本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種KAP13-1基因在綿羊毛纖維細(xì)度鑒定中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

毛囊是一個復(fù)雜的微器官，其由外到內(nèi)包括外根鞘、伴隨層、內(nèi)根鞘(亨利層、赫胥黎層、鞘小皮)、毛干(角質(zhì)層、皮質(zhì)層、髓質(zhì)層)。此外，毛囊具有毛囊干細(xì)胞富集的膨大部、含有大量快速增殖細(xì)胞的毛母質(zhì)和在信號交流中起重要作用的毛乳頭。研究毛囊不同結(jié)構(gòu)或細(xì)胞的功能有助于全面地了解毛囊生長發(fā)育過程進(jìn)而提高毛纖維品質(zhì)。毛纖維作為毛囊的最終產(chǎn)物，不僅對動物自身具有重要的保護(hù)作用而且具有很大的經(jīng)濟(jì)價值。毛纖維主要由外側(cè)的鱗片層、中間的皮質(zhì)層和內(nèi)部的髓質(zhì)層組成。皮質(zhì)層由角蛋白和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白組裝成的纖維束構(gòu)成，是毛纖維的重要組成部分。皮質(zhì)層中的蛋白通過鹽鍵、氫鍵及二硫鍵相互作用使毛纖維富有彈性、張力和韌性；皮質(zhì)層含有色素細(xì)胞，決定毛纖維顏色的深淺；而且皮質(zhì)層控制毛纖維的水分和曲直。因此，毛纖維的皮質(zhì)部對毛纖維的物理特性具有重要作用。研究皮質(zhì)部蛋白的功能可以揭示毛纖維的形成過程和各蛋白對毛纖維理化性質(zhì)的影響。

毛纖維中的角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Kertain associated protein)是在皮質(zhì)部中圍繞角蛋白(Kertain)的不規(guī)則基質(zhì)的重要組成部分(Rogers and Schweizer,2005)。許多研究者認(rèn)為角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白在毛纖維形成過程中具有重要作用(Shimomura and Ito,2005；Fujikawa et al.,2012)。在毛纖維形成過程中，角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白好像“膠水”一樣將各角蛋白結(jié)合起來(Rogers and Schweizer,2005)。根據(jù)氨基酸組成，角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白可以分為高硫、超高硫和高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Shimomura and Ito,2005)。高硫和超高硫角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白主要通過與角蛋白形成二硫鍵在毛纖維的形成中發(fā)揮作用；而高甘氨酸/酪氨酸角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白不僅可以與角蛋白相互作用而且還可以與細(xì)胞橋粒作用促進(jìn)毛纖維的形成(Matsunaga et al.,2013)。角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白在哺乳動物中特異表達(dá)，并且具有許多特點(diǎn)。首先，不同種類的角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白與不同的毛纖維的特性有密切聯(lián)系；其次，由于角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白半胱氨酸富集區(qū)段的重復(fù)導(dǎo)致長度的多態(tài)性，而半胱氨酸的含量差異導(dǎo)致了相應(yīng)角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白對毛纖維形成作用的差異；不同角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白基因的多樣性也影響了其表達(dá)量的不同(Wu et al.,2008；Khan et al.,2014)。因此，角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白的多樣性很可能導(dǎo)致了哺乳動物毛纖維形態(tài)的多樣性。

KAP13-1屬于高硫角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白。公開號：CN103642806B的專利文獻(xiàn)報(bào)道了綿羊KAP13-1在毛囊中高表達(dá)。在羊毛纖維的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，KAP13-1的表達(dá)起始于羊毛纖維角質(zhì)化部位(Plowman et al.,2015)。此外，在不同品種的綿羊群體中，KAP13-1在不同位點(diǎn)呈現(xiàn)出多態(tài)性，進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)分析表明KAP13-1中的多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)毛量、柔韌性及產(chǎn)絨性狀存在緊密關(guān)聯(lián)。上述結(jié)果表明KAP13-1對毛纖維的形成具有重要作用，但是其具體功能尚不清楚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提高一種KAP13-1基因在綿羊毛纖維細(xì)度鑒定中的應(yīng)用，檢測綿羊KAP13-1對毛纖維細(xì)度的影響，利用該基因作為在綿羊毛纖維細(xì)度鑒定中的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

(1)根據(jù)登陸號為NM_001080350.1的牛KAP13-1基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，其正向引物為CGTAACTCACATCACCTGCG，反向引物為：TGCTTCCGTATCGCATGTCT，以綿羊皮膚cDNA為模板，用RT-PCR方法擴(kuò)增綿羊KAP13-1基因的部分核苷酸序列，然后純化PCR產(chǎn)物、克隆并測序，獲得如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列(即擴(kuò)增得到的綿羊KAP13-1基因的部分核苷酸序列)；

(2)根據(jù)綿羊KAP13-1基因的氨基酸序列制備綿羊KAP13-1的多克隆抗體，然后通過免疫組化檢測KAP13-1基因是否在綿羊毛囊中的表達(dá)模式(即檢測KAP13-1基因在綿羊毛囊中的表達(dá)量)，KAP13-1基因的氨基酸序列是SEQ ID NO:1中第24-518堿基所對應(yīng)的序列。

所示；

(3)利用2A肽序列(序列見SEQ ID NO:8)構(gòu)建綿羊KAP11-1啟動子驅(qū)動的共表達(dá)綿羊KAP13-1和綠熒光蛋白ZsGreen1的表達(dá)載體，申請人將獲得的表達(dá)載體命名為重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG；根據(jù)SEQ ID NO:1所述的綿羊KAP13-1基因的核苷酸序列和SEQ ID NO:4所述的ZsGreen1-1載體中綠熒光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列設(shè)計(jì)如下引物：

擴(kuò)增KAP13-1基因：

正向引物：CCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTCCTACAACTGCTGCTCTGG，

反向引物:CTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCCCTCGTAGAAGCCAGATCCACA；

擴(kuò)增GFP-ZSG基因：

正向引物：GATCTGGCTTCTACGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCCAGTCCAAG，

反向引物：GATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCAGGGCAAGG；

通過融合PCR方法擴(kuò)增得到KAP13-1-2A-ZSG片段，該片段序列如SEQ ID NO:5所示，回收PCR產(chǎn)物，酶切后，利用連接酶將該KAP13-1-2A-ZSG片段連接入Sac II/Not I雙酶切的pZsGreen1-1載體中，克隆、測序獲得序列正確的KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1載體，該載體的序列如SEQ ID NO:6所示；

利用正向引物：CCGCTCGAGCCCCTGGATAGAAAGATCAGACCAA和反向引物：TCCCCGCGGCTTGGTGCTGGTGGAGAGATGT，以綿羊脾臟基因組為模板PCR擴(kuò)增KAP11-1基因啟動子序列，該啟動子序列如SEQ ID NO:7所示，PCR產(chǎn)物回收后，酶切連接到已獲得的KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1載體中，通過克隆、測序獲得序列正確的重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG，該載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

(4)PiggyBac系統(tǒng)是一個能夠有效介導(dǎo)基因編輯的轉(zhuǎn)座系統(tǒng)(Wilson M H et al.,2007)，本發(fā)明利用PiggyBac系統(tǒng)將pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG重組片段隨機(jī)整合到昆明小鼠的基因組上，獲得pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠，分別通過PCR在基因組水平鑒定陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)基因小鼠毛纖維中綠熒光蛋白ZsGreen1的表達(dá)量；同時檢測綿羊KAP13-1蛋白在pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠各組織中的表達(dá)量以及鑒定綿羊KAP13-1基因在pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠毛纖維皮質(zhì)部中的表達(dá)量；

(5)分別采集35日齡的pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠、皮質(zhì)部特異表達(dá)綠熒光蛋白的pKAP11-1-ZSG轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型昆明小鼠的Guard型毛纖維并測量距離毛囊底部130μm處毛纖維的直徑；結(jié)果發(fā)現(xiàn)pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠的Guard型毛纖維顯著變細(xì)，表明KAP13-1能夠影響毛纖維的細(xì)度。

附圖說明

序列表SEQ ID NO:1是綿羊KAP13-1基因的核苷酸序列(1-753bp)；其中24-518bp是該基因的編碼區(qū)(CDS)，即綿羊KAP13-1基因編碼的氨基酸序列。

序列表SEQ ID NO:2是綿羊KAP13-1基因編碼的蛋白質(zhì)序列，編碼164個蛋白質(zhì)。

序列表SEQ ID NO:3是pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG載體的核苷酸序列，序列長度為10596bp；

序列表SEQ ID NO:4是綠熒光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列，序列長度為696bp；

序列表SEQ ID NO:5是重組片段KAP13-1-2A-ZSG的核苷酸序列，序列長度為1242bp；

序列表SEQ ID NO:6是KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1載體的核苷酸序列，序列長度為4672bp；

序列表SEQ ID NO:7是綿羊KAP11-1啟動子的核苷酸序列，序列長度為5954bp；

序列表SEQ ID NO:8是2A肽序列的核苷酸序列，序列長度為54bp；

序列表SEQ ID NO:9-10是用于擴(kuò)增綿羊KAP13-1基因的引物序列；

序列表SEQ ID NO:11-14是用于擴(kuò)增KAP13-1-2A-ZSG片段的引物序列；

序列表SEQ ID NO:15-16是用于擴(kuò)增綿羊KAP11-1啟動子的引物序列；

序列表SEQ ID NO:17-18是用于鑒定陽性轉(zhuǎn)基因小鼠的引物序列；

圖1：綿羊KAP13-1基因在毛囊中的表達(dá)模式圖。附圖標(biāo)記說明：圖1中的a圖和圖1中的b圖分別表示KAP13-1基因在綿羊毛囊中的表達(dá)；圖1中的c圖是陰性對照。

圖2：本發(fā)明涉及的載體和載體構(gòu)建示意圖。附圖標(biāo)記說明：圖2a是載體pZsGreen1-1的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2b是載體KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2c是本發(fā)明構(gòu)建的重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2d是商業(yè)質(zhì)粒(載體)pMD19-T的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖3：轉(zhuǎn)基因小鼠在基因組水平的PCR檢測結(jié)果。附圖標(biāo)記說明：圖3中的DL2000泳道購自寶生物工程大連有限公司；圖3中的2#泳道是2號轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組；圖3中的4#泳道是4號轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組；圖3中的6#泳道是6號小鼠的基因組；目的片段大小為1241bp。

圖4：轉(zhuǎn)基因小鼠的毛纖維在熒光顯微鏡下的檢測圖片。

圖5：綿羊KAP13-1基因(sKAP13-1)在轉(zhuǎn)基因小鼠中各組織中的表達(dá)模式。

圖6:綿羊KAP13-1基因在轉(zhuǎn)基因小鼠毛囊中的表達(dá)檢測。

具體實(shí)施方案式

實(shí)施例1:綿羊KAP13-1編碼序列的克隆及其在綿羊中的組織表達(dá)譜

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的牛的KAP13-1基因序列(登陸號NM_001080350.1)設(shè)計(jì)引物，以綿羊皮膚(含有毛囊)的cDNA為模板作PCR擴(kuò)增，設(shè)計(jì)如下所示的引物序列：擴(kuò)增KAP13-1基因的引物對:

正向引物：5’-CGTAACTCACATCACCTGCG-3’,

反向引物：5’-TGCTTCCGTATCGCATGTCT-3’。

PCR反應(yīng)條件如表1所示：

表1 PCR擴(kuò)增體系

取PCR反應(yīng)液，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用寶生物工程大連有限公司生產(chǎn)的膠回收試劑盒MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0進(jìn)行回收純化，然后連接至載體pMD19-T(購自寶生物工程大連有限公司，載體結(jié)構(gòu)如圖2d所示)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化后于37℃恒溫培養(yǎng)，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，選擇陽性菌進(jìn)行測序，序列測定委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

在NCBI網(wǎng)站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件中對獲得的綿羊KAP13-1核苷酸序列進(jìn)行比對，其與牛的KAP13-1基因mRNA序列(登陸號為NM_001080350.1)同源性為97％；與預(yù)測的羊的KAP13-1基因mRNA序列(登陸號為XM_004002776.3)同源性為99％。

實(shí)施例2：KAP13-1基因在綿羊毛囊中的表達(dá)模式

1.樣品采集：

采集2周歲的西藏羊(來源于西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院)皮膚組織，浸泡于4％的多聚甲醛溶液中24h-48h進(jìn)行固定。

2.石蠟切片的制作：

(1)漂洗：將皮膚組織置于脫水框中，用流水漂洗12-16h；

(2)脫水：將皮膚組織置于梯度酒精中脫水，70％，過夜；80％，2h；90％，2h；95％，2h；100％(I)，40min；100％(II)，40min；

(3)通透：將脫水的皮膚組織置于水楊酸甲酯中透明1h；

(4)浸蠟包埋：將通透的皮膚組織分別置于石蠟(I)2h；石蠟(II)3h；石蠟(III)3h，然后置于包埋框中進(jìn)行包埋固定；

(5)切片：切取厚度5μm皮膚組織切片。

3.免疫組化：

(1)烘片脫蠟：將石蠟切片放于60℃烘箱中30min，然后分別浸入二甲苯I 15min，二甲苯II 15min進(jìn)行脫蠟；

(2)復(fù)水：將切片依次置于梯度酒精中進(jìn)行復(fù)水，100％酒精I(xiàn) 5min，100％II酒精 5min，95％酒精 5min,90％酒精 5min，80％酒精 5min，75％酒精 5min，蒸餾水 5min；

(3)內(nèi)源性過氧化物酶的消除：將切片浸泡于3％雙氧水中，37℃25min；然后與蒸餾水中洗滌5min；

(4)微波修復(fù)：皮膚切片在0.01mol/L的檸檬酸鈉緩沖液中修復(fù)，微波至沸騰后冷卻5min，此步驟重復(fù)3次后冷卻至室溫；

(5)封閉：用PBS緩沖液(購自谷歌生物科技有限公司)洗滌皮膚切片3次，每次5min；在組織周圍勾畫疏水框，將5％BSA加入到疏水框內(nèi)，37℃20min；

(6)一抗孵育：滴加藏綿羊KAP13-1抗體(按體積比1:500稀釋)于疏水框內(nèi)，4℃孵育過夜；

(7)二抗孵育：PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；滴加二抗(購于武漢博士德生物工程有限公司)于組織上，37℃孵育30min；

(8)鏈霉親和素-生物素復(fù)合物SABC孵育：PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；加入SABC與組織上，37℃25min；

(9)顯色：PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；將DAB試劑(購自武漢博士德生物工程有限公司)中的A,B,C液依次滴加一滴于1mL蒸餾水中，混勻后加入組織上進(jìn)行顯色；

(10)蘇木素復(fù)染：在蘇木素中染色20s，用1％鹽酸酒精分化液分化2s；

(11)脫水封片：將切片置于烘箱中脫水10min，放入二甲苯I/II各15min，然后用中性樹膠封片，風(fēng)干后進(jìn)行圖像采集,結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明KAP13-1基因在綿羊的皮質(zhì)部表達(dá)。

實(shí)施例3：pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus載體的構(gòu)建

1.KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1載體的構(gòu)建

(1)KAP13-1-2A基因片段的擴(kuò)增：

用Oligo7軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增KAP13-1-2A基因片段的融合PCR引物，引物的具體序列如下：

擴(kuò)增KAP13-1-2A基因的引物對：

正向引物：5’-CCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGT

CCTACAACTGCTGCTCTGG-3’，

反向引物：5’-CTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTC

TGCCCTCGTAGAAGCCAGATCCACA-3’。

以上述的連接綿羊KAP13-1基因序列的T克隆載體為模板，PCR擴(kuò)增KAP13-1-2A基因，反應(yīng)體系剪表2。

表2 PCR反應(yīng)體系

(2)2A-ZSG片段的擴(kuò)增：

然后，根據(jù)寶生物工程大連有限公司的pZsGreen1-1載體中的綠熒光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列設(shè)計(jì)融合PCR引物，引物對的DNA序列如下：

擴(kuò)增2A-ZSG基因的引物對：

正向引物：5’-GATCTGGCTTCTACGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGA

CGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCCAGTCCAAG-3’，

反向引物：5’-GATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCAGGGCAAGG-3’。

以pZsGreen1-1載體為模板擴(kuò)增2A-ZSG基因，PCR反應(yīng)體系如表3。

表3 PCR反應(yīng)體系

(3)KAP13-1-2A-ZSG片段的擴(kuò)增：

取KAP13-1-2A PCR產(chǎn)物1μl和2A-ZSG PCR產(chǎn)物1μl于98μl dH₂O中并以其為模板通過融合PCR擴(kuò)增KAP13-1-2A-ZSG載體序列，PCR反應(yīng)如表4。

表4 PCR反應(yīng)程序

通過膠回收試劑盒(寶生物工程大連有限公司，MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，然后用SacII和NotI限制性內(nèi)切酶(購自寶生物工程大連有限公司)分別對純化產(chǎn)物KAP13-1-2A-ZSG片段和pZsGreen1-1載體(載體結(jié)構(gòu)如圖2a所示)進(jìn)行酶切，通過T4連接酶(購自賽默飛世爾科技)將KAP13-1-2A-ZSG片段連接到pZsGreen1-1載體上，構(gòu)建得到KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1載體(載體結(jié)構(gòu)如圖2b)。雙酶切體系和連接體系如表5。

表5雙酶切體系和連接體系

將5μl連接產(chǎn)物加入100μl感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置5min，42℃熱激45s，隨后將其涂到具有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-16h。然后挑取單個菌落于具有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃，220r/min培養(yǎng)過夜。通過上述擴(kuò)增KAP13-1-2A片段的PCR反應(yīng)鑒定陽性菌落，然后挑選陽性菌液測序，序列測定委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。通過NCBI網(wǎng)站的BLAST軟件比對獲得序列正確的KAP13-1-2A-ZSG片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

2.pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG載體的構(gòu)建

以藏綿羊的脾臟基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增約6kb的KAP11-1基因的啟動子序列，命名為pKAP11-1。所用引物序列如下所示：

綿羊KAP11-1啟動子序列：

正向引物：5’-CCGCTCGAGCCCCTGGATAGAAAGATCAGACCAA-3’，

反向引物：5’-TCCCCGCGGCTTGGTGCTGGTGGAGAGATGT-3’。

PCR反應(yīng)程序見表6。

表6 PCR反應(yīng)體系

然后，通過膠回收試劑盒(寶生物工程大連有限公司)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化；利用XhoI/SacII酶切回收片段，然后將pKAP11-1序列連接到KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1載體中，申請人將這個載體命名為重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG(載體結(jié)構(gòu)見圖2c)，PCR反應(yīng)體系見表7。

表7雙酶切體系和連接體系

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中并涂到具有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12-16h；挑取陽性單克隆于具有卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220r/min，培養(yǎng)過夜，序列測定委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。通過NCBI網(wǎng)站的BLAST軟件比對獲得序列正確的綿羊KAP11-1啟動子序列進(jìn)而獲得重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG(該載體序列如SEQ ID NO:3所示)。

實(shí)施例4：pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定

1.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

通過PiggyBac系統(tǒng)將pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG序列隨機(jī)整合到昆明小鼠的基因組上，獲得pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠(簡稱Plus小鼠)，轉(zhuǎn)基因小鼠的制備委托于北京唯尚立德生物科技有限公司完成。

2.轉(zhuǎn)基因陽性小鼠的鑒定

通過Oligo7軟件根據(jù)KAP13-1-2A-ZSG序列設(shè)計(jì)引物：

轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定引物：

正向引物：5’-GGTTCTAAGGCAAGCTGGTG-3’,

反向引物：5’-AGGTACATGCTCACGTCGC-3’。

對獲得的轉(zhuǎn)基因小鼠以基因組為模板進(jìn)行PCR檢測，PCR反應(yīng)體系如表8所示。

表8 PCR反應(yīng)體系

通過瓊脂糖凝膠鑒定目的基因是否成功插入昆明小鼠基因組中，結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明本發(fā)明共獲得3只陽性轉(zhuǎn)基因小鼠(如圖3所示)。

為了進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，申請人分別剪取三只轉(zhuǎn)基因小鼠的背部毛纖維和胡須毛纖維，將毛纖維均勻平鋪在裝有水的12孔培養(yǎng)板中，然后在熒光顯微鏡下檢測綠熒光蛋白ZSG的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明編號為6號的轉(zhuǎn)基因小鼠的毛纖維具有較強(qiáng)的綠熒光活性，編號為2號和4號的轉(zhuǎn)基因小鼠毛纖維的綠熒光活性極弱，因此本發(fā)明將編號為6號的轉(zhuǎn)基因小鼠用于后續(xù)研究中。

實(shí)施例5：KAP13-1在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)模式的鑒定

通過免疫組化和Western blotting方法檢測綿羊KAP13-1在Plus小鼠中的表達(dá)模式，結(jié)果表明KAP13-1在Plus小鼠毛纖維的皮質(zhì)部特異表達(dá)。具體操作步驟如下:

1.Western blotting：

(1)蛋白提取：采集出生后35:日齡的Plus小鼠的心、肝、脾、肺、腎、肌、腸、胃、腦、皮、毛；除毛之外的組織在組織裂解液(購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司)中破碎，12000rpm離心20min，吸取上清收集蛋白；通過姚金波等報(bào)道的優(yōu)化還原C法(姚金波等.毛紡科技,2003)提取毛纖維的蛋白，將毛纖維置于裂解液(亞硫酸氫鈉100％owf(對織物重)、脲300g/L、SDS 15g/L)，煮沸3h，12000rpm離心10min，吸取上清收集蛋白；

(2)電泳：將5×蛋白上樣緩沖液(購自武漢博士德生物工程有限公司)加入到提取的蛋白中，煮沸10min變性；然后將樣品加入到已制備好的聚丙酰胺凝膠中；在濃縮膠中恒壓80V電泳，在分離膠中恒壓100V電泳直至條帶分開；

(3)轉(zhuǎn)膜:以恒流250mA將聚丙烯胺凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時間為40-50min；

(4)封閉:將轉(zhuǎn)膜完畢的PVDF膜放置于5％的脫脂奶粉中封閉2-3h；

(5)一抗孵育：封閉完畢后，用5％脫脂奶粉按體積比為1:500的比例稀釋藏綿羊KAP13-1抗體，同時以體積比為1:1000稀釋內(nèi)參抗體Beta-actin(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，然后分別將將PVDF膜置于稀釋的抗體中4℃度孵育過夜；

(6)二抗孵育：在TBST漂洗液中洗滌PVDF膜，重復(fù)洗滌3-5次，每次5min。將辣根過氧化物(HRP)標(biāo)記的二抗(購自武漢博士德生物工程有限公司)按體積比為1:1000的比例稀釋于5％脫脂奶粉中，室溫下孵育1h；

(7)顯色：在TBST漂洗液中洗滌PVDF膜，重復(fù)洗滌3-5次，每次5min。用ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(購自Bio-Rad公司)對PVDF膜上的免疫印跡進(jìn)行顯色，通過ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀(GE healthcare)獲得圖像結(jié)果，如圖5所示。

2.組織免疫組化

(1)樣品采集：

采集出生后9天的Plus小鼠的皮膚組織，浸泡于4％的多聚甲醛溶液中24h-48h進(jìn)行固定。

(2)石蠟切片的制作：

漂洗：將Plus小鼠皮膚組織置于脫水框中，用流水漂洗12-16h；

脫水：將皮膚組織置于梯度酒精中脫水，70％，過夜；80％，2h；90％，2h；95％，2h；100％(I)，40min100％(II)，40min；

通透：將脫水的皮膚組織置于水楊酸甲酯中透明40min；

浸蠟包埋：將通透的皮膚組織分別置于石蠟(I)2h；石蠟(II)3h；石蠟(III)3h，然后置于包埋框進(jìn)行包埋固定；

切片：切取厚度5μm皮膚組織切片。

(3)免疫組化

烘片脫蠟：將石蠟切片放于60℃烘箱中30min，然后分別浸入二甲苯I 15min，二甲苯II 15min進(jìn)行脫蠟；復(fù)水：將切片依次置于梯度酒精中進(jìn)行復(fù)水，100％酒精I(xiàn) 5min，100％II酒精 5min,95％酒精 5min,90％酒精 5min，80％酒精 5min，75％酒精 5min，蒸餾水 5min；

內(nèi)源性過氧化物酶的消除：將切片浸泡于3％雙氧水中，37℃25min；然后與蒸餾水中洗滌5min；

微波修復(fù)：皮膚切片在0.01mol/L的檸檬酸鈉緩沖液中修復(fù)，微波至沸騰后冷卻5min，此步驟重復(fù)3次后冷卻至室溫；

封閉：用PBS緩沖液洗滌皮膚切片3次，每次5min；在組織周圍勾畫疏水框，將5％BSA加入到疏水框內(nèi)，37℃20min；

一抗孵育：滴加藏綿羊KAP13-1抗體(體積比為1:200稀釋)于疏水框內(nèi)，4℃孵育過夜；

二抗孵育：PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；滴加購于武漢博士德生物工程有限公司的辣根過氧化物

(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗于組織上，37度孵育30min；

SABC孵育：PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；加入SABC與組織上，37℃25min；

顯色：PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；將購自武漢博士德生物工程有限公司的DAB試劑中的A,B,C液依次滴加一滴于1mL蒸餾水中，混勻后加入組織上進(jìn)行顯色；

蘇木素復(fù)染：在蘇木素中染色20s，鹽酸酒精分化2s；

脫水封片：將切片置于烘箱中脫水10min，放入二甲苯I/II各15min，然后用中性樹膠封片，風(fēng)干后進(jìn)行圖像采集，結(jié)果如圖6所示。

實(shí)施例6：KAP13-1在轉(zhuǎn)基因小鼠的生物功能驗(yàn)證

本實(shí)施例分別采集出生后35天的Plus小鼠、皮質(zhì)部特異表達(dá)綠熒光蛋白的pKAP11-1-ZSG轉(zhuǎn)基因小鼠和野生昆明小鼠的Guard型毛纖維，每種類型的小鼠各6只，其中雄性小鼠3只，雌性小鼠3只；每只小鼠采集約40-60根Guard型毛纖維。然后通過顯微鏡測量距離毛囊底部130μm處的毛纖維直徑，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表9。

表9 Guard型毛纖維直徑統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

表9的說明：^**表示P<0.01,^*表示P<0.05。

由表9結(jié)果顯示，在相同性別測試中，本發(fā)明的Plus小鼠的Guard型毛纖維比pKAP11-1-ZSG轉(zhuǎn)基因小鼠和野生昆明小鼠Guard型毛纖維顯著變細(xì)。證明KAP13-1基因能夠顯著影響毛纖維的細(xì)度。

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9.姚金波等.還原C法制備羊毛角蛋白溶液的工藝優(yōu)化[J].毛紡科技,2003,5:10-13。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種KAP13-1基因在綿羊毛纖維細(xì)度鑒定中的應(yīng)用

<130>

<141> 2016-11-12

<160> 18

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 753

<212> DNA

<213> 綿羊（Ovis aries）

<220>

<221> gene

<222> (1)..(753)

<223>

<220>

<221> CDS

<222> (24)..(518)

<223>

<400> 1

cgtaactcac atcacctgcg aag atg tcc tac aac tgc tgc tct gga aac ttc 53

Met Ser Tyr Asn Cys Cys Ser Gly Asn Phe

1 5 10

tcc tcc cgc tcc ctc cgg gac cac ctg cgc tac tca ggc tcc tcc tgt 101

Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp His Leu Arg Tyr Ser Gly Ser Ser Cys

15 20 25

ggc tcc tcc ttc ccc agc aac ctg gtc tac agg act gac ctc tac tct 149

Gly Ser Ser Phe Pro Ser Asn Leu Val Tyr Arg Thr Asp Leu Tyr Ser

30 35 40

ccc agc tcc tgc cag ctg ggc tcc tct ctc tac agc cag gag acc tgc 197

Pro Ser Ser Cys Gln Leu Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Gln Glu Thr Cys

45 50 55

tgt gag ccc atc agg acc cag act gtg gtg tcc agt ccc tgc cag acg 245

Cys Glu Pro Ile Arg Thr Gln Thr Val Val Ser Ser Pro Cys Gln Thr

60 65 70

tcc tgc tac cgc ccg agg acc tcc acg ttc ttc agt ccc tgc cag acg 293

Ser Cys Tyr Arg Pro Arg Thr Ser Thr Phe Phe Ser Pro Cys Gln Thr

75 80 85 90

act tgc tct gga tct ctg ggc ttc ggt tcc agt aac ttg caa tct gct 341

Thr Cys Ser Gly Ser Leu Gly Phe Gly Ser Ser Asn Leu Gln Ser Ala

95 100 105

ggt cat gtt ttc cca tct ctg ggc ttt gga tcc ggt ggt ttc caa tcc 389

Gly His Val Phe Pro Ser Leu Gly Phe Gly Ser Gly Gly Phe Gln Ser

110 115 120

gtg ggt cac agc ccc aac att ttc tca tcc cta agt tgt aga tcc agc 437

Val Gly His Ser Pro Asn Ile Phe Ser Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser

125 130 135

ttt tac cgt ccc acc ttc ttc tct tct agg agt ggt cag tct ctt tct 485

Phe Tyr Arg Pro Thr Phe Phe Ser Ser Arg Ser Gly Gln Ser Leu Ser

140 145 150

ttc caa ccg acc tgt gga tct ggc ttc tac taa tgtcatactt gaatacaata 538

Phe Gln Pro Thr Cys Gly Ser Gly Phe Tyr

155 160

catactacat ctagaattta atgcaatgct taactatatc gagatctaca ctatctgttg 598

acctcttgtt ttacctttag cttataaatt tgacttctgc tgttacctac actggataag 658

gaataatttg aataccggta actgaaaatg tattcattga agaaaggtgc cataactact 718

cccttgtagc tatatagaca tgcgatacgg aagca 753

<210> 2

<211> 164

<212> PRT

<213> 綿羊

<400> 2

Met Ser Tyr Asn Cys Cys Ser Gly Asn Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg

1 5 10 15

Asp His Leu Arg Tyr Ser Gly Ser Ser Cys Gly Ser Ser Phe Pro Ser

20 25 30

Asn Leu Val Tyr Arg Thr Asp Leu Tyr Ser Pro Ser Ser Cys Gln Leu

35 40 45

Gly Ser Ser Leu Tyr Ser Gln Glu Thr Cys Cys Glu Pro Ile Arg Thr

50 55 60

Gln Thr Val Val Ser Ser Pro Cys Gln Thr Ser Cys Tyr Arg Pro Arg

65 70 75 80

Thr Ser Thr Phe Phe Ser Pro Cys Gln Thr Thr Cys Ser Gly Ser Leu

85 90 95

Gly Phe Gly Ser Ser Asn Leu Gln Ser Ala Gly His Val Phe Pro Ser

100 105 110

Leu Gly Phe Gly Ser Gly Gly Phe Gln Ser Val Gly His Ser Pro Asn

115 120 125

Ile Phe Ser Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Phe Tyr Arg Pro Thr Phe

130 135 140

Phe Ser Ser Arg Ser Gly Gln Ser Leu Ser Phe Gln Pro Thr Cys Gly

145 150 155 160

Ser Gly Phe Tyr

<210> 3

<211> 10596

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(10596)

<223>

<220>

<221> gene

<222> (6021)..(7262)

<223>

<220>

<221> promoter

<222> (37)..(5990)

<223>

<400> 3

tagttattac tagcgctacc ggactcagat ctcgagcccc tggatagaaa gatcagacca 60

agaacagttg cattgaaagg gcatcagcac aggtcagcta ggtgatgcta aagacaagat 120

ttaccttata cttctttctc tcacatagct cctattaata gcatccttat cctcctgggt 180

accaaggaga ccctgaataa ttctgtatca gggaaggata atacacttgt gtgactttgg 240

gccttctctc tggccctata cataaacgtt actcacgtct ggtcaaaggc gggttcactt 300

cttgttactt gaaagactgg gactggagca cataccagct acacatgtga tatcctgcaa 360

gagagtttgt ttggtctcca aacttgggaa tctacttact tttattgaga gcatcctgat 420

tctgatctcc aataaaagca ttcgtgaaaa aatacatgat tttgaaaaca ggcatgaaga 480

aagagaatgg cagttcaact ttggattttt caaccttaca ttatcctctg aggatttatt 540

tttctacaaa tcttgttgct ggtgattgct attttcaagt tctaaaagca gcaactattt 600

tgctggtctt tgcctgcttc tttcactttt ctgctttctg ccttacattt ccctccagcc 660

ccaaagattc aaacctttgt atgattgacg ctttttgaaa agagtttgga aaatgaattt 720

cagctcagtt ttggtgcaaa tcactcagcc tttggggggt ttataatgtc ttggttaata 780

agaattctgg agattcaagc tggaggtctg tgtgaagttg ggaaaaaatg gcagaacaat 840

tcagccaaga tgtattttgt ttttaaagca gtcattatgt tctgtcctta gaatttttca 900

attccctttt tatgtttttt aagatagaat gaatagcttt catttcagag tatgagcatc 960

ctggaaaagt gcaggatgac aaattctaat tttatgttta ttaatttttc agcaagttta 1020

atattgctcc attcgatgag actaggtgat ttttttttga accagcattg ataaacatta 1080

ttaccaattt tgtgataaaa aatatccttc ctgcatgtca aaacttcagc ctcccacaca 1140

tgcttaattc tttttactct caaacacttg gccttgtcag tgattgctgt gattcagttt 1200

tgagtgaaag aattgctcat ttccagtctg tgataattat tgtataaggc ttagattgtt 1260

ctatacaaac gagagcaaat tacccatcaa ggatgtagat aatgggtagt agtactttaa 1320

tctcctctca tcttctctca tcatatactc ctctcacttc acaccctgca gacacaggaa 1380

taatctttgc aaaccttttc gctgacttga agtttgatat tgcatataac tatctcgtga 1440

tagctgctgg atgcaaaatt ttttcttaca ttccaatgaa aggatgattt attgatttca 1500

cttagcaaca ctgtagactt agaatcatgt cttcaagctt catgttgctg tcagtgccta 1560

tttctttttt cttttggcaa attttagcat tgttttaatt aaggaacata gctgtttgaa 1620

acaggagatt ttaagctagt tgaatagaag caaagtgaaa gattcctcta ttaggatagc 1680

tgctatgaat aaaatcctta ctatgtggat ttgaattcca ttgtaaattt ggcactaaac 1740

aacactggtc taagccaaaa atttctcatt tttgtttaga agccctgaac attttctttc 1800

acatttaagg aggggaaagg gaagaaaagg aaaaggggaa aaaaagcact ctataataga 1860

atctcattag cttgataatg ggtatgctga ttgtaacttg gtactcccta aacaatttca 1920

gataatggca aacaacttaa aatgtaggtg agatgtgaat ttgcaaaaac ctctttcctt 1980

gatgtgcatg gttctttact tttgcatctt acactcaatt caaatgaaga atctagatgc 2040

tggcatttac atattgaatg tacaagagtg ttaagcagca attctagctc cttgtgtgtg 2100

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgct cagttgctgt catgtccaac tctttgtgac 2160

ccatggattt tagccccccg aggctcctct gtccttggga tttttccgta ggatattgta 2220

agacactagc ctttgctgtt tttcagagaa cttgccattt cgccggggct aaatattgag 2280

tagaaagcag tctattgatt agtgccttta gctctaacta tttaaagagt ctcttggttt 2340

tgcttacttt gtgacaggga gaaaactcta caatatcatc ttagagtgat tttgttaggg 2400

gaagcacact gactgaaact gcccaccctg gccaggccct ttagtaacca tttgcatgag 2460

ttattttatg accggagatc ctggtaagga atatggaact gataagccac cactaactgg 2520

aagagttcgg gaaaggtcaa aaggagacac cacgtgtcgg tccacttcca agaatccctc 2580

tcgctagcat ccatctaggc tgagcaatgc gtgcaccacc aggaaaaact ctgaattaga 2640

atgattggcc aaagaccacc ctgaaactaa tcctatcacc ataaaaccca agactgcaag 2700

ccacatggca gagcagttct cctgagttcc cctaccctgc taatctccac ctggttgccc 2760

tttcccaata aaatctcttg ctttgtcagc agatatgtct cctcggacaa ttcatttcca 2820

agtgttagac aagagcccag ttttgggctc tggaaggggt cccccttcct gcaacaattt 2880

cagaatttgt gagtcctgtt ttctcagagg agtcatgaca cctagatttc aaaactcaat 2940

tcacttctct attcttctct aataattagt tgtacatgtc accattaaaa ataatttcaa 3000

tttcaaattg tagctgcaag ctattaaagg ctttctgtct cttcctgctt tgtttgtagt 3060

gatcttgcac tttattctgt taggtagttg gaataggaaa aaggagtcca gcatggtggt 3120

ggctaaaaga caaggaaggg aaaagcccac taaaatagaa caaaggaagg tccaaggatt 3180

ggaatgagga cctcaggtag aacaaacagc actcctggct ggcccaattt acacaggaca 3240

agcccagggg gaggaggaaa gacatagaaa gaggagccaa agggcccagg ctctctgtct 3300

cttgtctttc tctctcttct ttttgcatct tttggtttgg catgccctca caccttgagg 3360

atgtattttc ctttattttc taaataagac agctgtaaca ctggtctatc tgagagctgt 3420

gacgcactga gggctttaac gtctgtcgct tcaaattttt gttgtgatga gacagaaccg 3480

aggaaattac acactcccct gacaattcta atgaagtaaa attatcaaaa ttatatatca 3540

tgaaaaaacc ctcataaagt ttaaagacag cagtgcttgt aacttactat ttaaaatttt 3600

atttattttt gttgttgtta attaatggaa ctggaataga cataaagact gtattctttg 3660

tggtgtcatc aataaaacat tgattacttg atttttcaaa taaatttttg cttgaacttt 3720

aatgaaggca tctcaccatg tttgaatatt cccagcatag gttcacaaca catgactctg 3780

ttttattcac atctcaactt agccaagtat aaactgtgtg actttggtta gtcattaaac 3840

ctccctgaac ttcagcttct ttatgtgaca tgatacctag tccttagggt tgctggatgc 3900

actctgttct gatggtgtat gtgaaatctc taatttaatg cctggaagag cctcaaaagt 3960

gttcatttcc tttccctctg aagctgaagg aagatgtttt ctagaatttt ttaaattatg 4020

atttttaact tttaatggaa aagagaaata aagacagagc aacagtttat acaaattctc 4080

ttccagaaat gtggcaatag gtattagaaa cttctcttgt gtcacttgac cactaacttc 4140

acattttcat gtggtcactt gattaattta cacaatgaag tacgtctcca cagctgtctg 4200

tgtatccctg gctggtagaa gcctgtaaac tacacatcca ttttcaaaga aggaagccag 4260

ctcctgtgac caggaccttg acctccaaac accaactggg aaattcccca tggttggaag 4320

agcatagtcc taaccttgtg gaaagtagtc atctctttaa tttctcccca tacccgagta 4380

catgtttgtg agccactgag ggagagacag tgtgatccct gggaattata atacgtccca 4440

cagcacagca tcgttttgtt ggggtgtatt attagcctcc aaattagagc cgtggggagc 4500

tcccaacatg gcttcagtgg gatgaataga gatgaataaa gcattcagca aaaggacttc 4560

tggtgagatc taacataaag ctgtttgctt tgtgcatgtt taaaatatag cctactacag 4620

ccctcaaata tatgtaaatt catcgctgtc actctttcct accccatgta agccagttta 4680

cataatgaat cagctcttac agctgttttg atgtagaaat atcaccaacc atttaagctg 4740

tgctgaagtg acttattttt ccagggttga aatggttttc tacagatgga tcacaaggct 4800

cagtcatttt ggcattggga actgaatccg ttgtagcaaa gtgaaatcac agagagaata 4860

tctttctatg gtttccccaa gaataaaaag aataattaaa tattacagcc cactgttcac 4920

acatccattc atcaccaaat attgattaag ggcctgtttc ctccactctc tcctcccttt 4980

atccttcatg tagacagtga ccctgaagag cctttgattt gtctgtgatg aaagtgcatc 5040

ctatctgtaa gtttttgtgt gaaaataaat gccttttgaa tatattgagc actttgagag 5100

aaagacatca tgccctttca aatgaacatt ataataattt aataaattaa ctaaacctgt 5160

tccactgaca cattgatgag tcatatgagt tgctcttatc cattgttaca agattaaaca 5220

ttttgggaat aaagctcatc caatttattg agaaagaaac ttggctacaa atgcagtccc 5280

acttaattag cttctgttcc aagttgccta gctgcttgaa cataaatggt gagtcccatt 5340

gccctctgag tttcctgggg gcatcttgct ctgatcactt aattgatttt ccaaaccagt 5400

ttgtactctg gatatatctt tgtgtccttt ttcagtcttg tcattatcat cttgaagcat 5460

attcaacaaa attctttgta gaagccccgt tagctatgga agagtgactg attaaattaa 5520

gcatattaag taccaacaac aatccaaaca gggtgtggct gtgtaatgag tcctggttag 5580

aagggagaga gggtgggatg gtagtgtgtt tggtgttact gtcagaggga cactcactgt 5640

atccacgcaa gatgaatgag ggatgaattg tgggctggga tgaccaatag ctttgaagct 5700

gtcaacccac ctccttaatc ctggaactaa gtacagtcca gaagcctttt gacttagtta 5760

ccaaactact aaactttctt tatgaggatg aaggcttttc aagagacaat taacctggaa 5820

attcacagga ggttctaagg caagctggtg tgagccaaag aagccaggaa ggtcagggtg 5880

ggagccccac ccaccagcaa gaatgtataa aagctcagaa gcctgaagtg gcattcacag 5940

ttcaagaacc agcctcagtg agttacccac atctctccac cagcaccaag ccgcgggccc 6000

gggatccacc ggtcgccacc atgtcctaca actgctgctc tggaaacttc tcctcccgct 6060

ccctccggga ccacctgcgc tactcaggct cctcctgtgg ctcctccttc cccagcaacc 6120

tggtctacag gactgacctc tactctccca gctcctgcca gctgggctcc tctctctaca 6180

gccaggagac ctgctgtgag cccatcagga cccagactgt ggtgtccagt ccctgccaga 6240

cgtcctgcta ccgcccgagg acctccacgt tcttcagtcc ctgccagacg acttgctctg 6300

gatctctggg cttcggttcc agtaacttgc aatctgctgg tcatgttttc ccatctctgg 6360

gctttggatc cggtggtttc caatccgtgg gtcacagccc caacattttc tcatccctaa 6420

gttgtagatc cagcttttac cgtcccacct tcttctcttc taggagtggt cagtctcttt 6480

ctttccaacc gacctgtgga tctggcttct acgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg 6540

gtgacgtgga ggagaatccc ggccctatgg cccagtccaa gcacggcctg accaaggaga 6600

tgaccatgaa gtaccgcatg gagggctgcg tggacggcca caagttcgtg atcaccggcg 6660

agggcatcgg ctaccccttc aagggcaagc aggccatcaa cctgtgcgtg gtggagggcg 6720

gccccttgcc cttcgccgag gacatcttgt ccgccgcctt catgtacggc aaccgcgtgt 6780

tcaccgagta cccccaggac atcgtcgact acttcaagaa ctcctgcccc gccggctaca 6840

cctgggaccg ctccttcctg ttcgaggacg gcgccgtgtg catctgcaac gccgacatca 6900

ccgtgagcgt ggaggagaac tgcatgtacc acgagtccaa gttctacggc gtgaacttcc 6960

ccgccgacgg ccccgtgatg aagaagatga ccgacaactg ggagccctcc tgcgagaaga 7020

tcatccccgt gcccaagcag ggcatcttga agggcgacgt gagcatgtac ctgctgctga 7080

aggacggtgg ccgcttgcgc tgccagttcg acaccgtgta caaggccaag tccgtgcccc 7140

gcaagatgcc cgactggcac ttcatccagc acaagctgac ccgcgaggac cgcagcgacg 7200

ccaagaacca gaagtggcac ctgaccgagc acgccatcgc ctccggctcc gccttgccct 7260

gagcggccgc gactctagat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 7320

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 7380

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 7440

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 7500

tcttaaggcg taaattgtaa gcgttaatat tttgttaaaa ttcgcgttaa atttttgtta 7560

aatcagctca ttttttaacc aataggccga aatcggcaaa atcccttata aatcaaaaga 7620

atagaccgag atagggttga gtgttgttcc agtttggaac aagagtccac tattaaagaa 7680

cgtggactcc aacgtcaaag ggcgaaaaac cgtctatcag ggcgatggcc cactacgtga 7740

accatcaccc taatcaagtt ttttggggtc gaggtgccgt aaagcactaa atcggaaccc 7800

taaagggagc ccccgattta gagcttgacg gggaaagccg gcgaacgtgg cgagaaagga 7860

agggaagaaa gcgaaaggag cgggcgctag ggcgctggca agtgtagcgg tcacgctgcg 7920

cgtaaccacc acacccgccg cgcttaatgc gccgctacag ggcgcgtcag gtggcacttt 7980

tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 8040

tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtcc 8100

tgaggcggaa agaaccagct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc 8160

tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga 8220

aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 8280

accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 8340

tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 8400

tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaagat 8460

cgatcaagag acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 8520

ttctccggcc gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 8580

ctgctctgat gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 8640

gaccgacctg tccggtgccc tgaatgaact gcaagacgag gcagcgcggc tatcgtggct 8700

ggccacgacg ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 8760

ctggctgcta ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 8820

cgagaaagta tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg catacgcttg atccggctac 8880

ctgcccattc gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 8940

cggtcttgtc gatcaggatg atctggacga agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 9000

gttcgccagg ctcaaggcga gcatgcccga cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 9060

tgcctgcttg ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 9120

ccggctgggt gtggcggacc gctatcagga catagcgttg gctacccgtg atattgctga 9180

agagcttggc ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 9240

ttcgcagcgc atcgccttct atcgccttct tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg 9300

ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc 9360

gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg acgccggctg gatgatcctc 9420

cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc gcccacccta gggggaggct aactgaaaca 9480

cggaaggaga caataccgga aggaacccgc gctatgacgg caataaaaag acagaataaa 9540

acgcacggtg ttgggtcgtt tgttcataaa cgcggggttc ggtcccaggg ctggcactct 9600

gtcgataccc caccgagacc ccattggggc caatacgccc gcgtttcttc cttttcccca 9660

ccccaccccc caagttcggg tgaaggccca gggctcgcag ccaacgtcgg ggcggcaggc 9720

cctgccatag cctcaggtta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa 9780

tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt 9840

gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat 9900

cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg 9960

gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga 10020

gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac 10080

tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt 10140

ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag 10200

cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc 10260

gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag 10320

gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca 10380

gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt 10440

cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc 10500

tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc 10560

cctgattctg tggataaccg tattaccgcc atgcat 10596

<210> 4

<211> 696

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(696)

<223>

<400> 4

atggcccagt ccaagcacgg cctgaccaag gagatgacca tgaagtaccg catggagggc 60

tgcgtggacg gccacaagtt cgtgatcacc ggcgagggca tcggctaccc cttcaagggc 120

aagcaggcca tcaacctgtg cgtggtggag ggcggcccct tgcccttcgc cgaggacatc 180

ttgtccgccg ccttcatgta cggcaaccgc gtgttcaccg agtaccccca ggacatcgtc 240

gactacttca agaactcctg ccccgccggc tacacctggg accgctcctt cctgttcgag 300

gacggcgccg tgtgcatctg caacgccgac atcaccgtga gcgtggagga gaactgcatg 360

taccacgagt ccaagttcta cggcgtgaac ttccccgccg acggccccgt gatgaagaag 420

atgaccgaca actgggagcc ctcctgcgag aagatcatcc ccgtgcccaa gcagggcatc 480

ttgaagggcg acgtgagcat gtacctgctg ctgaaggacg gtggccgctt gcgctgccag 540

ttcgacaccg tgtacaaggc caagtccgtg ccccgcaaga tgcccgactg gcacttcatc 600

cagcacaagc tgacccgcga ggaccgcagc gacgccaaga accagaagtg gcacctgacc 660

gagcacgcca tcgcctccgg ctccgccttg ccctga 696

<210> 5

<211> 1242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1242)

<223>

<400> 5

atgtcctaca actgctgctc tggaaacttc tcctcccgct ccctccggga ccacctgcgc 60

tactcaggct cctcctgtgg ctcctccttc cccagcaacc tggtctacag gactgacctc 120

tactctccca gctcctgcca gctgggctcc tctctctaca gccaggagac ctgctgtgag 180

cccatcagga cccagactgt ggtgtccagt ccctgccaga cgtcctgcta ccgcccgagg 240

acctccacgt tcttcagtcc ctgccagacg acttgctctg gatctctggg cttcggttcc 300

agtaacttgc aatctgctgg tcatgttttc ccatctctgg gctttggatc cggtggtttc 360

caatccgtgg gtcacagccc caacattttc tcatccctaa gttgtagatc cagcttttac 420

cgtcccacct tcttctcttc taggagtggt cagtctcttt ctttccaacc gacctgtgga 480

tctggcttct acgagggcag aggaagtctt ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc 540

ggccctatgg cccagtccaa gcacggcctg accaaggaga tgaccatgaa gtaccgcatg 600

gagggctgcg tggacggcca caagttcgtg atcaccggcg agggcatcgg ctaccccttc 660

aagggcaagc aggccatcaa cctgtgcgtg gtggagggcg gccccttgcc cttcgccgag 720

gacatcttgt ccgccgcctt catgtacggc aaccgcgtgt tcaccgagta cccccaggac 780

atcgtcgact acttcaagaa ctcctgcccc gccggctaca cctgggaccg ctccttcctg 840

ttcgaggacg gcgccgtgtg catctgcaac gccgacatca ccgtgagcgt ggaggagaac 900

tgcatgtacc acgagtccaa gttctacggc gtgaacttcc ccgccgacgg ccccgtgatg 960

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ggcatcttga agggcgacgt gagcatgtac ctgctgctga aggacggtgg ccgcttgcgc 1080

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ttcatccagc acaagctgac ccgcgaggac cgcagcgacg ccaagaacca gaagtggcac 1200

ctgaccgagc acgccatcgc ctccggctcc gccttgccct ga 1242

<210> 6

<211> 4672

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(4672)

<223>

<220>

<221> gene

<222> (97)..(1338)

<223>

<400> 6

tagttattac tagcgctacc ggactcagat ctcgagctca agcttcgaat tctgcagtcg 60

acggtaccgc gggcccggga tccaccggtc gccaccatgt cctacaactg ctgctctgga 120

aacttctcct cccgctccct ccgggaccac ctgcgctact caggctcctc ctgtggctcc 180

tccttcccca gcaacctggt ctacaggact gacctctact ctcccagctc ctgccagctg 240

ggctcctctc tctacagcca ggagacctgc tgtgagccca tcaggaccca gactgtggtg 300

tccagtccct gccagacgtc ctgctaccgc ccgaggacct ccacgttctt cagtccctgc 360

cagacgactt gctctggatc tctgggcttc ggttccagta acttgcaatc tgctggtcat 420

gttttcccat ctctgggctt tggatccggt ggtttccaat ccgtgggtca cagccccaac 480

attttctcat ccctaagttg tagatccagc ttttaccgtc ccaccttctt ctcttctagg 540

agtggtcagt ctctttcttt ccaaccgacc tgtggatctg gcttctacga gggcagagga 600

agtcttctaa catgcggtga cgtggaggag aatcccggcc ctatggccca gtccaagcac 660

ggcctgacca aggagatgac catgaagtac cgcatggagg gctgcgtgga cggccacaag 720

ttcgtgatca ccggcgaggg catcggctac cccttcaagg gcaagcaggc catcaacctg 780

tgcgtggtgg agggcggccc cttgcccttc gccgaggaca tcttgtccgc cgccttcatg 840

tacggcaacc gcgtgttcac cgagtacccc caggacatcg tcgactactt caagaactcc 900

tgccccgccg gctacacctg ggaccgctcc ttcctgttcg aggacggcgc cgtgtgcatc 960

tgcaacgccg acatcaccgt gagcgtggag gagaactgca tgtaccacga gtccaagttc 1020

tacggcgtga acttccccgc cgacggcccc gtgatgaaga agatgaccga caactgggag 1080

ccctcctgcg agaagatcat ccccgtgccc aagcagggca tcttgaaggg cgacgtgagc 1140

atgtacctgc tgctgaagga cggtggccgc ttgcgctgcc agttcgacac cgtgtacaag 1200

gccaagtccg tgccccgcaa gatgcccgac tggcacttca tccagcacaa gctgacccgc 1260

gaggaccgca gcgacgccaa gaaccagaag tggcacctga ccgagcacgc catcgcctcc 1320

ggctccgcct tgccctgagc ggccgcgact ctagatcata atcagccata ccacatttgt 1380

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gaatgcaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa 1500

tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc 1560

caaactcatc aatgtatctt aaggcgtaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg 1620

cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc 1680

cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga 1740

gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg 1800

atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag 1860

cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga 1920

acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg 1980

tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg 2040

cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 2100

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 2160

gaaaaaggaa gagtcctgag gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 2220

tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 2280

agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 2340

tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 2400

gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 2460

cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 2520

aggcttttgc aaagatcgat caagagacag gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag 2580

atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc tatgactggg 2640

cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc 2700

cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag 2760

cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca 2820

ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat 2880

ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata 2940

cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac 3000

gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag catcaggggc 3060

tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat gcccgacggc gaggatctcg 3120

tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg 3180

gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta 3240

cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg 3300

gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct 3360

gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg cccaacctgc catcacgaga 3420

tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc ggaatcgttt tccgggacgc 3480

cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag ttcttcgccc accctagggg 3540

gaggctaact gaaacacgga aggagacaat accggaagga acccgcgcta tgacggcaat 3600

aaaaagacag aataaaacgc acggtgttgg gtcgtttgtt cataaacgcg gggttcggtc 3660

ccagggctgg cactctgtcg ataccccacc gagaccccat tggggccaat acgcccgcgt 3720

ttcttccttt tccccacccc accccccaag ttcgggtgaa ggcccagggc tcgcagccaa 3780

cgtcggggcg gcaggccctg ccatagcctc aggttactca tatatacttt agattgattt 3840

aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 3900

caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 3960

aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 4020

accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 4080

aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 4140

ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 4200

agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 4260

accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 4320

gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 4380

tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 4440

cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 4500

cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 4560

cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 4620

ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgccatgc at 4672

<210> 7

<211> 5954

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(5954)

<223>

<400> 7

cccctggata gaaagatcag accaagaaca gttgcattga aagggcatca gcacaggtca 60

gctaggtgat gctaaagaca agatttacct tatacttctt tctctcacat agctcctatt 120

aatagcatcc ttatcctcct gggtaccaag gagaccctga ataattctgt atcagggaag 180

gataatacac ttgtgtgact ttgggccttc tctctggccc tatacataaa cgttactcac 240

gtctggtcaa aggcgggttc acttcttgtt acttgaaaga ctgggactgg agcacatacc 300

agctacacat gtgatatcct gcaagagagt ttgtttggtc tccaaacttg ggaatctact 360

tacttttatt gagagcatcc tgattctgat ctccaataaa agcattcgtg aaaaaataca 420

tgattttgaa aacaggcatg aagaaagaga atggcagttc aactttggat ttttcaacct 480

tacattatcc tctgaggatt tatttttcta caaatcttgt tgctggtgat tgctattttc 540

aagttctaaa agcagcaact attttgctgg tctttgcctg cttctttcac ttttctgctt 600

tctgccttac atttccctcc agccccaaag attcaaacct ttgtatgatt gacgcttttt 660

gaaaagagtt tggaaaatga atttcagctc agttttggtg caaatcactc agcctttggg 720

gggtttataa tgtcttggtt aataagaatt ctggagattc aagctggagg tctgtgtgaa 780

gttgggaaaa aatggcagaa caattcagcc aagatgtatt ttgtttttaa agcagtcatt 840

atgttctgtc cttagaattt ttcaattccc tttttatgtt ttttaagata gaatgaatag 900

ctttcatttc agagtatgag catcctggaa aagtgcagga tgacaaattc taattttatg 960

tttattaatt tttcagcaag tttaatattg ctccattcga tgagactagg tgattttttt 1020

ttgaaccagc attgataaac attattacca attttgtgat aaaaaatatc cttcctgcat 1080

gtcaaaactt cagcctccca cacatgctta attcttttta ctctcaaaca cttggccttg 1140

tcagtgattg ctgtgattca gttttgagtg aaagaattgc tcatttccag tctgtgataa 1200

ttattgtata aggcttagat tgttctatac aaacgagagc aaattaccca tcaaggatgt 1260

agataatggg tagtagtact ttaatctcct ctcatcttct ctcatcatat actcctctca 1320

cttcacaccc tgcagacaca ggaataatct ttgcaaacct tttcgctgac ttgaagtttg 1380

atattgcata taactatctc gtgatagctg ctggatgcaa aattttttct tacattccaa 1440

tgaaaggatg atttattgat ttcacttagc aacactgtag acttagaatc atgtcttcaa 1500

gcttcatgtt gctgtcagtg cctatttctt ttttcttttg gcaaatttta gcattgtttt 1560

aattaaggaa catagctgtt tgaaacagga gattttaagc tagttgaata gaagcaaagt 1620

gaaagattcc tctattagga tagctgctat gaataaaatc cttactatgt ggatttgaat 1680

tccattgtaa atttggcact aaacaacact ggtctaagcc aaaaatttct catttttgtt 1740

tagaagccct gaacattttc tttcacattt aaggagggga aagggaagaa aaggaaaagg 1800

ggaaaaaaag cactctataa tagaatctca ttagcttgat aatgggtatg ctgattgtaa 1860

cttggtactc cctaaacaat ttcagataat ggcaaacaac ttaaaatgta ggtgagatgt 1920

gaatttgcaa aaacctcttt ccttgatgtg catggttctt tacttttgca tcttacactc 1980

aattcaaatg aagaatctag atgctggcat ttacatattg aatgtacaag agtgttaagc 2040

agcaattcta gctccttgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgctcagttg 2100

ctgtcatgtc caactctttg tgacccatgg attttagccc cccgaggctc ctctgtcctt 2160

gggatttttc cgtaggatat tgtaagacac tagcctttgc tgtttttcag agaacttgcc 2220

atttcgccgg ggctaaatat tgagtagaaa gcagtctatt gattagtgcc tttagctcta 2280

actatttaaa gagtctcttg gttttgctta ctttgtgaca gggagaaaac tctacaatat 2340

catcttagag tgattttgtt aggggaagca cactgactga aactgcccac cctggccagg 2400

ccctttagta accatttgca tgagttattt tatgaccgga gatcctggta aggaatatgg 2460

aactgataag ccaccactaa ctggaagagt tcgggaaagg tcaaaaggag acaccacgtg 2520

tcggtccact tccaagaatc cctctcgcta gcatccatct aggctgagca atgcgtgcac 2580

caccaggaaa aactctgaat tagaatgatt ggccaaagac caccctgaaa ctaatcctat 2640

caccataaaa cccaagactg caagccacat ggcagagcag ttctcctgag ttcccctacc 2700

ctgctaatct ccacctggtt gccctttccc aataaaatct cttgctttgt cagcagatat 2760

gtctcctcgg acaattcatt tccaagtgtt agacaagagc ccagttttgg gctctggaag 2820

gggtccccct tcctgcaaca atttcagaat ttgtgagtcc tgttttctca gaggagtcat 2880

gacacctaga tttcaaaact caattcactt ctctattctt ctctaataat tagttgtaca 2940

tgtcaccatt aaaaataatt tcaatttcaa attgtagctg caagctatta aaggctttct 3000

gtctcttcct gctttgtttg tagtgatctt gcactttatt ctgttaggta gttggaatag 3060

gaaaaaggag tccagcatgg tggtggctaa aagacaagga agggaaaagc ccactaaaat 3120

agaacaaagg aaggtccaag gattggaatg aggacctcag gtagaacaaa cagcactcct 3180

ggctggccca atttacacag gacaagccca gggggaggag gaaagacata gaaagaggag 3240

ccaaagggcc caggctctct gtctcttgtc tttctctctc ttctttttgc atcttttggt 3300

ttggcatgcc ctcacacctt gaggatgtat tttcctttat tttctaaata agacagctgt 3360

aacactggtc tatctgagag ctgtgacgca ctgagggctt taacgtctgt cgcttcaaat 3420

ttttgttgtg atgagacaga accgaggaaa ttacacactc ccctgacaat tctaatgaag 3480

taaaattatc aaaattatat atcatgaaaa aaccctcata aagtttaaag acagcagtgc 3540

ttgtaactta ctatttaaaa ttttatttat ttttgttgtt gttaattaat ggaactggaa 3600

tagacataaa gactgtattc tttgtggtgt catcaataaa acattgatta cttgattttt 3660

caaataaatt tttgcttgaa ctttaatgaa ggcatctcac catgtttgaa tattcccagc 3720

ataggttcac aacacatgac tctgttttat tcacatctca acttagccaa gtataaactg 3780

tgtgactttg gttagtcatt aaacctccct gaacttcagc ttctttatgt gacatgatac 3840

ctagtcctta gggttgctgg atgcactctg ttctgatggt gtatgtgaaa tctctaattt 3900

aatgcctgga agagcctcaa aagtgttcat ttcctttccc tctgaagctg aaggaagatg 3960

ttttctagaa ttttttaaat tatgattttt aacttttaat ggaaaagaga aataaagaca 4020

gagcaacagt ttatacaaat tctcttccag aaatgtggca ataggtatta gaaacttctc 4080

ttgtgtcact tgaccactaa cttcacattt tcatgtggtc acttgattaa tttacacaat 4140

gaagtacgtc tccacagctg tctgtgtatc cctggctggt agaagcctgt aaactacaca 4200

tccattttca aagaaggaag ccagctcctg tgaccaggac cttgacctcc aaacaccaac 4260

tgggaaattc cccatggttg gaagagcata gtcctaacct tgtggaaagt agtcatctct 4320

ttaatttctc cccatacccg agtacatgtt tgtgagccac tgagggagag acagtgtgat 4380

ccctgggaat tataatacgt cccacagcac agcatcgttt tgttggggtg tattattagc 4440

ctccaaatta gagccgtggg gagctcccaa catggcttca gtgggatgaa tagagatgaa 4500

taaagcattc agcaaaagga cttctggtga gatctaacat aaagctgttt gctttgtgca 4560

tgtttaaaat atagcctact acagccctca aatatatgta aattcatcgc tgtcactctt 4620

tcctacccca tgtaagccag tttacataat gaatcagctc ttacagctgt tttgatgtag 4680

aaatatcacc aaccatttaa gctgtgctga agtgacttat ttttccaggg ttgaaatggt 4740

tttctacaga tggatcacaa ggctcagtca ttttggcatt gggaactgaa tccgttgtag 4800

caaagtgaaa tcacagagag aatatctttc tatggtttcc ccaagaataa aaagaataat 4860

taaatattac agcccactgt tcacacatcc attcatcacc aaatattgat taagggcctg 4920

tttcctccac tctctcctcc ctttatcctt catgtagaca gtgaccctga agagcctttg 4980

atttgtctgt gatgaaagtg catcctatct gtaagttttt gtgtgaaaat aaatgccttt 5040

tgaatatatt gagcactttg agagaaagac atcatgccct ttcaaatgaa cattataata 5100

atttaataaa ttaactaaac ctgttccact gacacattga tgagtcatat gagttgctct 5160

tatccattgt tacaagatta aacattttgg gaataaagct catccaattt attgagaaag 5220

aaacttggct acaaatgcag tcccacttaa ttagcttctg ttccaagttg cctagctgct 5280

tgaacataaa tggtgagtcc cattgccctc tgagtttcct gggggcatct tgctctgatc 5340

acttaattga ttttccaaac cagtttgtac tctggatata tctttgtgtc ctttttcagt 5400

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agaagcctga agtggcattc acagttcaag aaccagcctc agtgagttac ccacatctct 5940

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctcctccacg tcaccgcatg ttagaagact tcctctgccc tcgtagaagc cagatccaca 60

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gatctggctt ctacgagggc agaggaagtc ttctaacatg cggtgacgtg gaggagaatc 60

ccggccctat ggcccagtcc aag 83

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gattatgatc tagagtcgcg gccgctcagg gcaagg 36

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