尿液過濾裝置，對其中的離子交換劑作集中提前解吸，收集含尿蛋白的組份，并對離子交換劑作再生處理備作再用。
該方法在大量沖水的環(huán)境中也能有效吸附尿蛋白，收集過程對周圍環(huán)境沒有明顯影響，因此，在對環(huán)境衛(wèi)生要求較高的場所也可以進(jìn)行尿蛋白的收集，因此，尿蛋白可收集范圍大幅度擴(kuò)大。
所述的吸附劑為樹脂，為陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂，陰陽離子混合樹脂或者同時具有陽離子交換基團(tuán)和陰離子交換基團(tuán)的兩性樹脂。作為優(yōu)選采用大孔型樹脂。
樹脂骨架為聚苯乙烯、聚丙烯酸、酚醛樹脂、瓊脂糖任意一種或幾種：配基為磺酸基、羧酸基、磷酸基陽離子交換基團(tuán)和伯胺、仲胺、叔胺和季胺基離子基團(tuán)。作為優(yōu)選采用大孔型樹脂。
在吸附等電點(diǎn)低于6.0的蛋白時，采用配基為季胺基的大孔型聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸樹脂；在吸附等電點(diǎn)高于7.0的蛋白時，采用配基為-SO3-的大孔型聚丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂；同時吸附等電點(diǎn)低于6.0的蛋白和等電點(diǎn)高于7.0的蛋白時可采用陰陽離子混合型樹脂或者同時具有陽離子交換基團(tuán)和陰離子交換基團(tuán)的兩性樹脂。如人尿胰蛋白酶抑制劑、人尿激肽原酶為等電點(diǎn)低于6.0的蛋白，在尿液中容易與季胺基結(jié)合；尿激酶為等電點(diǎn)高于7.0的蛋白在尿液中容易與-SO3-結(jié)合。
選用50-300目的尼龍濾布制作的袋子作為分裝樹脂的濾袋。
作為優(yōu)選，60目的尼龍濾布制作的濾袋，透水性好且保證了樹脂不流失。
樹脂在廁所的放置時間如果較短，吸附的蛋白量較少，如果放置時間較長，蛋白可能變性、降解等，作為優(yōu)選，放置在廁所中的時間為24小時。
步驟c)在將吸附有尿蛋白的吸附劑處理或儲存之前，對吸附劑進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理，防止尿蛋白變性失活、降解，減少了微生物的滋生，便于將吸附劑積累到足夠數(shù)量時再運(yùn)往加工廠，降低了運(yùn)輸成本，同時也也提高了生產(chǎn)設(shè)備的單次生產(chǎn)批量，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，實現(xiàn)從人尿中生產(chǎn)尿蛋白的規(guī)?；a(chǎn)業(yè)，解決尿蛋白無法規(guī)?；a(chǎn)和生產(chǎn)成本較高的難題。
步驟c)吸附尿蛋白的吸附劑預(yù)處理方法為：用大量清水對吸附劑進(jìn)行沖洗、浸泡和脫水，用于去除吸附劑表面和內(nèi)部的殘留尿液、微生物、尿垢。清水沖洗和浸泡可以使清水進(jìn)入吸附劑的內(nèi)部，脫水可以將吸附劑內(nèi)部的殘留尿液、微生物、尿垢等有可能破壞尿蛋白產(chǎn)品質(zhì)量的物質(zhì)甩出，對吸附劑可以采用離心機(jī)或者脫水機(jī)進(jìn)行脫水；脫水后的吸附劑冷藏儲存，在低溫環(huán)境中防止尿蛋白變性降解，減少了微生物的滋生，增長了吸附劑內(nèi)的存儲時間，便于收集足夠多的吸附有尿蛋白的吸附劑運(yùn)至加工廠，降低了運(yùn)輸成本，保證尿蛋白質(zhì)量。
步驟c)在清水浸泡之前進(jìn)行高壓水流沖洗，主要是去除尿垢，一般的水流沖洗，很難去除附著在樹脂表面的尿垢，更難去除大孔型樹脂內(nèi)部網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中殘留的尿液，高壓水流沖洗，可以對吸附劑上的尿垢產(chǎn)生足夠多的沖擊和震動力，提高了尿垢的清除，有利于將殘留尿液、微生物和尿垢的去除。
步驟c)的預(yù)處理方法還可以是低溫下，采用預(yù)處理液浸泡，然后清水清洗，再脫水。
其中，所述預(yù)處理液可以是緩沖液，所述緩沖液為磷酸、磷酸鈉、磷酸氫鈉或磷酸二氫鈉中的一種或兩種以上的混合物；浸入緩沖液1～3分鐘后，清洗，晾干。
其中所述預(yù)處理液還可以是尿素溶液，優(yōu)選濃度為20％的尿素溶液，加入方式為低溫下加入，浸入緩沖液1～3分鐘后，清洗，晾干。
其中所述預(yù)處理液還可以是稀堿液，所述稀堿溶液為氫氧化鈉或碳酸鈉中的一種或兩種組成的溶液，濃度為0.01～0.02g/L；加入方式為低溫下加入，浸入稀堿溶液中3～30s后，清洗，晾干。
收集的吸附尿蛋白的樹脂預(yù)處理后放置在0～5℃的冷庫中冷藏，積累到一定數(shù)量后再冷藏運(yùn)輸?shù)侥虻鞍咨a(chǎn)工廠進(jìn)行后續(xù)的加工處理，生產(chǎn)相應(yīng)的尿蛋白產(chǎn)品，如人尿胰蛋白酶抑制劑原料、尿激酶原料、人尿激肽酶原料等產(chǎn)品。
步驟d)的冷藏溫度不高于5℃，優(yōu)選為0～5℃。
步驟e)在運(yùn)輸吸附劑時采用冷藏運(yùn)輸，運(yùn)輸溫度不高于10℃，優(yōu)選為0～10℃。采用冷藏運(yùn)輸可以抑制微生物的生長，抑制尿蛋白的變性失活和降解，保證了尿蛋白的質(zhì)量。
在環(huán)境溫度高于20℃時加冰冷卻。加冰冷卻可以抑制微生物的生長，抑制尿蛋白的變性失活和降解，保證質(zhì)量。樹脂從收集、高壓水流沖洗、清水浸泡清洗到脫水這一階段，需要全程溫度控制，控制在20℃以下，在氣溫高于20℃時，可以使用冰塊加入清水中來降低樹脂的溫度。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
較以尿液收集為核心的傳統(tǒng)尿蛋白生產(chǎn)工藝，本發(fā)明可實現(xiàn)規(guī)?；虻鞍椎脑诰€吸附，無需收集尿液，直接吸附尿蛋白。對收集環(huán)境無明顯影響，可大規(guī)模擴(kuò)展尿蛋白的收集范圍。
在將吸附有尿蛋白的吸附劑儲存之前，對吸附劑進(jìn)行預(yù)處理，防止尿蛋白變性失活、降解，減少了微生物的滋生，保證了最后生產(chǎn)出來的尿蛋白的質(zhì)量，便于將吸附劑積累到足夠數(shù)量時再運(yùn)往加工廠，減少了運(yùn)輸成本，同時也提高了生產(chǎn)設(shè)備的單次生產(chǎn)批量，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率，實現(xiàn)了從人尿中生產(chǎn)尿蛋白的規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化，解決了尿蛋白無法規(guī)?；a(chǎn)和生產(chǎn)成本較高的難題，為尿蛋白藥品的售價降低提供有力的基礎(chǔ)。
采取高壓水流清洗，結(jié)合清洗水浸泡、脫水，實現(xiàn)離子交換樹脂內(nèi)位有效的清潔，可更好的抑制微生物的生長。
全程的溫度控制，尿蛋白處于低溫存儲的狀態(tài)，抑制微生物的活性和生長，避免了尿蛋白的變形和活性喪失。
整個過程以較低的成本，實現(xiàn)了尿蛋白活性的有效保存和微生物生長的有效抑制，工藝容易放大，為規(guī)?；占於嘶A(chǔ)；由于實現(xiàn)了規(guī)?；僮?，質(zhì)量可控制更強(qiáng)，產(chǎn)品質(zhì)量更穩(wěn)定。
發(fā)明人分別使用多種陰離子交換劑對不同稀釋度尿液進(jìn)行白蛋白吸附實驗，表明，本發(fā)明方法對尿液原液和稀釋倍數(shù)低于20倍的尿液都可以得到良好的尿蛋白吸附，吸附率可達(dá)到70％以上。每公斤樹脂吸附的人尿白蛋白通過解吸、硫酸銨沉淀等步驟所能制備的尿蛋白粗制約1.6克，尿蛋白含量大于60％。經(jīng)過后續(xù)的層析純化與病毒滅活過程，可得到約0.65克純度達(dá)到98％以上的尿蛋白，各種指標(biāo)均可達(dá)到中國藥典要求，可在多種領(lǐng)域作為人血漿來源白蛋白的替代品應(yīng)用。
雖然尿液白蛋白濃度僅及血漿的1/2000-4000，約10-20mg/L，但尿液來源較血漿廣泛得多。如果每天收集1000噸尿液，其中的白蛋白約10-15公斤。按40％收率計算，可年產(chǎn)2噸白蛋白制品，為替代人血漿來源白蛋白展示了良好前景。
具體實施方式
以下通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實施例1
規(guī)?；占四虻鞍椎姆椒ǎ?/p>
a)將分裝好的用于吸附尿蛋白的吸附劑放置在尿液流經(jīng)處，用于吸附尿液中的尿蛋白；
b)收集吸附尿蛋白的吸附劑，在收集吸附劑的過程中，環(huán)境溫度大于20℃時加冰冷卻；
c)在對吸附尿蛋白的吸附劑儲存之前，進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理方法是對吸附劑進(jìn)行高壓水流沖洗、清水浸泡清洗和脫水，離心機(jī)或者脫水機(jī)進(jìn)行脫水；脫水后的吸附劑冷藏儲存；用于去除吸附劑中殘留的尿液、微生物以及尿垢。用于防止吸附劑內(nèi)的尿蛋白變性失活，甚至降解，減少微生物的滋生，根據(jù)情況可以對高壓水流沖洗后的吸附劑進(jìn)行多次清水浸泡清洗和脫水，在預(yù)處理的過程中，環(huán)境溫度大于20℃時加冰冷卻；
d)預(yù)處理后的吸附劑冷藏儲存，用于積累吸附劑的數(shù)量，冷藏溫度不高于0～5℃；
e)將預(yù)處理后的吸附劑批量運(yùn)至加工廠進(jìn)行尿蛋白解吸處理，生產(chǎn)相應(yīng)的尿蛋白原料或尿蛋白制品，在運(yùn)輸吸附劑時采用冷藏運(yùn)輸，運(yùn)輸溫度0～10℃。
實施例2
在實施例1基礎(chǔ)上，優(yōu)選吸附劑裝置為陰離子交換樹脂時，制作尿液過濾濾墊。尿液過濾墊由通透性良好，又能防水的尼龍濾布縫制布袋和布袋內(nèi)的陰離子交換樹脂構(gòu)成。其制作方法為，濾布適宜的篩號為300目以下，50目以上孔徑，優(yōu)選篩號60目孔徑。過濾墊的形狀和大小與尿斗或尿槽的底部相適應(yīng)，可以為方形、圓形、多邊形等形狀；用于尿斗使用的過濾墊其邊長或直徑在20-30cm為宜；用于尿槽使用的過濾墊是平鋪于小尿槽的底部，其大小應(yīng)能全面覆蓋尿槽底部；使尿液在流出小便槽前流經(jīng)過濾墊。
取大孔型陰離子交換樹脂，例如配基為{-N+(CH3)3}的烯酸樹脂、配基為-N(CH3)3OH的苯乙烯一二乙烯苯共聚體等，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入濾布袋中，制成尿液過濾墊。
過濾墊中陰離子交換樹脂的裝料量根據(jù)安置過濾墊處一置換周期內(nèi)尿消夜流量多少決定。該處單位時間尿液流量由測量或估算獲得。優(yōu)選的陰離子交換樹脂裝量為每24小時尿液流量100L-200L使用1公斤樹脂。
使用上述方法制作的尿液過濾墊，過濾墊大小為20cmX40cm，制作過濾墊的濾布孔徑為60目；陰離子交換樹脂使用配基為{-N+(CH3)3}的大孔型陰離子交換樹脂丙烯配樹脂2公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入濾布袋中。制成尿液過濾墊，放置在尿斗中，以傾倒方式，將備好的男性尿液原液200L，以大體均勻的流速，在30分鐘倒入尿斗中，尿液流經(jīng)尿液過濾墊。之后，從過濾墊取出樹脂，用自來水沖洗后，裝入層析柱，再用含1MNaCL的醋酸緩沖液(50mM，pH4.5)進(jìn)行解吸；收集洗脫峰5200ml,測定尿液、殘尿、解吸液的尿蛋白含量和總蛋白量，尿蛋白測定應(yīng)用Raybio尿微量尿蛋白測定試劑盒進(jìn)行，總蛋白含量應(yīng)用Lowry法測定。
結(jié)果：尿液中白蛋白含量為15mg/L，殘尿中約2mg/L，洗脫溶液中尿蛋白400mg/L，得到2.25克尿蛋白。
實施例3
在實施例1基礎(chǔ)上，以孔徑為80目的濾布縫制30cmX30cm大小濾袋，取用配基為-N(CH3)3OH的大孔型陰離子交換樹脂苯乙烯一二乙烯共聚體2公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入濾布袋中，制成尿液過濾墊。
將尿液過濾墊放置尿斗中，24小時置換過濾墊，收集樹脂，按照實例1所述方法解吸。洗脫溶液中含尿蛋白1.28克。
實施例4
在實施例1基礎(chǔ)上，以孔徑為150目的濾布縫制30cmX30cm大小濾袋,取用同時具有伯胺、仲胺、叔胺、委胺配基的弱堿性環(huán)氧樹脂2公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入濾布袋中，制成尿液過濾墊。
將尿液過濾墊放置尿斗中，24小時后置換過濾墊，收集樹脂，按照實施例1所述方法解吸。洗脫溶液中含尿蛋白0.68克。
取用大孔型陰離子交換樹脂丙烯酸樹脂2公斤，其配基為-N+(CH3)3，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入孔徑為100目，直徑20cm的圓形濾布袋中，制成過濾墊，置放于衛(wèi)生間的尿斗中，24小時后收集樹脂，按照實施例3所述方法解吸，洗脫液中含尿蛋白1.77克。
實施例5
在實施例1基礎(chǔ)上，尿液收集處為大型廁所的三個小便池。據(jù)測算，每個小便池一晝夜尿液流量約1500L。
選取孔徑為60目的濾布縫制大小為30cmX30cm的濾布袋15個；取配基為{-N+(CH3)3}的大孔型陰離子交換樹脂丙烯酸樹脂30公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，分別裝入濾布袋中，每個濾布袋裝填2kg，制成15個尿液過濾墊。按照相當(dāng)于“每24小時流過約150L尿液/1公斤樹脂”比例，每個小便池置放5個尿液過濾墊，特別覆蓋小便池出水口附近。
24小時后收集樹脂，用水沖洗，再用含1MNaCL的醋酸緩部液(50mM，pH4.5)進(jìn)行解吸，將洗脫液(解吸)超濾濃縮60倍，加硫酸銨粉末至飽和，靜置2小時，加硅藻土過濾收集沉淀，得到尿蛋白粗制品230克，其中尿蛋白含量為36克，總蛋白含量為48克。其中，尿蛋白測定利用尿微量尿蛋白測定試劑盒進(jìn)行，總尿蛋白含量利用凱氏定氮法測定。
實施例6
對按實施例1與實施例2-5結(jié)合方法制取的尿蛋白粗制品后續(xù)純化步驟：將尿蛋白粗制品溶解，過濾，經(jīng)過Phenyl疏水層析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上樣和沖洗峰，超濾后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸緩沖(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸緩沖，pH5.0)，進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，60℃加熱10小時處理，DEAE陰離子層析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低鹽沖洗后收集洗脫峰，洗脫液為平衡液加0.5MNaCL。超濾濃縮，過0.22μm的濾膜除菌，冷凍干燥，得到18克尿蛋白凍干粉。
對該凍干粉分析：SDS-PAGE為單一條帶，等電聚焦測定其等電點(diǎn)約4.8兩項均與人血白蛋白對照品一致。其它指標(biāo)符合中國藥典指標(biāo)。
實施例6產(chǎn)品中尿蛋白成分未降解，峰形無拖尾。預(yù)處理方法處理后的吸附劑，進(jìn)行菌落檢查，菌落總數(shù)小于330CFU/g。因此，預(yù)處理方法能夠有效的降低微生物數(shù)量，有利于較長時間的儲存。
實施例7
在實施例1基礎(chǔ)上，配基為季胺基的大孔型聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸樹脂，以孔徑為80目的濾布縫制30cmX30cm大小濾袋，取用配基為季胺基的大孔型聚苯乙烯樹脂和聚丙烯酸樹脂2公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入濾布袋中，制成尿液過濾墊。
將尿液過濾墊放置尿斗中，24小時置換過濾墊，收集樹脂，按照實例1所述方法解吸。洗脫溶液中含尿蛋白1.10克。
實施例8
在實施例1基礎(chǔ)上，配基為-SO3-的大孔型聚丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂，以孔徑為150目的濾布縫制30cmX30cm大小濾袋,取用同時具有伯胺、仲胺、叔胺、委胺配基的弱堿性環(huán)氧樹脂2公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入濾布袋中，制成尿液過濾墊。
將尿液過濾墊放置尿斗中，24小時后置換過濾墊，收集樹脂，按照實施例1所述方法解吸。洗脫溶液中含尿蛋白0.69克。
取用配基為-SO3-的大孔型聚丙烯酸樹脂和聚苯乙烯樹脂2公斤，經(jīng)過2％NaOH處理，水沖至中性，裝入孔徑為100目，直徑20cm的圓形濾布袋中，制成過濾墊，置放于衛(wèi)生間的尿斗中，24小時后收集樹脂，按照實施例3所述方法解吸，洗脫液中含尿蛋白1.79克。
實施例9
對按實施例1和實施例7-8方法制取的白蛋白粗制品后續(xù)純化步驟：將白蛋白粗制品溶解，過濾，經(jīng)過Phenyl疏水層析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上樣和沖洗峰，超濾后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸緩沖(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸緩沖，pH5.0)，進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，60℃加熱10小時處理，DEAE陰離子層析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低鹽沖洗后收集洗脫峰，洗脫液為平衡液加0.5MNaCL。超濾濃縮，過0.22μm的濾膜除菌，冷凍干燥，得到19克尿蛋白凍干粉。
對該凍干粉分析：SDS-PAGE為單一條帶，等電聚焦測定其等電點(diǎn)約4.8兩項均與人血白蛋白對照品一致。其它指標(biāo)符合中國藥典指標(biāo)。
實施例9產(chǎn)品中尿蛋白成分未降解，峰形無拖尾。預(yù)處理方法處理后的吸附劑，進(jìn)行菌落檢查，菌落總數(shù)小于330CFU/g。因此，預(yù)處理方法能夠有效的降低微生物數(shù)量，有利于較長時間的儲存。
實施例10
按照實施例1的步驟，將預(yù)處理步驟進(jìn)行優(yōu)化。
步驟c)的預(yù)處理方法是低溫下，采用預(yù)處理液浸泡，然后清水清洗，再脫水。
其中，所述預(yù)處理液是緩沖液，所述緩沖液為磷酸、磷酸鈉、磷酸氫鈉或磷酸二氫鈉中的一種或兩種以上的混合物；浸入緩沖液1～3分鐘后，清洗，晾干。
對按實施例10的預(yù)處理方法和實施例2-5、7-8方法制取的尿蛋白粗制品后續(xù)純化步驟：將尿蛋白粗制品溶解，過濾，經(jīng)過Phenyl疏水層析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上樣和沖洗峰，超濾后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸緩沖(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸緩沖，pH5.0)，進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，60℃加熱10小時處理，DEAE陰離子層析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低鹽沖洗后收集洗脫峰，洗脫液為平衡液加0.5MNaCL。超濾濃縮，過0.22μm的濾膜除菌，冷凍干燥，得到22克尿蛋白凍干粉。
對該凍干粉分析：SDS-PAGE為單一條帶，等電聚焦測定其等電點(diǎn)約4.8兩項均與人血白蛋白對照品一致。其它指標(biāo)符合中國藥典指標(biāo)。
實施例11
按照實施例1的步驟，將預(yù)處理步驟進(jìn)行優(yōu)化。
步驟c)的預(yù)處理方法是低溫下，采用預(yù)處理液浸泡，然后清水清洗，再脫水。
其中所述預(yù)處理液是濃度為20％的尿素溶液，加入方式為低溫下加入，浸入緩沖液1～3分鐘后，清洗，晾干。
對按實施例11的預(yù)處理方法和實施例2-5、7-8方法制取的尿蛋白粗制品后續(xù)純化步驟：將尿蛋白粗制品溶解，過濾，經(jīng)過Phenyl疏水層析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上樣和沖洗峰，超濾后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸緩沖(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸緩沖，pH5.0)，進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，60℃加熱10小時處理，DEAE陰離子層析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低鹽沖洗后收集洗脫峰，洗脫液為平衡液加0.5MNaCL。超濾濃縮，過0.22μm的濾膜除菌，冷凍干燥，得到24克尿蛋白凍干粉。
對該凍干粉分析：SDS-PAGE為單一條帶，等電聚焦測定其等電點(diǎn)約4.8兩項均與人血白蛋白對照品一致。其它指標(biāo)符合中國藥典指標(biāo)。
實施例12
按照實施例1的步驟，將預(yù)處理步驟進(jìn)行優(yōu)化。
步驟c)的預(yù)處理方法是低溫下，采用預(yù)處理液浸泡，然后清水清洗，再脫水。
其中所述預(yù)處理液是濃度為0.01～0.02g/L的碳酸鈉溶液；加入方式為低溫下加入，浸入稀堿溶液中3～30s后，清洗，晾干。
對按實施例12的預(yù)處理方法和實施例2-5、7-8方法制取的白蛋白粗制品后續(xù)純化步驟：將白蛋白粗制品溶解，過濾，經(jīng)過Phenyl疏水層析[0.5M(NH4)2SO4，50mMPBS(pH6.8)]，收集上樣和沖洗峰，超濾后用SP-Sepharose FF吸附[50mM醋酸緩沖(pH3.8)]，再用0.5MNaCL溶液(50mM醋酸緩沖，pH5.0)，進(jìn)行洗脫，收集蛋白峰，60℃加熱10小時處理，DEAE陰離子層析(平衡液：50mMPBS，pH6.0)，低鹽沖洗后收集洗脫峰，洗脫液為平衡液加0.5MNaCL。超濾濃縮，過0.22μm的濾膜除菌，冷凍干燥，得到24克尿蛋白凍干粉。
對該凍干粉分析：SDS-PAGE為單一條帶，等電聚焦測定其等電點(diǎn)約4.8兩項均與人血白蛋白對照品一致。其它指標(biāo)符合中國藥典指標(biāo)。
實施例10-12產(chǎn)品中尿蛋白成分未降解，峰形無拖尾。預(yù)處理方法處理后的吸附劑，進(jìn)行菌落檢查，菌落總數(shù)小于120CFU/g。因此，預(yù)處理方法能夠有效的降低微生物數(shù)量，有利于較長時間的儲存。
本發(fā)明的預(yù)處理方式明顯減少了產(chǎn)品中微生物的數(shù)量，對尿蛋白的降解有明顯的抑制，能夠提高吸附尿蛋白樹脂的保存時間。經(jīng)加大規(guī)模后依然能保持很好的收集效果。