本發(fā)明屬于獸用醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法。
背景技術(shù)：
流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea ofSwine，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬接觸性腸道傳染病。以嘔吐、腹瀉和脫水為特征，可發(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率高。哺乳豬、架子豬或肥育豬的發(fā)病率很高，尤以哺乳豬受害最為嚴(yán)重，母豬發(fā)病率變動(dòng)很大，約為15-90%。病豬是主要傳染源。發(fā)病豬癥狀的輕重隨年齡的大小而有差異，年齡越小，癥狀越重。一周齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3-4天，呈現(xiàn)嚴(yán)重脫水而死亡，死亡率可達(dá)50%，最高的死亡率達(dá)100%。斷奶豬、母豬常呈精神萎頓、厭食和持續(xù)性腹瀉大約一周，并逐漸恢復(fù)正常。少數(shù)豬恢復(fù)后生長發(fā)育不良。肥育豬在同圈飼養(yǎng)感染后都發(fā)生腹瀉，一周后康復(fù)，死亡率1--3%。成年豬癥狀較輕，有的僅表現(xiàn)嘔吐，重者水樣腹瀉3-4天可自愈。而豬流行性腹瀉病毒陽性血清是目前主要應(yīng)用于鑒別、檢驗(yàn)、診斷的蛋白類物質(zhì)，此免疫球蛋白（抗體）是一種能攻擊異己物質(zhì)（抗原）并促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬免疫球蛋白-抗原復(fù)合物的蛋白質(zhì)，因此它們?cè)谇宄?xì)菌和病毒中起著重要作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種用兔或豚鼠制備豬流行性腹瀉病毒陽性血清的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，包括以下步驟：
1) 篩選豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種：
用豬流行性腹瀉病毒抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫：對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或肌肉注射0.5-2mL豬流行性腹瀉病毒抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；
用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進(jìn)行3-5次免疫：基礎(chǔ)免疫7--10天后對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮下或肌肉注射豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進(jìn)行3-5次免疫接種，每次免疫接種的時(shí)間間隔為7-10天，第1次接種量為1-3頭份，以后每次接種量比上一次增加2-3頭份或者做倍增接種；
2）最后一次免疫后28-42天，無菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清，以細(xì)胞中和抗體效價(jià)檢測法檢測，確認(rèn)血清抗體為陽性且細(xì)胞中和抗體效價(jià)在1：256以上，即收獲豬流行性腹瀉病毒陽性血清。收集的豬流行性腹瀉病毒陽性血清經(jīng)過輻照、過濾后抽樣做無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)等步驟，將無細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒污染的免疫動(dòng)物血清進(jìn)行分裝、凍干后，再次抽樣檢驗(yàn)，確認(rèn)無污染的陽性血清凍存?zhèn)溆谩?/p>
所述實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為小鼠、豚鼠或兔。作為實(shí)驗(yàn)用的動(dòng)物，首先采集其血清檢測，驗(yàn)證其均不具有豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬Ⅱ型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒等的抗原、抗體。
所述步驟1）的免疫為多點(diǎn)免疫，所述多點(diǎn)免疫為2點(diǎn)、3點(diǎn)或4點(diǎn)免疫。
所述步驟2) 無菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清的具體操作為：采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液，在室溫下靜置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min離心10-15min，在無菌環(huán)境下分離血清。
本發(fā)明所述中和抗體效價(jià)的測定方法如下：
S1： 將采集的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清在56℃下滅活30min，然后用維持液對(duì)血清做倍比稀釋，得到不同稀釋度的血清，每個(gè)稀釋度的血清分別與豬流行性腹瀉病毒抗原于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
S2：用細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)VERO細(xì)胞生長24小時(shí)以上，細(xì)胞密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.1mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；
S3：將細(xì)胞板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)。
所述步驟S1的維持液為DMEM維持液。
所述步驟S1的豬流行性腹瀉病毒抗原的濃度為200TCID50/0.1mL。
所述步驟S1的倍比稀釋，稀釋至血清與維持液的比例1:256以上。
所述步驟S1每個(gè)稀釋度的血清與豬流行性腹瀉病毒抗原等量混合。
所述細(xì)胞板為96孔細(xì)胞板。
本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，首先用豬流行性腹瀉病毒抗原對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物進(jìn)行基礎(chǔ)免疫，再用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物進(jìn)行3-5次免疫，而后無菌采集動(dòng)物血清，以細(xì)胞中和抗體效價(jià)檢測法檢測，確認(rèn)血清抗體為陽性且細(xì)胞中和抗體效價(jià)在1：512以上，即收獲豬流行性腹瀉病毒陽性血清。本發(fā)明首次免疫采用豬流行性腹瀉病毒抗原，接下來的3-5次免疫采用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗，其中活抗原是為了加強(qiáng)細(xì)胞免疫，滅活疫苗是為了更好地提高抗體水平。
本發(fā)明所涉及的陽性血清是利用豬流行性腹瀉病毒和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兔、豚鼠，按照一定免疫程序免疫接種制備高免血清作為樣品，通過對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采血分離血清，血清經(jīng)過輻照、過濾、檢驗(yàn)、分裝、凍干等工藝過程，并最終用于鑒別、檢驗(yàn)和診斷過程中。本發(fā)明方法不僅降低了成本，也減小了用豬制備陽性血清因同源動(dòng)物而引起的同源其他外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)，為豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備提供了新的思路。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為豚鼠或兔。選用的豚鼠為350-400g、符合國家規(guī)定的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選用的兔為2.25--3.0Kg、符合國家規(guī)定的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。作為實(shí)驗(yàn)用的動(dòng)物，首先采集其血清檢測，驗(yàn)證其均不具有豬流行性腹瀉病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬Ⅱ型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒等的抗原、抗體。
本發(fā)明豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，包括以下步驟：
1) 預(yù)實(shí)驗(yàn)
篩選豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性的動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫接種：
用豬流行性腹瀉病毒抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫：對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或肌肉注射0.5-2mL豬流行性腹瀉病毒抗原進(jìn)行基礎(chǔ)免疫；
用豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進(jìn)行3-5次免疫：基礎(chǔ)免疫7--10天后對(duì)每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行皮下或肌肉注射豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗進(jìn)行3-5次免疫接種，每次免疫接種的時(shí)間間隔為7-10天，第1次接種量為1-3頭份，以后每次接種量比上一次增加2-3頭份或者做倍增接種；
所述免疫為2點(diǎn)、3點(diǎn)或4點(diǎn)免疫；
最后1次免疫10天后每隔4--7天采血一次，用細(xì)胞中和抗體效價(jià)檢測法，做相對(duì)定量的檢測（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024......等對(duì)倍的稀釋），以確定細(xì)胞中和抗體效價(jià)測定在1:256以上的收獲血清時(shí)間，為最后1次免疫后的28--42天；
2）正式試驗(yàn)：
重復(fù)以上對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫程序，并全部采集最后1次免疫后28--42天的免疫動(dòng)物血清（具體操作為：最后一次免疫后28-42天，無菌采集實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血液，在室溫下靜置0.5-2h，然后在2-8℃冷藏1-2h，在3000-3500r/min離心10-15min，在無菌環(huán)境下分離血清），以細(xì)胞中和抗體效價(jià)檢測法檢測，確認(rèn)血清抗體為陽性且細(xì)胞中和抗體效價(jià)在1：256以上，即收獲豬流行性腹瀉病毒陽性血清。收集的豬流行性腹瀉病毒陽性血清經(jīng)過輻照、過濾后抽樣做無菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)等步驟，將無細(xì)菌、霉菌、支原體、外源病毒污染的免疫動(dòng)物血清進(jìn)行分裝、凍干后，再次抽樣檢驗(yàn)，確認(rèn)無污染的陽性血清凍存?zhèn)溆谩?/p>
其中，中和抗體效價(jià)的測定方法如下：
S1： 將采集的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清在56℃下滅活30min，然后用DMEM維持液對(duì)血清做倍比稀釋（稀釋至血清與維持液的比例1:256以上），得到不同稀釋度的血清，每個(gè)稀釋度的血清分別與濃度為200TCID50/0.1mL的豬流行性腹瀉病毒抗原等量混合，于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
S2：用96孔細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)VERO細(xì)胞生長24小時(shí)以上，細(xì)胞密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.1mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；
S3：將細(xì)胞板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)。
實(shí)施例1
一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，包括以下步驟：
1) 選用350-400g豚鼠，并且其為符合國家規(guī)定的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)滿足豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性，然后用PEDV活毒抗原0.5mL對(duì)豚鼠進(jìn)行首免，10天后再用PEDV滅活疫苗對(duì)豚鼠進(jìn)行5次免疫，第一次1頭份，第2--5次接種量均比前次增加2頭份，免疫時(shí)間間隔7天；
2) 最后一次免疫后33-35天，無菌采集豚鼠血清，將收集到的血清在56℃下滅活30min，然后用DMEM維持液對(duì)血清做倍比稀釋（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀釋），每個(gè)稀釋度的血清分別與濃度為200TCID50/0.1mL的PEDV抗原等量混合，于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)生長24-小時(shí)以上，密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.1mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；
4) 將細(xì)胞板置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)，收集該中和抗體效價(jià)的血清即為豬流行性腹瀉病毒陽性血清。
實(shí)施例2
一種豬流行性腹瀉病毒陽性血清的制備方法，包括以下步驟：
1) 選用350-400g豚鼠，并且其為符合國家規(guī)定的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)滿足豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性，然后用PEDV活毒抗原0.6ml對(duì)豚鼠進(jìn)行首免，10天后再用PEDV滅活疫苗對(duì)豚鼠進(jìn)行3次免疫，第一次2頭份，第2、3次接種量均比前次增加3頭份，免疫時(shí)間間隔9天；
2) 最后一次免疫后36-38天，無菌采集豚鼠血清，將收集到的血清在56℃下滅活30min，然后用DMEM維持液對(duì)血清做倍比稀釋（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀釋），每個(gè)稀釋度的血清分別與PEDV抗原于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)生長近48小時(shí)，密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.2mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；
4) 置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)，收集該中和抗體效價(jià)的血清即為豬流行性腹瀉病毒陽性血清。
實(shí)施例3
1)選用2.25-3.0kg的兔，并且其為符合國家規(guī)定的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)滿足豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性，PEDV活毒抗原0.8ml對(duì)兔進(jìn)行首免，10天后再用PEDV滅活疫苗對(duì)兔進(jìn)行4次免疫，第一次3頭份，第2--4次接種量分別為6、10、15頭份，免疫時(shí)間間隔10天；
2) 最后一次免疫后32-33天，無菌采集兔血清，將收集到的血清在56℃下滅活30min，然后用DMEM維持液對(duì)血清做倍比稀釋（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀釋），每個(gè)稀釋度的血清分別與PEDV抗原于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)生長36小時(shí)以上，密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.2mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；
4) 置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)，收集該中和抗體效價(jià)的血清即為豬流行性腹瀉病毒陽性血清。
實(shí)施例4
1) 選用2.25-3.0kg的兔，并且其為符合國家規(guī)定的清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)滿足豬流行性腹瀉病毒抗原抗體陰性，然后用PEDV活毒抗原0.7ml對(duì)兔進(jìn)行首免，10天后再用PEDV滅活疫苗對(duì)兔進(jìn)行5次免疫，第一次2頭份，第2--5次接種量分別為5、8、11、15頭份，免疫時(shí)間間隔8天；
2) 最后一次免疫后34-36天，無菌采集兔血清，將收集到的血清在56℃下滅活30min，然后用DMEM維持液對(duì)血清做倍比稀釋（血清做1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024.......等倍比稀釋），每個(gè)稀釋度的血清分別與PEDV抗原于37℃環(huán)境下中和60min以上，得到中和液；
3) 用細(xì)胞板培養(yǎng)VERO細(xì)胞，當(dāng)生長36-48小時(shí)，密度達(dá)到致密單層時(shí)，棄去培養(yǎng)液，取0.2mL上述中和液接種于細(xì)胞板上，每個(gè)稀釋度的血清中和液分別接種6孔細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不中和的病毒陽性對(duì)照細(xì)胞6孔和接種維持液的陰性對(duì)照細(xì)胞6孔；
4) 置37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)120h，并每天觀察細(xì)胞病變情況，以細(xì)胞不產(chǎn)生病變的最高稀釋度為陽性血清的中和抗體效價(jià)，收集該中和抗體效價(jià)的血清即為豬流行性腹瀉病毒陽性血清。