本發(fā)明涉及生物制品制備技術(shù)領(lǐng)域，同時涉及水禽疾病預(yù)防與防控技術(shù)，具體涉及一種治療I型、新型鴨肝炎及鴨大舌病的卵黃抗體制備方法。

背景技術(shù)：

鴨病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是危害雛鴨的一種急性高度致死性傳染病，其特點是發(fā)病急、病程短、傳播快、病死率高等，主要侵害3周齡內(nèi)的雛鴨，成年鴨可感染但不發(fā)病。雛鴨發(fā)病后，死亡急劇上升，5d后死亡即可停止；發(fā)病日齡越小，病死率越高，通常在30％以上，高者可達95％甚至100％。病死鴨多呈角弓反張樣外觀，其肝臟常有特征性出血性病變。

鴨肝炎的病原包括I型、II型III型行鴨肝炎病毒。其中在我國主要流行I型。近些年在我國及周邊國家，I型出現(xiàn)了變異株，根據(jù)遺傳進化分析國內(nèi)有學(xué)者將I型鴨肝炎病毒不同毒株分為3個基因型即A型、B型和C型，A型對應(yīng)原傳統(tǒng)血清I型，B型對應(yīng)臺灣新型，C型對應(yīng)韓國新型。我國目前流行DHV毒株主要以A型和C型為主，但2個血清型之間無交叉保護力，然而我國市場上的鴨肝炎疫苗主要是針對A型毒株的，推測可能是造成我國對鴨病毒性肝炎不能進行有效防控的原因之一。

“大舌病”，于2014年下半年在江蘇開始出現(xiàn)，后又蔓延至山東、河南、河北、安徽、江西等全國多個養(yǎng)鴨地區(qū)。患鴨由于喙發(fā)育慢使得舌頭突出在外，從而得名。病鴨最早可在6日齡出現(xiàn)舌頭突出的癥狀，發(fā)病后期喙比正常鴨短10％～30％，且一旦發(fā)病很難恢復(fù)正常。剖檢病鴨發(fā)現(xiàn)，除了腸道炎癥外，無明顯的病變。該病剛開始發(fā)生于商品代櫻桃谷肉鴨，后來波及肉種鴨和番鴨。國內(nèi)研究人員已證實該病是由細小病毒引起，并將其稱為“鴨短喙長舌綜合征”或“鴨短喙和侏儒綜合征”。由于舌頭突出，導(dǎo)致病鴨無法正常采食，因此病鴨常表現(xiàn)發(fā)育不良，腿、翅膀易斷，很多屠宰場拒收此類殘鴨，使得養(yǎng)殖戶損失嚴重。目前，該病有愈演愈烈的趨勢，需要引起足夠的重視。

有報道稱，鴨“大舌病”患病鴨分離的毒株與多種常見鴨病毒病特異引物PCR鑒定后，只有鵝細小病毒為陽性。通過病毒關(guān)鍵VP3基因測序及比對發(fā)現(xiàn)，“大舌病”病毒的VP3基因序列與“小鵝瘟”病毒即鵝細小病毒(GPV)同源性最近，達到93.1％～98.2％；與番鴨細小病毒(MDPV)同源性為81.5％～91.4％。繪制的VP3基因系統(tǒng)進化樹也顯示分離到的“大舌病”病毒與兩株小鵝瘟臺灣分離株的遺傳關(guān)系最近，有文獻暫稱為鴨細小病毒(duck parvovirus,DPV)。

目前，與鴨肝炎有關(guān)的卵黃抗體專利主要集中在卵黃抗體的提取(“一種防治雛鴨病毒性肝炎的鴨卵黃抗體及制備方法”，專利申請?zhí)?01110130086.6)，卵黃抗體的劑型(“鴨病毒性肝炎鴨瘟二聯(lián)蛋黃抗體口服液及其制備方法”，專利申請?zhí)?01410762718.4)等方面，對鴨“大舌病”的卵黃抗體專利目前尚未發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種治療I型、新型鴨肝炎及鴨大舌病的卵黃抗體制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中針對鴨大舌病的防疫方法效果不佳的技術(shù)問題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種有效的鴨病毒性肝炎卵黃抗體。

本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中基于卵黃抗體的免疫方法難以對鴨病毒性肝炎和鴨大舌病同時實現(xiàn)預(yù)防效果。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種治療I型、新型鴨肝炎及鴨大舌病的卵黃抗體制備方法，包括以下步驟：

1)取母雞，分別利用鴨肝炎I型滅活疫苗、鴨肝炎新型滅活疫苗、鴨大舌病滅活疫苗免疫注射；

2)當(dāng)所述母雞血清中鴨肝炎I型抗體中和效價≥1:2048、鴨肝炎新型抗體中和效價≥1:2048、鴨大舌病抗體瓊擴效價≥1:64時，收集高免蛋；

3)取步驟2)所得的高免蛋提取卵黃抗體。

作為優(yōu)選，步驟1)中免疫注射的方法為：鴨肝炎I型滅活疫苗和新型滅活苗二者同時各基礎(chǔ)免疫注射一次、而后各強化免疫注射兩次，每次間隔三周，每次每種疫苗免疫1ml/只；上述基礎(chǔ)免疫注射后一周，利用鴨大舌病滅活疫苗執(zhí)行免疫注射，三周后利用鴨大舌病滅活疫苗執(zhí)行二次免疫注射，三周后利用鴨大舌病滅活疫苗執(zhí)行三次免疫注射，每次注射的疫苗劑量為1ml/只。

作為優(yōu)選，所述鴨大舌病滅活疫苗是利用鴨大舌病病毒DPV-HB株制備的。

作為優(yōu)選，步驟3)所述提取卵黃抗體，包括以下操作：

A)將高免蛋浸入1％的新潔爾滅溶液中浸泡消毒10～15min，晾干備用；

B)收集卵黃；

C)用膠體磨打散卵黃制成卵黃液，并1:4加入醋酸鹽緩沖液，攪拌60min，用板框過濾器粗濾；

D)過濾清液加入2～4％的辛酸，攪拌60min，板框過濾至澄清；

E)用0.22μm微孔過濾除菌即得卵黃抗體。

作為優(yōu)選，步驟B)所述收集卵黃是采取機械打蛋，分離并收集卵黃，并去除卵黃系帶。

作為優(yōu)選，步驟C)所述醋酸鹽緩沖液的pH值為5.2。

作為優(yōu)選，當(dāng)步驟2)中任一種抗體效價降低一個滴度時，取該抗體所對應(yīng)的疫苗進行第四次免疫。

以上所制備的卵黃抗體可用于防治鴨肝炎，同時還能對鴨大舌病進行預(yù)防和治療，具體應(yīng)用方法如下。

(1)治療用量：≤21日齡，胸肌注射2ml/只；≥21日齡，胸肌注射3ml/只。重癥時可重復(fù)注射2～3次。

(2)緊急預(yù)防用量：≤21日齡，胸肌注射1ml/只；≥21日齡，胸肌注射2ml/只。大流行時可加倍。

本發(fā)明提供了一種治療I型、新型鴨肝炎及鴨大舌病的卵黃抗體制備方法，該技術(shù)方案以鴨肝炎I型滅活疫苗、鴨肝炎新型滅活疫苗、鴨大舌病滅活疫苗作為免疫原接種蛋雞，創(chuàng)新性的設(shè)計了免疫接種的方法和接種劑量，使得各抗體均達到了較高的效價水平。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明以不同抗體的特定效價指標(biāo)為條件確定了卵黃抗體的提取時機，有效保證了所得卵黃抗體的治療效果。與此同時，本發(fā)明進一步設(shè)計了針對性的卵黃抗體提取工藝，所得的三聯(lián)卵黃抗體不僅具有較高的效價，同時對鴨肝炎、鴨大舌病具有確切的預(yù)防和治療效果，該方法的建立填補了卵黃抗體領(lǐng)域?qū)喆笊嗖≈委煹募夹g(shù)空白，同時實現(xiàn)了上述兩種疾病的同時防治，極具推廣前景。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

實施例1

1、三聯(lián)卵黃抗體的制備

(1)高免蛋的獲得：選取市售鴨肝炎I型滅活苗，對開產(chǎn)前母雞進行三次免疫，每次間隔兩周，每次免疫1ml/只。當(dāng)鴨肝炎I型抗體中和效價≥1:2048時，開始收集高免蛋。

(2)精制鴨肝炎I型卵黃抗體的制備：將高免蛋浸入1％的新潔爾滅溶液中浸泡消毒15min，晾干備用；采取機械打蛋，分離并收集卵黃；用膠體磨乳化后，1:4加入醋酸鹽緩沖液(pH5.2)，攪拌60min，用板框過濾器過濾；過濾清液加入2％的辛酸，劇烈攪拌60min，板框過濾；過濾清液用0.22μm微孔過濾除菌即得。

(3)應(yīng)用方法：2000只7日齡櫻桃谷鴨發(fā)生鴨肝炎疫情，使用上述方法制備的抗鴨肝炎I型卵黃抗體，胸肌注射，2ml/只。疫情得到控制，治愈率為70％，經(jīng)分離鑒定發(fā)現(xiàn)，鴨群發(fā)病時部分感染的是鴨肝炎新型病毒。本鴨群14周齡時又發(fā)生鴨“大舌病”，使用鴨“大舌病”卵黃抗體等常規(guī)藥物進行治療，病情得到緩解，治愈率為90％，出欄時體重較其他鴨群平均低0.4kg左右。

2、三聯(lián)卵黃抗體的應(yīng)用及療效評價

2000只7日齡櫻桃谷鴨發(fā)生鴨肝炎疫情(有I型、新型混合感染情況，并伴有鴨“大舌病”)，使用抗鴨肝炎I型-鴨肝炎新型-鴨“大舌病”三聯(lián)卵黃抗體，胸肌注射，2ml/只。疫情得到有效控制，治愈率達到93％。

在鴨肝炎發(fā)生的鴨場選取2群暫未發(fā)病的鴨群(共4000只，7日齡)進行緊急預(yù)防，胸肌注射，2ml/只。鴨場疫情得到控制后，此4000只肉鴨并未發(fā)生鴨肝炎及鴨“大舌病”的單獨感染或是混合感染，預(yù)防保護率達到了100％。

實施例2

一種治療I型、新型鴨肝炎及鴨大舌病的卵黃抗體制備方法，包括以下步驟：

1)取母雞，分別利用鴨肝炎I型滅活疫苗、鴨肝炎新型滅活疫苗、鴨大舌病滅活疫苗免疫注射；

2)當(dāng)所述母雞血清中鴨肝炎I型抗體中和效價≥1:2048、鴨肝炎新型抗體中和效價≥1:2048、鴨大舌病抗體瓊擴效價≥1:64時，收集高免蛋；

3)取步驟2)所得的高免蛋提取卵黃抗體。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿足以下條件：

步驟1)中免疫注射的方法為：鴨肝炎I型滅活疫苗和新型滅活苗二者同時各基礎(chǔ)免疫注射一次、而后各強化免疫注射兩次，每次間隔三周，每次每種疫苗免疫1ml/只；上述基礎(chǔ)免疫注射后一周，利用鴨大舌病滅活疫苗執(zhí)行免疫注射，三周后利用鴨大舌病滅活疫苗執(zhí)行二次免疫注射，三周后利用鴨大舌病滅活疫苗執(zhí)行三次免疫注射，每次注射的疫苗劑量為1ml/只。

所述鴨大舌病滅活疫苗是利用鴨大舌病病毒DPV-HB株制備的。

步驟3)所述提取卵黃抗體，包括以下操作：

A)將高免蛋浸入1％的新潔爾滅溶液中浸泡消毒10～15min，晾干備用；

B)收集卵黃；

C)用膠體磨打散卵黃制成卵黃液，并1:4加入醋酸鹽緩沖液，攪拌60min，用板框過濾器粗濾；

D)過濾清液加入2～4％的辛酸，攪拌60min，板框過濾至澄清；

E)用0.22μm微孔過濾除菌即得卵黃抗體。

步驟B)所述收集卵黃是采取機械打蛋，分離并收集卵黃，并去除卵黃系帶。

步驟C)所述醋酸鹽緩沖液的pH值為5.2。

當(dāng)步驟2)中任一種抗體效價降低一個滴度時，取該抗體所對應(yīng)的疫苗進行第四次免疫。

實施例3

一種治療I型、新型鴨肝炎及鴨大舌病的卵黃抗體制備方法，包括以下步驟：

1)取母雞，分別利用鴨肝炎I型滅活疫苗、鴨肝炎新型滅活疫苗、鴨大舌病滅活疫苗免疫注射；

2)當(dāng)所述母雞血清中鴨肝炎I型抗體中和效價≥1:2048、鴨肝炎新型抗體中和效價≥1:2048、鴨大舌病抗體瓊擴效價≥1:64時，收集高免蛋；

3)取步驟2)所得的高免蛋提取卵黃抗體。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。