本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種A型禽流感特異性單克隆抗體的建立方法及應用。
背景技術(shù)：
：禽流感(AvianInfluenza，AI)全名是鳥禽類流行性感冒，是由禽流感病毒(AvianInfluenzavirus，AIV)引起的動物傳染病。通常只傳染鳥類和禽類，但在罕有情況下也會傳染豬，甚至傳染人。禽流感可分為高致病性、低致病性和非致病性三大類。非致病性禽流感不會引起明顯癥狀，僅使染病的禽、鳥體內(nèi)產(chǎn)生病毒抗體。低致病性禽流感可使禽類出現(xiàn)輕度呼吸癥狀，食量減低，產(chǎn)蛋量下降，出現(xiàn)零星死亡。高致病性禽流感也稱A型禽流感很嚴重，發(fā)病率、死亡率均很高。不僅在禽類間流行，也會傳染給人和畜類。家禽感染高致病性禽流感死亡率幾乎是100％；人類感染禽流感死亡率達60％。禽流感的傳播途徑有三條，一是通過空氣傳播，二是通過食物經(jīng)消化道傳播，三是通過損傷的皮膚和眼結(jié)膜傳播。禽流感感染后的癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌肉酸痛等，嚴重者伴有肺炎，心、腎等多器官功能衰竭，導致死亡。禽流感病毒變異較頻繁，所以人類至今仍未找到特異的防禽流感的手段。在治療方面至今未找到特異性殺死禽流感病毒的新藥，只是采取一些對癥治療的方法，如用解熱藥降低體溫，用緩解鼻粘膜充血藥減輕呼吸困難，用止咳祛痰藥舒緩呼吸道等。在預防方面，雖然產(chǎn)生了疫苗，但因禽流感病毒變異很快，往往逃脫了疫苗產(chǎn)生抗體的捕殺。禽流感的診斷試劑有瓊脂擴散(AGP)試劑，ELISA免疫檢測試劑，PCR基因診斷試劑。瓊脂擴散檢測試劑靈敏度較低，其檢測對象是抗體，不能做早期診斷，因為感染后10天左右才能產(chǎn)生可檢測抗體，檢測到抗體也不能判定為當次感染所致，因為歷次感染產(chǎn)生抗體在體內(nèi)可存留半年時間。PCR檢測試劑靈敏而準確，但需要較昂貴的PCR儀和較專門的技術(shù)人才，不便于推廣應用。ELISA免疫檢測試劑不需要附加設備，可在現(xiàn)場進行檢測，免疫反應比較精準，操作簡便而不需要專門人才。ELISA免疫檢測試劑可分兩種，一種是查抗體的，另一種是查抗原的。查抗體最大的缺點是不能做早期診斷，也不能判定為是當次感染所致，所以其檢測結(jié)果對指導治療意義不大。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種A型禽流感病毒單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：1)以H9亞型禽流感免疫原，免疫小鼠；2)取免疫小鼠脾臟，制備免疫脾細胞懸液；3)融合所述小鼠免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞，獲得雜交瘤細胞；4)對所述雜交瘤細胞進行篩選陽性克隆細胞；5)對陽性克隆進行克隆化培養(yǎng)，獲得A型禽流感病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株。優(yōu)選地，本發(fā)明所述A型禽流感病毒單克隆抗體的制備方法中，所述A型禽流感病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株為雜交瘤細胞株1H7、1A7和1G6；最優(yōu)選地，所述雜交瘤細胞株為1H7。禽流感單克隆抗體雜交瘤細胞株1A7的生物保藏號為CGMCCNO.8010；分類命名：禽流感病(H9)亞型單克隆抗體雜交瘤細胞株，保藏日期2013年07月24日，保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所。優(yōu)選地，本發(fā)明所述A型禽流感病毒單克隆抗體的制備方法中，所述H9亞型禽流感免疫原為H9亞型禽流感疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明所述A型禽流感病毒單克隆抗體的制備方法中，所述小鼠骨髓瘤細胞為Sp20小鼠骨髓瘤細胞株。優(yōu)選地，本發(fā)明所述A型禽流感病毒單克隆抗體的制備方法中，所述步驟3)中小鼠免疫脾細胞的濃度為1x108個/ml，所述小鼠骨髓瘤細胞的濃度為2～3x107個/ml。本發(fā)明的另一目的在于提供一種A型禽流感病毒單克隆抗體，其中所述A型禽流感病毒單克隆抗體由禽流感單克隆抗體雜交瘤細胞株1H7、1A7或1G6所分泌。本發(fā)明的再一目的在于提供一種A型禽流感病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株1A7，所述雜交瘤細胞株1A7的生物保藏號為CGMCCNO.8010。本發(fā)明的又一目的在于提供一種A型禽流感免疫檢測試劑盒，其中所述免疫試劑盒包括上述A型禽流感病毒單克隆抗體溶液、樣品稀釋液、陽性對照液、陰性對照液、酶標抗體液、顯色劑及洗滌液。因此，本發(fā)明提供了A型禽流感病毒單克隆抗體在禽流感臨床檢測中的應用。我國迄今生產(chǎn)的畜禽病ELISA檢測試劑盒，絕大部分都是查抗體的，禽流感ELISA檢測試劑盒也不例外。用單克隆抗體建立禽流感ELISA免疫檢測試劑盒更是未見報道。令人意外地，本申請的發(fā)明人成功制備了禽流感單克隆抗體，該抗體能和禽流感H9亞型和H5亞型產(chǎn)生免疫反應，由上以及后續(xù)實施例可知，本發(fā)明的A型禽流感病毒單克隆抗體及其制備方法，至少具有以下優(yōu)點：1)目前國內(nèi)已有禽流感免疫檢測試劑盒，但卻是檢測抗體的，不可避免存在以下缺點：a.不能做早期診斷。因為禽流感病毒感染后10天左右才能產(chǎn)生可檢測抗體。b.檢測陽性結(jié)果不能判定為當次感染，因為歷次感染抗體可在體內(nèi)存留半年左右。c.交叉反應不可避免。而本發(fā)明制備了效價高、特異性強的單克隆抗體，用其制備免疫檢測試劑盒，可克服交叉反應問題；因為試劑盒檢測對象是抗原，一旦感染即可檢出，所以可做早期診斷；因為它檢測對象是抗原，所以其陽性檢測結(jié)果可判定為當次感染，或是帶毒。2)本發(fā)明雖然以H9亞型禽流感病毒抗原為免疫原，但是意想不到地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明篩選獲得的A型禽流感病毒單克隆抗體可以分別與禽流感H9亞型以及H5亞型產(chǎn)生特異性免疫反應，因此能夠擴大了檢測效力，能同時檢測A型禽流感的幾種亞型，減少了檢測成本。3)相比于ELISA檢測試劑盒，以本發(fā)明的A型禽流感病毒單克隆抗體建立的禽流感ELISA免疫檢測試劑盒，主要特點是靈敏、準確、操作簡便，很快可報結(jié)果，無需任何附加設備，可做現(xiàn)場檢測，采樣無需抽血，不給動物造成損害。附圖說明圖1本發(fā)明實驗例1A型禽流感免疫檢測試劑盒的檢測結(jié)果圖；圖2本發(fā)明實驗例2A型禽流感免疫檢測試劑盒的檢測結(jié)果圖；圖3本發(fā)明實驗例3A型禽流感免疫檢測試劑盒的檢測結(jié)果圖.具體實施方式以下通過具體實施例進一步對本發(fā)明的技術(shù)方案進行說明，應理解以下僅為本發(fā)明的示例性說明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍。實施例1A型禽流感病毒單克隆抗體的制備1、用免疫原來免疫動物選用H9亞型禽流感疫苗(獸藥生字(2011)150132066)作免疫原，以Balb/C小鼠作為免疫動物，取雄性8周齡的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml禽流感疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分別追加免疫一次。2、免疫脾細胞懸液的制備①免疫第31天取免疫小鼠的脾細胞，放入盛有5ml不完全培養(yǎng)液(不加小牛血清的1640培養(yǎng)液)的平皿中，置200目的不銹鋼網(wǎng)上，使脾細胞全部通過網(wǎng)孔擠壓到溶液中。②將脾細胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30ml，混勻后，經(jīng)1000rpm離心5分鐘，棄上清。③用不完全培養(yǎng)液30ml倒入有沉淀脾細胞的離心管內(nèi)，輕輕震動，使脾細胞重新變成懸液，再經(jīng)1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用不完全培養(yǎng)液將沉淀細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞計數(shù)器計數(shù)，總細胞數(shù)調(diào)為1x108個/ml。3、Sp20小鼠骨髓瘤細胞懸液的制備選用Sp20小鼠骨髓瘤細胞株，購自第四軍醫(yī)大學細胞工程中心，按照以下步驟進行制備小鼠骨髓瘤細胞懸液：①將SP20小鼠骨髓瘤細胞進行擴增培養(yǎng)。②將4瓶擴增培養(yǎng)的骨髓細胞收集到50ml離心管內(nèi)。③1000rpm離心5分鐘，棄去上清。④加入30ml不完全培養(yǎng)液，輕輕震動，使細胞重新垂懸于液體中，再經(jīng)1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用不完全培養(yǎng)液將沉淀細胞垂懸至10ml，混勻，用細胞計數(shù)器計數(shù)，總細胞數(shù)調(diào)至2～3x107。4、免疫脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞的融合按照下面步驟進行細胞融合：①分別吸取含1x108個脾細胞懸液和2～3x107個小鼠骨髓瘤細胞懸液，加到50ml離心管中，補加不完全培養(yǎng)液至30ml，充分搖勻。②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。③加體積濃度50％的融合劑聚乙二醇(PEG)溶液0.7ml。④加入25ml不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋而失去促融作用。⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。⑥加20ml的HAT培養(yǎng)液(含次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶的選擇性培養(yǎng)液)，輕輕吸取沉淀細胞，使其垂懸并混勻。⑦將細胞懸液加到輔有飼養(yǎng)細胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0.1ml，將培養(yǎng)板放到37℃含CO2的體積濃度為5％的孵箱中培養(yǎng)。5、抗體陽性孔檢測陽性克隆抗體細胞采用間接ELISA法，按照下面步驟進行篩選：①用禽流感H9亞型病原體包被。②加有克隆生長的孔中的培養(yǎng)上清100ul。③加酶標抗鼠IgG抗體100ul。④加底物100ul，室溫避光顯色10～20分鐘。⑤結(jié)果判定：在酶聯(lián)免疫檢測儀492波長下測定OD值，空白對照調(diào)零，若待測孔OD值大于或等于陰性對照孔OD值2.1倍，則可判定為陽性孔，孔內(nèi)生長有陽性克隆。獲得了3株能穩(wěn)定分泌禽流感單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1H7,1A7和1G6。6.陽性克隆細胞的克隆化培養(yǎng)采用有限稀釋法，按照下面步驟培養(yǎng)陽性克隆細胞株將96孔培養(yǎng)板中被檢測為抗體陽性的孔標記出來。用加樣器將將孔內(nèi)雜交瘤細胞反復吹打均勻后計數(shù)，然后用有限稀釋法進行逐級稀釋，再加到96孔板進行培養(yǎng)，觀察克隆生長，記錄單克隆孔。并及時進行陽性檢測。將陽性克隆孔的細胞轉(zhuǎn)到24孔板培養(yǎng)，待其增殖到一定數(shù)量后再轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)。將呈對數(shù)生長期的雜交瘤細胞收集于離心管，1000rpm離心10分鐘，棄去上清，加入1ml凍存液混勻，然后加到凍存管，在﹣70℃低溫冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮罐長期保存。7、腹水型單克隆抗體的制備將凍存的雜交瘤細胞復蘇擴增培養(yǎng)，將擴增培養(yǎng)的雜交瘤細胞吹打下來，1000rpm離心10分鐘，收集上清備用。加無血清培養(yǎng)液到沉淀的細胞中，調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，接種雜交瘤細胞后，7—14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水離心，收集上清，即為腹水型單克隆抗體，分裝后置于﹣20℃冰箱，凍存?zhèn)溆谩?.單克隆抗體的鑒定(采用ELISA法)將所述步驟獲得的三株能穩(wěn)定分泌禽流感單克隆抗體的雜交瘤細胞株1H7,1A7和1G6，分泌制備的腹水型單克隆抗體經(jīng)效價檢測，以上3種腹水型單克隆抗體的效價為1×10﹣4～1×10﹣6。結(jié)果見表1.表1雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體效價的檢測結(jié)果細胞株分泌的單抗效價檢測方法檢測結(jié)果1H7ELISA10-41A7ELISA10-51G6ELISA10-5特異性檢測顯示，1A7雜交瘤細胞產(chǎn)生的腹水型單克隆抗體除了禽流感病毒外，不和新城疫、雞傳染性支氣管炎、鴨瘟、雞支原體病的病原體發(fā)生交叉反應。說明其具有較強的特異性，可用其建立禽流感病的ELISA檢測試劑盒。另外，1A7雜交瘤細胞產(chǎn)生的單克隆抗體，除了和H9亞型產(chǎn)生免疫反應外，還能和H5亞型發(fā)生免疫反應(效價為10-5)。用該抗體制備的免疫檢測試劑盒能同時檢出A型禽流感不同亞型禽流感病，即擴大了檢測效力還降低了檢測成本。結(jié)果見表2。表2雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體的交叉試驗結(jié)果其中，“+”表示陽性結(jié)果(即有特異性反應)，“-”表示陰性結(jié)果(即無交叉反應)。實施例2A型禽流感免疫檢測試劑盒的制備1、按照以下組成制備A型禽流感免疫檢測試劑盒24孔培養(yǎng)板一塊采樣管22只滴管25只棉拭子22只檢測液如下：①樣本稀釋液(0.85M，PH9.6的碳酸緩沖液)25ml②陽性對照液(含H9和H5亞型疫苗的樣本稀釋液)0.5ml～1ml③陰性對照液(含有非相關(guān)蛋白，如正常牛血清，的樣本稀釋液)0.5ml～1ml④禽流感單克隆抗體(含有1：3000至1：50001A7雜交瘤細胞產(chǎn)生的腹水型單克隆抗體的PBS)液體2.5ml～3ml⑤酶標抗體液(含1：100的酶標抗體的PBS)2.5ml～3ml⑥顯色劑A(含有0.045％過氧化氫的PH5.0的磷酸-檸檬酸緩沖液)2.5ml～3ml⑦顯色劑B5mg鄰苯二胺干粉⑧洗滌液(含有0.05％Tween-20的PH7.4的PBS)35ml×42、A型禽流感免疫檢測試劑盒的檢測方法1樣本采集用棉拭子采集病禽的分泌物(口、鼻、泄殖腔分泌物)，放入采樣管內(nèi)，加入20滴樣本稀釋液，充分攪動棉拭子，使樣本充分游離到稀釋液中，然后按后續(xù)操做步驟操作。(如無條件進行后續(xù)步驟操作，可將樣本置于2-8℃冷藏保存，24小時可用，或是﹣20℃冷凍保存，4周內(nèi)可用)。2ELISA反應操作步驟a.將采集有樣本的小管按順序從1到22寫上編號。b.取出24孔培養(yǎng)板，用滴管將樣本管的樣本液按順序分別加到培養(yǎng)板的小孔內(nèi)，每個小孔分別加兩滴樣本液，從1～22小孔，一次可加22個樣本。第23號小孔加入①液(陽性對照液)兩滴，第24號小孔加②液(陰性對照液)兩滴。在常溫下靜置40·60分鐘，甩去孔內(nèi)液體。c.向培養(yǎng)板各小孔加入⑦號液(洗滌液)每孔5滴，靜置2～3分鐘，甩去孔內(nèi)液體，再重復兩次，最后拍干孔內(nèi)殘留液體。d.向各小孔加④液(禽流感單克隆抗體液)兩滴，在常溫下靜置20～40分鐘，甩去孔內(nèi)液體。e.重復c步驟。f.向各小孔加⑤液(酶標抗體液)各兩滴，在常溫下靜置30～40分鐘，甩去孔內(nèi)液體。g.同c步驟，但共重復5次。h.將⑥A液倒入⑥B管，擰緊蓋子，震蕩B管，待粉劑完全溶解后，加到培養(yǎng)板各小孔內(nèi)，每孔兩滴。加液后，常溫下避光靜置15～20分鐘。3結(jié)果判定在白色背景下，觀察小孔顏色。如果操作無誤，第23號小孔為陽性對照孔應呈橙黃色，第24號小孔為陰性對照孔，應呈無色或接近無色。第1～22號小孔，如呈橙黃色，表明樣本為禽流感陽性反應，若為無色或接近無色，表明樣本為陰性反應。以下以三個不同雞場檢測結(jié)果說明該試劑盒在臨床檢測中應用：實驗例1.西安市藍田縣某雞場500只無病毒攜帶雛雞，隨機抽取22羽雛雞口腔粘液，按實施例1制備試劑盒使用方法進行檢測，結(jié)果如圖1所示：如圖1的結(jié)果顯示：23號陽性對照空呈黃色為陽性反應，24號陰性對照孔不顯色，呈陰性反應。說明試劑盒性能正常，操作正確。1～22號孔呈無色為陰性反應，說明剛引進的雛雞無禽流感感染。實例2.西安市長安區(qū)某肉雞養(yǎng)殖場于2012年秋天突然發(fā)現(xiàn)雞群不吃東西，繼而發(fā)現(xiàn)有雞死亡，經(jīng)確定100只患禽流感雞群，按照本發(fā)明實施例1方法檢測是否是禽流感。隨機抽取22例雞的口腔粘液按實施例1制備試劑盒的使用方法進行操作，結(jié)果如下：如圖2的結(jié)果所示，23號陽性對照孔呈黃色為陽性反應，24號陰性對照孔呈無色為陰性反應，說明操作正確。1～22孔中除了5號和12號孔外，均呈黃色為禽流感陽性反應。說明該雞群已感染禽流感，建議按政策進行處置。實驗例3.西安市戶縣一蛋雞養(yǎng)殖場，2015年春，發(fā)現(xiàn)雞群食量減少，產(chǎn)蛋量下降，經(jīng)過病毒檢驗發(fā)現(xiàn)為新城疫感染，隨機抽取22羽雞口腔粘液，按實施例1的試劑盒使用方法進行操作。如圖3的結(jié)果所示：23號陽性對照孔呈黃色為陽性反應，24號陰性對照孔呈無色為陰性反應，說明操作及試劑盒反應正確。1～22孔也呈無色為陰性反應，說明蛋雞群不是禽流感感染，符合病毒檢驗結(jié)果。。附相關(guān)試劑生產(chǎn)廠家及購買渠道：以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3