本發(fā)明涉及以分子克隆手段表達的豚鼠補體C1q-B為免疫原免疫小鼠，獲得雜交瘤細胞株60G4及其產(chǎn)生的單克隆抗體。60G4單抗與豚鼠補體C1q具有高度親和力，可以應用于對豚鼠補體C1q的檢測中，本發(fā)明主要對60G4單抗在補體結合酶聯(lián)免疫吸附試驗(CF-ELISA)中的應用進行了實例驗證。本發(fā)明屬生物制品領域。技術背景單克隆抗體技術是1975年英國科學家Milstein和Kohler所發(fā)明，并獲得1984年諾貝爾醫(yī)學獎。單克隆抗體具有高度的特異性，定向性。通過單克隆抗體可以獲得高特異，準確定位的免疫學檢測技術。本專利通過采用原核表達的豚鼠補體C1q-B免疫小鼠，取小鼠B淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌抗豚鼠補體C1q-B單克隆抗體的雜交瘤細胞。從而獲得可用于檢測豚鼠補體C1q的單克隆抗體。目前，豚鼠補體是補體結合類試驗的關鍵試劑。補體結合類試驗在免疫學檢測中有廣泛應用，包括傳統(tǒng)的補體結合試驗，新型CF-ELISA技術等。單克隆抗體具有高度的反應特異性，補體結合試驗也被公認為是一種特異性較高的檢測特異性抗原抗體反應的技術。本發(fā)明可將2者結合，有利于獲得高特異性的檢測結果。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種高親和力及高特異性的抗豚鼠補體C1q單克隆抗體，及其在免疫檢測、補體結合實驗方面的應用。為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株60G4已于2015年9月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為(CGMCCN0.11186)。本發(fā)明還提供了一種高親和力高特異性的結補體的C1q單克隆抗體60G4，由上述雜交瘤細胞株產(chǎn)生。另外，上述本發(fā)明提供的單克隆抗體或所述雜交瘤細胞株在制備用于檢測或輔助檢測豚鼠補體C1q-B的免疫檢測工具時的應用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，所述免疫檢測工具具體為試劑、試劑盒、芯片或試紙。上述本發(fā)明提供的單克隆抗體在制備用于檢測豚鼠補體C1q-B的免疫檢測產(chǎn)品中的應用、在制備用于診斷豚鼠補體C1q-B相關性的免疫疾病的產(chǎn)品中的應用、在制備檢測或輔助檢測布魯氏菌病CF-ELISA的免疫檢測工具中的應用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，所述免疫檢測工具具體為試劑、試劑盒、芯片或試紙。另外，本發(fā)明還保護一種布魯氏菌病檢測試劑盒，該試劑盒中含有前述本發(fā)明提供的單克隆抗體。本發(fā)明以分子克隆手段表達了豚鼠補體C1q-B，免疫小鼠并融合骨髓瘤細胞后獲得了能分泌豚鼠補體C1q單克隆抗體的雜交瘤細胞株命名為豚鼠補體C1q-B60G4單克隆抗體。本發(fā)明所述的單克隆抗體的制備方法如下：1、豚鼠補體C1q-B基因的克隆、表達；根據(jù)豚鼠補體C1q-B基因序列(XM_003471337.3.)，設計一對引物，以cDNA為模板進行PCR擴增；上下游引物分別引入EcoRI和Xhol酶切位點，插入表達載體，轉化大腸桿菌BL21(DE3)plyssS感受態(tài)細胞，篩選提取陽性克隆菌pET-32a(+)-C1q-B-BL21，用0.1mmol/L的IPTG誘導重組蛋白表達，取誘導后菌液離心取沉淀進行超聲，超聲后沉淀即為超聲豚鼠補體C1q-B；其中，豚鼠補體C1q-B基因序列(XM_003471337.3.)的具體序列如下：2、雜交瘤細胞株建立與豚鼠補體C1q-B單克隆抗體60G4的鑒定；采用原核表達豚鼠補體C1q-B重組蛋白免疫雌性BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，采用ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，經(jīng)有限稀釋法獲得能分泌抗豚鼠補體C1q-B特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為60G4，豚鼠補體C1q-B單克隆抗體60G4為IgG(IgG1)類型，抗體輕鏈亞型均為κ鏈；雜交瘤細胞株60G4接種小鼠的腹水，檢測效價及親和常數(shù)，驗證該單克隆抗體的靈敏度及特異性。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種所述單克隆抗體60G4在制備用于檢測豚鼠補體C1q-B的免疫檢測工具時的應用。進一步的，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體60G4在制備用于檢測豚鼠補體C1q-B的免疫檢測方法時的應用。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體60G4在制備用于診斷豚鼠補體C1q-B相關性的免疫疾病中的應用。本發(fā)明還提供了所述單克隆抗體在布魯氏菌病CF-ELISA檢測技術中應用。本發(fā)明還對豚鼠補體C1q-B60G4單抗用于CF-ELISA檢測布魯氏菌病抗體等的檢測進行了驗證試驗，結果顯示此檢測技術具有良好的特異性、敏感性、可操作性，具有良好的應用前景。有益效果：本發(fā)明通過采用原核表達的豚鼠補體C1q-B免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，篩選能夠穩(wěn)定分泌高親和力的抗豚鼠補體C1q-B單克隆抗體的雜交瘤細胞株。從而獲得可用于檢測豚鼠補體C1q的單克隆抗體。本發(fā)明所述單克隆抗體60G4，可與豚鼠補體C1q-B特異性結合，提高了實驗的特異性和可靠性。應用所述單克隆抗體60G4對豚鼠補體C1q-B60G4的檢測技術及方法具有良好的特異性、敏感性、可操作性，具有良好的應用前景。保藏說明參據(jù)的生物材料(株)：參據(jù)NCBI中已上傳的C1q-B基因序列(XM_003471337.3.)科學描述：此豚鼠補體C1Q雜交瘤細胞能穩(wěn)定的分泌特異性的單克隆抗體保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2015年9月8日；保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.11186附圖說明圖1豚鼠脾臟cDNA擴增結果；其中1-3泳道為C1q-B圖2菌落PCR鑒定結果；其中1-3泳道為C1q-B圖3雙酶切鑒定結果；其中泳道1為pET-32a(+)空質粒，泳道2為pET-32a(+)-C1q-B重組質粒圖4pET-32a(+)-C1q-B-BL21(plysS)重組菌誘導表達SDS-PAGE結果；其中泳道M為170KDa蛋白Marker，泳道1為空白質粒誘導后水浴，泳道3為重組菌誘導后超聲沉淀；泳道4為誘導前超聲沉淀具體實施方式為了使本領域的技術人員更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。實施例1、豚鼠補體C1q-B基因的克隆及表達采用Trizol(天根，北京)試劑提取豚鼠脾臟組織樣本總RNA。使用Takara(大連)PrimeScriptTMonestepRT-PCR試劑盒，以脾總RNA為模板，采用adapter-T合成cDNA第一鏈，合成方法參照說明書。根據(jù)豚鼠補體C1q-B基因序列，設計一對引物，以cDNA為模板進行PCR擴增，擴增出的片段大小約為為750bp，與預期大小(746bp)一致(見圖1)。以GENBANK中的豚鼠補體C1q-B基因序列的編碼區(qū)為模板，設計針對其編碼區(qū)的特異性引物，上游引物：5‘-CCGGAATTCATGAAGATCCCGTGGG-3’，下游引物：5‘-CCGCTCGAGTCACAGCTCCACATCCG3’，上下游引物分別引入EcoRI和Xhol酶切位點(下劃線部分)，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應試劑選用2*EsTaqMasterMix(Takara，大連)，擴增體系包括12.5ul2*EsTaqMasterMix，9.5ulDEPC水，上、下游引物及模板各1ul。反應條件：94℃預變性2min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s。共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min，擴增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，用膠回收試劑盒(Takara，大連)回收。將PCR膠回收產(chǎn)物、pET-32a(+)載體分別同時進行EcoRI和Xhol限制性內(nèi)切酶雙酶切，并對酶切產(chǎn)物進行膠回收。用常規(guī)方法將酶切后膠回收目的片段和載體進行連接，轉化大腸桿菌BL21(DE3)plysS感受態(tài)細胞，進行氨芐青霉素抗性篩選，對抗性菌落按常規(guī)堿裂解法提取質粒，EcoRI和Xhol雙酶切和PCR同時鑒定，對陽性質粒pET-32a(+)-C1q-B送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。菌落PCR(結果見圖2)，空質粒及重組質粒雙酶切測序結果(見圖3)將陽性克隆菌液pET-32a(+)-C1q-BL21(plysS)在37℃恒溫搖床中震蕩培養(yǎng)，待OD600接近1.0時。用0.1mmol/L的IPTG誘導重組蛋白表達。取誘導后菌液及誘導前菌液離心后取沉淀進行取超聲裂解上清和超聲裂解沉淀(包涵體)，進行SDS-PAGE分析(結果見圖4)，45KDa處出現(xiàn)條帶，與預期大小一致。實施例2、雜交瘤細胞株建立與豚鼠補體C1q-B單抗60G4鑒定將原核表達豚鼠補體C1q-B重組蛋白免疫雌性BALB/c小鼠，測定小鼠血清中抗體的效價，當效價達到1:4.2×105后，取脾臟制成單細胞懸液，將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0融合。融合后第8天，采用ELISA法檢測融合細胞的培養(yǎng)液，選擇強陽性孔進一步克隆，經(jīng)有限稀釋法3次克隆，篩選出1株強陽性單克隆細胞株，命名為豚鼠補體C1q-B雜交瘤細胞株60G4，所分泌的單克隆抗體為豚鼠補體C1q-B單抗60G4。雜交瘤細胞株60G4經(jīng)連續(xù)傳代30代，能穩(wěn)定分泌單抗60G4。豚鼠補體C1q-B單抗60G4為IgG(IgG1)類型，抗體輕鏈亞型均為κ鏈；雜交瘤細胞株60G4接種小鼠的腹水效價≥1:200(OD450nm值≥2.00)；親合常數(shù)(Ka)在108～1011M-1之間。所述雜交瘤細胞株60G4已于2015年9月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為(CGMCCN0.11186)。實施例3、BALB/c小鼠的豚鼠補體C1q-B60G4單抗腹水效價測定1.試驗方法(1)用1:10稀釋豚鼠補體包被酶標板，每孔100μl，2～8℃包被18小時以上，用200μl/孔洗滌液洗滌5次。棄洗滌液，用10％的小牛血清200μL/孔在2～8℃封閉18小時以上。200μl/孔洗滌液洗滌5次。(2)用樣品稀釋液將待測豚鼠補體C1q-B單抗60G4倍數(shù)稀釋至1:8192以上，分別加入板孔中，每孔100μl。置37℃反應30min后，用200μl/孔洗滌液洗滌5次。(3)每孔加HRP標記抗鼠IgG抗體100μl。置37℃反應30min后，用200μl/孔洗滌液洗滌5次。(4)每孔加底物A、B液各50μl，混勻，室溫避光顯色10min。(5)每孔加入終止液50μl，混勻后測定OD450nm。2.試驗結果試驗成立條件為空白對照的OD450值＜0.20。當OD450nm值≥2.00的豚鼠補體C1q-B單抗60G4最高稀釋度為其效價，結果見表1。表13批豚鼠補體C1q-B單抗60G4效價測定結果經(jīng)對3批豚鼠補體C1q-B單抗60G4效價測定顯示，其效價均可達1:512以上，能滿足CF-ELISA使用要求。實施例4、豚鼠補體C1q-B單抗60G4在布魯氏菌病CF-ELISA試劑盒中的使用1.試驗方法(1)取抗原包被板，將20倍濃縮洗滌液用無菌蒸餾水稀釋20倍后，200μl/孔洗板一次；(2)用樣品稀釋液將待檢血清樣品1:100稀釋后加入板孔中，每孔100μl。將陰性血清、強陽性對照血清、弱陽性對照血清1:100稀釋后各加兩孔，每孔100μl。另設空白對照各兩孔。置37℃反應30min后，用200μl/孔洗滌液洗滌5次；(3)用樣品稀釋液將豚鼠補體待1:10稀釋后加入板孔中，每孔100μl。置37℃反應30min后，用200μl/孔洗滌液洗滌5次；(4)用樣品稀釋液將HRP標記豚鼠補體C1q-B單抗60G4應用濃度加入板孔中，每孔100μl。置37℃反應30min后，用200μl/孔洗滌液洗滌5次；(5)每孔加底物A、B液各50μl，混勻，室溫避光顯色10min；(6)每孔加入終止液50μl，混勻后測定OD450nm。2.結果判定試驗成立條件為陰性對照血清的OD450nm值＜0.20，強陽性對照血清的OD450nm值應≥1.00，弱陽性對照血清的OD450nm值應在0.4～0.80之間。樣本Cuttoff值(S/P)≥2.1P為陽性。檢測結果見表2表288份來自感染牛群血清樣品的檢測結果注：a＝強陽性對照血清；b＝弱陽性對照血清；c＝陰性對照血清；d＝空白對照；根據(jù)Cutoff值(S/P)＝2.1P＝2.1×(0.098+0.096)＝0.204判定，88份來自感染牛群血清樣品中，17份樣品為布魯氏菌病陽性。結果見表3。表388份來自陰性牛群血清樣品的檢測結果123456789101112A0.1470.1210.1010.1100.0910.0880.0960.0990.1060.0970.1141.298aB0.1700.0990.0840.0930.0880.1200.0920.0990.1090.1100.0811.397aC0.0860.0870.0890.0810.0850.0860.1020.0920.0820.0870.0930.597bD0.0970.0830.1090.0790.0900.0750.0920.0770.0800.0780.0800.602bE0.0990.1580.1100.0740.0720.0820.1230.0760.0970.0810.0950.098cF0.1600.1460.0840.1550.0840.0910.0920.0810.0900.0860.1270.099cG0.1380.0750.1070.1180.1020.1430.1430.0990.0910.0890.0770.109dH0.1460.1040.1000.0950.0910.0900.0710.1450.0870.1030.1000.097d注：a＝強陽性對照血清；b＝弱陽性對照血清；c＝陰性對照血清；d＝空白對照；根據(jù)Cuttoff值(S/P)＝2.1P＝2.1×(0.098+0.099)＝0.207判定，88份來自陰性牛群血清樣品全部為布魯氏菌病陰性。3.結果討論利用基于豚鼠補體C1q-B單抗60G4建立的布魯氏菌病CF-ELISA試劑盒對88份感染牛群血清及88份陰性牛群血清進行檢測，在試驗對照成立的條件下，判定88份來自感染牛群血清樣品中，17份樣品為布魯氏菌病陽性；判定88份來自陰性牛群血清樣品全部為布魯氏菌病陰性。證實此單抗的確可以用于建立布魯氏菌病CF-ELISA抗體檢測試劑盒。當前第1頁1 2 3