一種超靈敏定量檢測(cè)c-反應(yīng)蛋白的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種運(yùn)用免疫熒光納米球的定量檢測(cè)C?反應(yīng)蛋白方法和試劑盒。熒光納米球上標(biāo)記上C?反應(yīng)蛋白的鼠源單克隆抗體1，試紙條有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線固定有C?反應(yīng)蛋白的鼠源單克隆抗體2，質(zhì)控線則固定有羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明以熒光納米球?yàn)闃?biāo)記材料，采用免疫層析技術(shù)實(shí)現(xiàn)C?反應(yīng)蛋白的超靈敏定量檢測(cè)。相比傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條，標(biāo)記效果好，能夠?qū)崿F(xiàn)定量檢測(cè)，并獲得更高的檢測(cè)靈敏度、更小的批內(nèi)差及批間差，更好的重現(xiàn)性。
【專利說(shuō)明】一種超靈敏定量檢測(cè)G-反應(yīng)蛋白的方法和試劑盒
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及一種超靈敏定量檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的方法和試劑合
ΙΤΓΤ.0
【背景技術(shù)】
[0003]C-反應(yīng)蛋白是機(jī)體受到微生物入侵或組織損傷等炎癥性刺激時(shí)肝細(xì)胞合成的急性相蛋白，被公認(rèn)為是最有價(jià)值的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，自上世紀(jì)八十年代以來(lái)，C-反應(yīng)蛋白一直作為炎癥和組織損傷的非特異性標(biāo)志物被廣泛用于臨床感染性疾病的檢測(cè)。近年來(lái)更多的研究發(fā)現(xiàn)，C-反應(yīng)蛋白在心血管疾病診斷和預(yù)測(cè)中發(fā)揮越大越大的作用，而且它更是一種非特異性的腫瘤標(biāo)志物，與肺癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤有著密切關(guān)系，得到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，定量檢測(cè)CRP的方法主要是還是免疫擴(kuò)散、濁度法或酶聯(lián)免疫分析法。但是這些方法都存在步驟繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，檢出限高，靈敏度低等問(wèn)題，不利于臨床上快速定量檢測(cè)。
[0004]免疫層析法是快速檢測(cè)方法里最受矚目的一種方法，它通常是以硝酸纖維素膜作為層析膜，在毛細(xì)作用下使樣品溶液在層析膜上流動(dòng)，樣品中的目標(biāo)物會(huì)與層析膜上的待測(cè)物的受體(抗體或者抗原)發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)的免疫層析法利用膠體金作為標(biāo)記物，通過(guò)判斷膠體金的比色信號(hào)來(lái)進(jìn)行定性或者半定量檢測(cè)，因此當(dāng)檢測(cè)低濃度的目標(biāo)物時(shí)，膠體金的信號(hào)較弱導(dǎo)致誤判結(jié)果。因此傳統(tǒng)的膠體金層析法靈敏度較低。
[0005]近年來(lái)，出現(xiàn)了很多替代膠體金的熒光標(biāo)記材料，如染料、上轉(zhuǎn)換材料、量子點(diǎn)等材料，它們很好的解決了金標(biāo)免疫層析系統(tǒng)中無(wú)法定量檢測(cè)的問(wèn)題。其中量子點(diǎn)以其優(yōu)異的熒光性質(zhì)(熒光強(qiáng)度高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光壽命長(zhǎng)等)展現(xiàn)出更好的層析性能。然而，由于量子點(diǎn)在復(fù)雜體系中不夠穩(wěn)定的缺點(diǎn)，也限制了其廣泛應(yīng)用?；诹孔狱c(diǎn)的熒光納米球則可以很好的解決這些問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種超靈敏定量檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的方法和試紙條。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的定量檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的方法是:
1、制備免疫熒光納米球(IFNs):選擇某抗C-反應(yīng)蛋白的抗體作為標(biāo)記抗體，與熒光納米球偶聯(lián)，并用牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉，得到免疫熒光納米球；
2、制備試紙條，試紙條包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和底板，所述的硝酸纖維素膜上有測(cè)試線和質(zhì)控線，所述測(cè)試線上包被C-反應(yīng)蛋白的不同于標(biāo)記抗體的另一種單克隆抗體，所述質(zhì)控線上包被標(biāo)記抗體的抗體。
[0008]3、將免疫熒光納米球和待測(cè)樣品混合，將混合液滴到試紙條的樣品墊上層析，層析液為加了牛血清白蛋白的PH 7.4的堿性緩沖液；4、通過(guò)檢測(cè)試紙條上測(cè)試線上的免疫熒光球的熒光強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)對(duì)C-反應(yīng)蛋白的定量檢測(cè)。
[0009]其中步驟I中，將抗C-反應(yīng)蛋白的抗體偶聯(lián)到熒光納米球表面，具體為:通過(guò)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)活化法將熒光納米球和抗C-反應(yīng)蛋白的抗體偶聯(lián)。
[0010]所述熒光納米球，表面帶有-C00H，是將油溶性的CdSe/ZnS量子點(diǎn)(QDs)包埋到苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球中制備得到。
[0011]本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的試劑盒，包括本發(fā)明前述的試紙條、免疫熒光納米球和層析液，所述免疫熒光納米球?yàn)檫x擇某抗C-反應(yīng)蛋白的抗體作為標(biāo)記抗體，與熒光納米球偶聯(lián)，并用牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉得到，層析液為加了lwt%牛血清白蛋白的PH 7.4的堿性緩沖液。
[0012]熒光納米球上標(biāo)記上C-反應(yīng)蛋白的鼠源單克隆抗體I，試紙條有檢測(cè)線和質(zhì)控線，所述檢測(cè)線固定有C-反應(yīng)蛋白的鼠源單克隆抗體2，質(zhì)控線則固定有羊抗鼠IgG抗體。
[0013]本發(fā)明方法利用免疫熒光球和側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的快速檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)熒光球-蛋白-抗體復(fù)合物的熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)蛋白，步驟極其簡(jiǎn)單，無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或預(yù)富集，而且靈敏度高，特異性好。通過(guò)復(fù)合物的熒光強(qiáng)度檢測(cè)，得到很好的定量關(guān)系，線性范圍0.025?1.6 mg/L，R2 = 0.995。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程非常簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，可以在20 min內(nèi)完成檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為免疫層析所用試紙條的組裝示意圖，其中I為樣品墊，2為層析膜，3為吸水紙，4為測(cè)試線，5為質(zhì)控線，6為底板。
[0015]圖2為熒光納米球和量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度分別與其濃度的線性關(guān)系。
[0016]圖3為本發(fā)明快速定量檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果判讀圖圖4為檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的的熒光強(qiáng)度與C-反應(yīng)蛋白濃度的線性擬合。
[0017]圖5為檢測(cè)前列腺特異性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、人血清白蛋白(HSA)以及C-反應(yīng)蛋白的熒光強(qiáng)度。
[0018]圖6為實(shí)際病人血漿樣本的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]一、方法
1.熒光納米球的制備
熒光納米球(FNs)是本實(shí)驗(yàn)室自主制備的。以表面羧基化的苯乙烯-丙烯酰胺共聚納米球(Pst-AAm-⑶0H)為載體，通過(guò)超聲溶脹的方法，利用疏水相互作用，將疏水的量子點(diǎn)(CdSe/ZnS QDs)包埋到共聚納米球的疏水空腔內(nèi)部，從而得到表面帶有羧基的FNs。
[0020]2.免疫熒光納米球(IFNs)的制備
取大約2 mg FNs分散到0.01 M pH 6.8 PBS中，并加入EDC/NHS使其最終濃度為50 mM，活化20 min，用0.01 M pH 7.2 PBS離心洗滌一次，然后分散到I mL 0.01 M pH 7.2 PBS中，加入5yg的C-反應(yīng)蛋白的抗體，反應(yīng)4 11，用0.01 M pH 7.2 PBS離心洗滌五次，即得到了對(duì)C-反應(yīng)蛋白靶向的免疫熒光納米球(IFNS)。最后用BSA封閉后置于4° C冰箱中待用。
[0021]3.C-反應(yīng)蛋白樣品的檢測(cè)
將4 yL IFNsC1.57 nM)、l yL C-反應(yīng)蛋白樣品與75 yL層析液混合均勻，得到一系列C-反應(yīng)蛋白終濃度為0.025mg/L、0.lmg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.6mg/L的混合溶液。將混合液體加到樣品墊上。20 min后用倒置熒光顯微鏡拍檢測(cè)線區(qū)域的圖片，并測(cè)定檢測(cè)線的平均熒光強(qiáng)度。
[0022]4.定量檢測(cè)曲線
將不同濃度的C-反應(yīng)蛋白，按照3描述的步驟進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)定每個(gè)樣品檢測(cè)區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度，繪制C-反應(yīng)蛋白濃度與熒光強(qiáng)度關(guān)系曲線并擬合。
[0023]5.特異性實(shí)驗(yàn)
采用前列腺特異性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、人血清白蛋白(HSA)作為對(duì)照組。分別按照步驟3進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0024]6.重復(fù)性
將濃度為0.025 mg/L、0.4mg/I^P1.6 mg/L的C-反應(yīng)蛋白，用同一批按步驟2制備的IFNS進(jìn)行檢測(cè)，按照步驟2重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，記錄每次檢測(cè)結(jié)果的熒光值，計(jì)算批次內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差I(lǐng)ntra-assay CV。同時(shí)，用3種不同批次制備的IFNS對(duì)上述樣品進(jìn)行檢測(cè)，記錄檢測(cè)結(jié)果的焚光值，計(jì)算批次間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差I(lǐng)nter-assay CV。
[0025]7.實(shí)際病例樣本檢測(cè)
將健康人、肺癌患者的血漿樣本，按照步驟3對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病人體內(nèi)的C-反應(yīng)蛋白濃度。
[0026]二、結(jié)果
I.熒光納米球的表征
對(duì)比納米球和熒光納米球的透射電鏡可以看出QDs很好地分散在共聚納米球里。FNs的粒徑統(tǒng)計(jì)和水合粒徑表明FNs分散性很好，而且粒徑均一。FNs的熒光顯微鏡和熒光光譜表明FNs具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)。而FNs和QDs的同濃度時(shí)的熒光光譜可以看出，F(xiàn)Ns具有超強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。由FNs和QDs的熒光強(qiáng)度與各自濃度關(guān)系曲線(圖2)可以看出，對(duì)比兩個(gè)曲線的斜率，一顆熒光納米球的熒光強(qiáng)度是一顆量子定的380倍。
[0027]2.C-反應(yīng)蛋白的檢測(cè)
檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的原理圖見(jiàn)圖1所示:將免疫熒光球、樣本以及層析液混勻后，加載到樣品墊上。在毛細(xì)作用下，免疫熒光納米球和C-反應(yīng)蛋白的復(fù)合物被測(cè)試帶捕獲，未結(jié)合蛋白的免疫熒光球則繼續(xù)流動(dòng)，被控制帶捕獲。如圖3所示對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定性檢測(cè)。如圖4所示，C-反應(yīng)蛋白濃度在0.025-1.6 mg/L濃度范圍內(nèi)該方法呈現(xiàn)很好的定量關(guān)系(R2=0.995)最低檢出限為0.016 mg/L。
[0028]3.特異性
分別用前列腺特異性抗原(PSA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、人血清白蛋白(HSA)來(lái)檢驗(yàn)改方法的特異性。由圖5可以看出，陰陽(yáng)性結(jié)果對(duì)比明顯。
[0029]4.重復(fù)性
為了評(píng)價(jià)該方法的重現(xiàn)性，測(cè)定了該方法的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Intra-assay CV)和批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Inter-assay CV)，計(jì)算Intra-assay CV是使用同一批次的IMNS和IFNS進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次后計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。計(jì)算Inter-assay CV是用五種不同批次的IMNS和IFNS對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)記錄焚光強(qiáng)度，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算得到Intra-assayCV和Inter-assay CV分別為5.3%和6.6%，表明該法重現(xiàn)性較好，方法可靠。
[0030]5.實(shí)際病例檢測(cè)
將健康人以及癌癥病人的血漿稀釋80倍后用該方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果圖6，健康人體內(nèi)的C-反應(yīng)蛋白濃度極低，均在正常范圍，而肺癌患者體內(nèi)的C-反應(yīng)蛋白濃度都明顯升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌患者體內(nèi)的C-反應(yīng)蛋白會(huì)明顯升高是一致的。該結(jié)果也說(shuō)明此方法有望應(yīng)用于復(fù)雜實(shí)際樣品。
[0031]通過(guò)以上各項(xiàng)檢測(cè)，證明本發(fā)明方法可以應(yīng)用于C-反應(yīng)蛋白的超靈敏定量的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高、檢測(cè)限可達(dá)到0.016 mg/L;重復(fù)性好而且具有很好的選擇性和特異性，常見(jiàn)的PSA、CEA、AFP不干擾檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種量子點(diǎn)的熒光納米球免疫層析超靈敏定量檢測(cè)C-反應(yīng)蛋白的方法，其特征在于，該熒光納米球是在共聚納米球里包裹油溶性的CdSe/ZnS熒光量子點(diǎn)，一顆熒光納米球比一顆量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度高出380倍。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種免疫層析試紙條，包括樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙和底板，所述的硝酸纖維素膜上分別包被了C-反應(yīng)蛋白的捕獲抗體得到測(cè)試線；質(zhì)控線則固定的是抗鼠抗體。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫熒光球，其特征在于，通過(guò)EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)/NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)活化法將C-反應(yīng)蛋白的單克隆抗體連接到熒光納米球上，最后用牛血清白蛋白對(duì)偶聯(lián)了抗體的熒光納米球進(jìn)行封閉。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫層析試紙條，其特征在于，底板上順次搭接樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的測(cè)試線和質(zhì)控線均設(shè)在硝酸纖維素膜上。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的免疫層析試紙條，其特征在于，測(cè)試線上固定的是C-反應(yīng)蛋白的不同于標(biāo)記抗體的另一種單克隆抗體，質(zhì)控線上固定的是標(biāo)記抗體的抗體。6.—種使用如權(quán)利1-5所述的免疫層析試紙條檢測(cè)樣品的方法，包括: (1)將樣品、免疫熒光納米球和層析液混勻后，將混合液體加載到免疫層析試紙條的樣品墊上，靜置15-20分鐘； (2)通過(guò)熒光顯微鏡讀取信號(hào)。7.根據(jù)權(quán)利6所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述層析液為pH7.4的堿性緩沖液。8.根據(jù)權(quán)利7所述的熒光免疫層析方法，其特征在于，所述的堿性緩沖液中包含牛血清白蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/58GK105823885SQ201610147975
【公開(kāi)日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年3月15日
【發(fā)明人】龐代文, 胡姣, 張志凌
【申請(qǐng)人】武漢大學(xué)