1.一種KAP13-1基因在毛纖維細度鑒定中的應(yīng)用,其特征在于,包括以下步驟:
(1)根據(jù)登陸號為NM_001080350.1的牛KAP13-1基因的核苷酸序列設(shè)計引物,所述的引物的正向引物為:CGTAACTCACATCACCTGCG,反向引物為:TGCTTCCGTATCGCATGTCT,以綿羊皮膚cDNA為模板,用RT-PCR方法擴增綿羊KAP13-1基因的部分核苷酸序列,純化PCR產(chǎn)物,克隆并測序,獲得如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;
(2)根據(jù)綿羊KAP13-1基因編碼的氨基酸序列制備綿羊KAP13-1的多克隆抗體,通過免疫組化檢測KAP13-1基因在綿羊毛囊皮質(zhì)部的表達量;
(3)利用2A肽序列構(gòu)建綿羊KAP11-1啟動子驅(qū)動的共表達綿羊KAP13-1和綠熒光蛋白ZsGreen1的重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG;根據(jù)綿羊KAP13-1基因序列和載體pZsGreen1-1中綠熒光蛋白基因序列設(shè)計如下引物:
擴增KAP13-1基因:
正向引物:
CCGCGGGCCCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTCCTACAACTGCTGCTCTGG,
反向引物:
CTCCTCCACGTCACCGCATGTTAGAAGACTTCCTCTGCCCTCGTAGAAGCCAGATCCACA;
擴增GFP-ZSG基因:
正向引物:
GATCTGGCTTCTACGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGGCCCAGTCCAAG,
反向引物:GATTATGATCTAGAGTCGCGGCCGCTCAGGGCAAGG;
通過融合PCR擴增得到KAP13-1-2A-ZSG片段,回收PCR產(chǎn)物,酶切后,利用連接酶將KAP13-1-2A-ZSG片段連接入Sac II/Not I雙酶切的載體pZsGreen1-1中,通過克隆、測序獲得如SEQ ID NO:6所示序列的載體KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1;
利用正向引物:CCGCTCGAGCCCCTGGATAGAAAGATCAGACCAA和反向引物:TCCCCGCGGCTTGGTGCTGGTGGAGAGATGT,以綿羊脾臟基因組為模板PCR擴增KAP11-1基因啟動子序列,PCR產(chǎn)物回收后,酶切連接到載體KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1中,通過克隆、測序獲得重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG,其序列如SEQ ID NO:3所示;
(4)利用PiggyBac系統(tǒng)將重組片段pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG隨機整合到昆明小鼠的基因組上,獲得pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠,通過PCR在基因組水平鑒定陽性轉(zhuǎn)基因小鼠,在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)基因小鼠毛纖維中GFP的表達量;同時檢測綿羊KAP13-1蛋白在pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠各組織中的表達量及鑒定綿羊KAP13-1基因在pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠毛纖維皮質(zhì)部的表達量;
(5)分別采集35日齡的pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG-plus轉(zhuǎn)基因小鼠,皮質(zhì)部特異表達綠色熒光蛋白的pKAP11-1-ZSG轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型昆明小鼠的Guard型毛纖維并測量距離毛囊底部130μm處毛纖維的直徑;
其中:
綿羊KAP13-1基因的部分核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;
綿羊KAP13-1基因的編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO:1中24-518位堿基對應(yīng)的序列所示;
2A肽序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示;
KAP13-1-2A-ZSG片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;
載體KAP13-1-2A-ZSG-ZsGreen1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示;
綿羊KAP11-1啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示;
重組載體pKAP11-1-KAP13-1-2A-ZSG的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示;
綠熒光蛋白基因ZsGreen1的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。