專利名稱：：P-選擇蛋白抗體及其應(yīng)用的制作方法有關(guān)申請的相互參考本申請是1993年5月5日申請的08/057，292的一個部分繼續(xù)申請，而08/057，292又是現(xiàn)已放棄的1992年5月5日申請的07/880，196的一個部分繼續(xù)申請。這些申請以其全文作為本申請的參考資料。
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請一般地涉及可與細(xì)胞表面受體P-選擇蛋白上有功能的抗原決定簇起反應(yīng)的新型免疫球蛋白。本發(fā)明還一般地涉及應(yīng)用這些抗體進行診斷和治療的方法。發(fā)明背景細(xì)胞相互吸附的能力在發(fā)育、正常生理及疾病過程(如發(fā)炎)中起著關(guān)鍵作用。此能力由吸附分子所得，這些分子通常是在細(xì)胞膜上表達的糖蛋白。通常是一種細(xì)胞上的一個吸附分子會與不同種細(xì)胞上的另一吸附分子相結(jié)合，形成一個受體-反應(yīng)體對。吸附分子的三大重要類群是整合蛋白，選擇蛋白和免疫球蛋白(Ig)超家簇成員(見Springer，Nature346425(1990)；Osborn，Cell623(1990)；Hynes，Cell6911(1992)，在此所有這些文獻以其全文作為本申請的參考資料)。這些分子對白細(xì)胞和血小板與其自身及胞外基質(zhì)和血管內(nèi)皮的相互作用尤其必需。P-選擇蛋白也被稱為CD62，粒狀膜蛋白140(GMP-140)或血小板激活依賴性粒狀外膜(PADGEM)或LECCAM-3，它是一特化的位于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板上的細(xì)胞表面受體，其涉及各種循環(huán)細(xì)胞的識別。P-選擇蛋白為一表面糖蛋白，帶有一凝集素樣結(jié)構(gòu)域，一與表皮生長因子同源的區(qū)域及一與補體調(diào)節(jié)蛋白同源的區(qū)域(見McEver，BloodCells1673-83(1990))。P-選擇蛋白的結(jié)構(gòu)與另兩個細(xì)胞表面受體的結(jié)構(gòu)相似，這兩個受體是白細(xì)胞內(nèi)皮吸附分子(ELAM-1)和淋巴細(xì)胞歸巢受體(LHR)。由于它們都擁有一個凝集素樣的結(jié)構(gòu)域以及吸附功能的選擇性，建議用“選擇蛋白”這個術(shù)語來指代這一普遍的受體群。P-選擇蛋白位于對多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答的血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的表面，介導(dǎo)血小板-白細(xì)胞和內(nèi)皮-白細(xì)胞的相互作用。相比之下，ELAM-1只在內(nèi)皮細(xì)胞上表達，LHR則在外周淋巴結(jié)的內(nèi)皮微靜脈內(nèi)的多種白細(xì)胞上表達。P-選擇蛋白的表達是可誘導(dǎo)的且不在未激活的內(nèi)皮細(xì)胞或血小板上表達。P-選擇蛋白的表達不需要從頭合成，因為它被貯存在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的分泌顆粒(或Weibel-Palade體)中。因此，在用凝血酶、組胺或佛波酯類或其它體液因子將這兩種細(xì)胞的任一種激活后數(shù)分鐘內(nèi)，P-選擇蛋白就被快速重新分配到此細(xì)胞的可與其它細(xì)胞結(jié)合的表面上。目前已報道了許多P-選擇蛋白的鼠抗體(見，如美國專利4,783,330，WO91/06632，PCT申請FR90/00565，McEver等，J.Biol.Chem.2599799-9804(1984)；Geng等，Nature343757-760；Parmentier等，Blood771734-1739(1991)，P-選擇蛋白的另外一個抗體已被描述于LaJollaCalifornia的Scripps研究所的論文中，并在于1992年1月16日舉行的一個“根本原理學(xué)術(shù)討論會”(KeystoneColloquium)上提出。其中某些阻斷P-選擇蛋白介導(dǎo)的吸附的抗體是鈣離子依賴性的。利用P-選擇蛋白抗體所做的體外實驗已對此受體的配位體特異性提供了一個有限的了解。已有人報道P-選擇蛋白可結(jié)合嗜中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些癌細(xì)胞(Bevilacqua等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA849238-9242(1987)；Geng等，Nature343757-760(1990)；Larsen等，Cell63467-474(1990)；及Polley等.)。也有人報道P-選擇蛋白將Lex作為一高親和力的配位體加以識別(Larsen等，Cell63467-474(1990))，然而，以后的實驗表明事實上含SLex的寡糖對P-選擇蛋白介導(dǎo)的吸附有比Lex更強的抑制作用(Polley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA886224-6228(1991))。P-選擇蛋白在體外參與細(xì)胞間吸附表明，與其它吸附因子一樣，P-選擇蛋白可能參與了在體內(nèi)促成炎癥的細(xì)胞間的相互作用。然而，P-選擇蛋白可能于其中起主要作用的特殊炎癥疾病尚未被闡明。與之相似，能有效阻斷P-選擇蛋白介導(dǎo)的特異炎癥的藥劑的抗原決定簇的特異性也屬未明。在已知的P-選擇蛋白抗體中，有些可與P-選擇蛋白結(jié)合但并不阻斷其介導(dǎo)的胞間相互作用，其它的則有些阻斷力，但僅在高的鈣離子濃度下才表現(xiàn)，此條件在體內(nèi)并不總是存在。高鈣離子濃度的體內(nèi)缺乏會導(dǎo)致這些作為治療制劑的抗體失效。而且，目前生產(chǎn)的所有P-選擇蛋白抗體都來源于鼠，因此在臨床應(yīng)用時可能導(dǎo)致人抗鼠抗體反應(yīng)(HAMA)?；谏鲜?，顯然需求有適當(dāng)抗原特異性并能在體內(nèi)阻斷導(dǎo)致炎癥的胞間相互作用的、對抗P-選擇蛋白的新型藥劑。此種制劑也最好不要在治療人時引起HAMA反應(yīng)。本發(fā)明圓滿實現(xiàn)了此種及它種需求。本發(fā)明的概述一方面，本發(fā)明提供了能特異結(jié)合P-選擇蛋白的阻斷性抗體。其中的一個典型抗體被命名為muMAbPB1.3(由ATCC保藏號為HB11041的一個細(xì)胞株產(chǎn)生)。競爭抑制實驗表明，其它的抗體能競爭性地抑制muMAbPB1.3對P-選擇蛋白的結(jié)合。優(yōu)選的抗體能在無鈣離子時與P-選擇蛋白結(jié)合。本發(fā)明的抗體包含完整抗體及其片段如Fab，F(xiàn)ab’F(ab’)2，F(xiàn)abc及Fv。另一方面，本發(fā)明也提供了藥物組合物。這些組合物包括如上所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體及一藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明也提供了治療免疫系統(tǒng)疾病的治療方法。這些方法包括將一有效劑量的上述藥物組合物給予患者。急性肺損傷和局部缺血再充血損傷是本發(fā)明可治療的病例。本發(fā)明的一些抗體是人源化免疫球蛋白。人源化免疫球蛋白包括人源化重鏈和人源化輕鏈。人源化輕鏈包括三個氨基酸序列來源于鼠免疫球蛋白PB1.3輕鏈的相應(yīng)互補決定區(qū)的互補決定區(qū)(CDR1，CDR2和CDR3)及一來源于人kappa輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架。人源化重鏈包括三個氨基酸序列來源于鼠PB1.3免疫球蛋白重鏈的相應(yīng)互補決定區(qū)的互補決定區(qū)(CDR1，CDR2和CDR3)及來源于人重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架。人源化免疫球蛋白可特異地與P-選擇蛋白結(jié)合，結(jié)合親和力的下限約為107m-1，上限約為鼠PB1.3免疫球蛋白的結(jié)合親和力的5倍。在許多人源化免疫球蛋白中，人kappa輕鏈的可變區(qū)構(gòu)架序列在選自由L21，L46，L60和L70組成的第一組中的至少一個位置上被位于鼠PB1.3免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的等價位置上的氨基酸所取代。與此相似，人重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列也在選自由H1，H2，H71和H73組成的第二組中的至少一個位置上被位于鼠PB1.3重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的等價位置上的氨基酸所取代。一些人源化免疫球蛋白的人源化重鏈可變區(qū)構(gòu)架是一個21/28’CL重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列。一些人源化免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)構(gòu)架是一個DEN輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列。典型的成熟輕鏈可變區(qū)氨基酸序列示于圖14-17。典型的成熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列示于圖11-13。優(yōu)選的人源化免疫球蛋白包括圖17所示的成熟輕鏈可變區(qū)和圖12所示的成熟重鏈可變區(qū)。本發(fā)明提供了完整的人源化免疫球蛋白和人源化免疫球蛋白片段如Fab，F(xiàn)ab’F(ab’)2，F(xiàn)abc和Fv。一些人源化免疫球蛋白進一步包括一個恒定區(qū)，此恒定區(qū)可以有效應(yīng)子功能，也可以沒有。另一方面，本發(fā)明提供了編碼上述人源化免疫球蛋白的核酸，一些核酸編碼重鏈，另一些編碼輕鏈。本發(fā)明也提供了編程在監(jiān)視器上或打印機上顯示上述免疫球蛋白的三維構(gòu)型的計算機。本發(fā)明還提供了包括上述人源化免疫球蛋白和一藥物學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了用上述人源化免疫球蛋白檢測P-選擇蛋白的方法。將人源化免疫球蛋白給予病人或來源于此病人的組織樣品。通過檢測免疫球蛋白和被檢樣品中的P-選擇蛋白特異結(jié)合所形成的復(fù)合體可示出P-選擇蛋白的存在。本發(fā)明還提供了用人源化免疫球蛋白治療患免疫系統(tǒng)疾病的病人的方法。這些方法包括將有效劑量的上述藥物組合物給予病人。易于治療的疾病包括局部缺血-再充血損傷和急性肺損傷。例如，這些組合物對治療表皮、心肌、腎、大腦、脾、肝、脊髓、內(nèi)臟、肺、局部或全身性局部缺血的病人是有用的。另一方面，本發(fā)明還進一步提供了產(chǎn)生人源化免疫球蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株。這些穩(wěn)定細(xì)胞株包括兩個核酸片段。一個核酸片段編碼上述人源化免疫球蛋白的重鏈，此片段可通過操作連于一啟動子后表達此重鏈。另一核酸片段編碼人源化免疫球蛋白的輕鏈，此片段可通過操作連于另一啟動子后表達此輕鏈。優(yōu)選的細(xì)胞株每天能產(chǎn)生約30μg人源化免疫球蛋白/106細(xì)胞。另一方面，本發(fā)明提供了P-選擇蛋白片段。這些片段可長達100個氨基酸，這些氨基酸包括來自示于圖34的氨基酸序列的448位-467位間的至少五個連續(xù)氨基酸。在優(yōu)選的片段中，這些氨基酸包括448位-467位氨基酸的完整的連續(xù)片段。附圖的簡要說明圖1列出了本發(fā)明的抗炎免疫球蛋白抑制凝血酶激活的血小板對嗜中性白細(xì)胞的結(jié)合的數(shù)據(jù)。圖2A和2B顯示了以通透性(圖2A)和出血(圖2B)為指標(biāo)測量時，本發(fā)明的抗炎免疫球蛋白有效地防止由于注入眼鏡蛇毒液因子(CVF)所引起的肺損傷。圖3A-3H顯示了眼鏡蛇毒液注入所引發(fā)的在動物肺中P-選擇蛋白表達量的提高，通過muMAbPB1.3的辣根過氧化物酶的染色而可見。(a)-(d)組顯示了注入CVF后不同時間P-選擇蛋白在肺微靜脈中的表達。時間0，5，10，15分鐘分別與a、b、c和d組相對(圖3A)、圖3B是光學(xué)透射電子顯微鏡照片，顯示用200μg非阻斷性P-選擇蛋白抗體(muMAbPNB1.6)處理后(圖框a、c)或用阻斷性P-選擇蛋白抗體(muMAbPB1.3)處理后(圖框b、d)CVF所誘導(dǎo)的鼠急性肺損傷。用PNB1.6處理的動物中，廣泛的肺泡內(nèi)出血顯示了血管的損傷(圖框a)，并伴隨有嗜中性白細(xì)胞(圖框c，箭頭)在血管內(nèi)的凝集，與內(nèi)皮細(xì)胞接觸緊密。與之相反，用muMAbPB1.3處理的動物中未見肺泡內(nèi)出血(圖框b)，血管內(nèi)的嗜中性白細(xì)胞與內(nèi)皮也幾乎沒有接觸(圖框d，箭頭)，(圖框a和b為用甲苯胺藍染色的樹脂包埋切片，放大160倍；圖框c和d，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛染色，放大2250倍)。圖4顯示了單克隆抗體muMAbPB1.3對P-選擇蛋白的結(jié)合用EDTA螯合二價陽離子所產(chǎn)生的作用。圖中空心符號(較低的曲線)是在Ca++和Mg++存在下的結(jié)合，而實心符號(較高的曲線)是在EDTA存在下的結(jié)合?？贵w以1.6mg/ml的起始濃度被稀釋。圖5顯示了多肽CQNRYTDLVAIQNKNE對muMAbPB1.3與P-選擇蛋白的結(jié)合的作用。實心符號是在0.35mg/ml多肽存在下的情況，空心符號則是多肽不存在時的情況。muMAbPB1.3的稀釋始于1.6mg/ml的溶液。圖6A、6B和6C顯示了單克隆抗體交叉阻斷對P-選擇蛋白的結(jié)合的能力。阻斷性抗體濃度為50μg/ml，生物素標(biāo)記的抗體的稀釋起始濃度為muMAbPB1.31.6mg/ml，muMAbPNB1.60.87mg/ml及muMAb84/260.59mg/ml。圖7顯示了在對照條件下凝血酶誘導(dǎo)的血小板的凝集程度在不存在抗體時和在漸增的純化muMAbPB1.3抗體濃度(1-100μg/ml)時是相同的。圖8顯示了以危及面積百分比表達的心肌局部缺血程度。用阻斷性P-選擇蛋白抗體(muMAbPB1.3)處理的動物中缺血程度明顯低于用非阻斷性P-選擇蛋白抗體處理的動物中的缺血程度。而且，與muMAbPNB1.6處理的動物相比，用muMAbPB1.3處理的動物的冠狀動脈在乙酰膽堿作用下的舒張能力明顯地較大。與PNB1.6處理的動物相比，muMAbPB1.3處理的動物的心肌組織中PMN數(shù)量有所降低，這表明這些現(xiàn)象可歸因于心肌白細(xì)胞濾出的減小。圖9顯示了PB1.3重鏈信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖10顯示了PB1.3輕鏈信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖11顯示了CY1748重鏈A的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖12顯示了CY1748重鏈B的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖13顯示了CY1748重鏈C的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖14顯示了CY1748輕鏈A的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖15顯示了CY1748輕鏈B的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖16顯示了CY1748輕鏈C的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖17顯示了CY1748輕鏈D的信號肽和可變區(qū)的序列和翻譯。圖18顯示了表達人重鏈(gamma-1恒定區(qū))的neo質(zhì)粒的物理圖譜。圖19顯示了表達人輕鏈(kappa恒定區(qū))的neo質(zhì)粒的物理圖譜。圖20顯示了嵌合的PB1.3和重構(gòu)的CY1748譯本對rsP-選擇蛋白的結(jié)合曲線。圖21顯示了嵌合的PB1.3和重構(gòu)的CY1748譯本對rsP-選擇蛋白的結(jié)合曲線。圖22顯示了嵌合的PB1.3和重構(gòu)的CY1748譯本對rsP-選擇蛋白的結(jié)合曲線。圖23顯示了表達人重鏈(gamma-1恒定區(qū))的dhfr質(zhì)粒的物理圖譜。圖24顯示了表達人重鏈(gamma-4恒定區(qū))的dhfr質(zhì)粒的物理圖譜。圖25顯示了被PB1.3平CY1748RHA/RLA-IgG1所抑制的生物素標(biāo)記的PB1.3與rsP-選擇蛋白的結(jié)合。圖26顯示了被PB1.3和CY1748RHB/RLD-IgG4所抑制的生物素標(biāo)記的PB1.3與rsP-選擇蛋白的結(jié)合。圖27顯示了抗體PB1.3防止了兔耳局部缺血和再充血后的腫脹。圖28顯示了抗體PB1.3防止了兔耳局部缺血和再充血后的壞死的發(fā)展。圖29顯示了抗體PB1.3抑制了由肥大細(xì)胞脫粒劑化合物48/80誘導(dǎo)的白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用。圖30顯示了推測的P-選擇蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域的折疊模式。圖31顯示了用于確定PB1.3識別的抗原決定簇所作的P-選擇蛋白的各種缺失突變體。圖32顯示了PB1.3和兔多克隆抗體與P-選擇蛋白缺失突變體的結(jié)合。圖33顯示了PB1.3和P6H6與P-選擇蛋白和P-選擇蛋白△5CRP(它缺失了P-選擇蛋白的第5個CRP)的結(jié)合。圖34顯示了由P-選擇蛋白第五個CRP區(qū)的氨基酸序列所衍生的合成多肽的序列及PB1.3對這些固定化多肽的反應(yīng)活性。全長P-選擇蛋白多肽的氨基酸按Johnston等，Cell561033-1044(1989)的標(biāo)準(zhǔn)進行編號。定義20個天然氨基酸的縮寫遵照傳統(tǒng)用法(Immunology-ASynthesis(第二版，E.S.Golub和D.R.Gren編，SinanerAssociates，Sunderland，MA1991)。20個常用氨基酸的立體異構(gòu)體(如D-氨基酸)，非天然氨基酸如α，α-二取代氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸及其它非常用氨基酸也可以是本發(fā)明的多肽的合適組分。非常用氨基酸包括4-羥脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基賴氨酸，ε-N-乙酰賴氨酸，O-磷酸絲氨酸，N-乙酰絲氨酸，N-甲酰甲硫氨酸，3-甲基組氨酸，5-羥基賴氨酸，ω-N-甲基精氨酸及其它類似氨基酸和亞氨基酸(如4-羧脯氨酸)，而且氨基酸也可以經(jīng)糖基化作用、磷酸化作用等被修飾。本文中提及多肽時，其左向為氨基端方向，右向為羧基端方向，這是與標(biāo)準(zhǔn)用法和傳統(tǒng)相一致的。同樣，除非特殊說明，單鏈多核苷酸序列的左端為5’端，雙鏈多核苷酸序列的左向指5’方向。新合成RNA轉(zhuǎn)錄物的5’到3’的延伸方向被稱為轉(zhuǎn)錄方向。位于與RNA序列相同的DNA鏈上的、其5’端對應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5’端的序列區(qū)被稱為“上游序列”。位于與RNA序列相同的DNA鏈上的、其3’端對應(yīng)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3’端的序列區(qū)被稱為“下游序列”。短語“多核苷酸序列”指從5’端到3’端的單鏈或雙鏈脫氧核糖核酸堿基或核糖核酸堿基的多聚物，包括自主復(fù)制的質(zhì)粒，感染性的DNA或RNA多聚體和非功能性DNA或RNA。以下術(shù)語用于描述兩個或多個核苷酸間的序列關(guān)系“參考序列”、“比較窗口”、“序列相同”、“序列相同百分率”和“大體相同”?！皡⒖夹蛄小笔且挥糜谛蛄袑Ρ鹊幕A(chǔ)序列；一個參考序列可以是一更大序列的亞單位，如作為列于序列表中的一全長cDNA或基因序列(如圖9-17中的一個多核苷酸序列)的一部分，也可以包括一完整的DNA或基因序列。一般地，參考序列至少長達20個核苷酸，一般不少于25個核苷酸，經(jīng)常不少于50個核苷酸。由于兩個多核苷酸都可以(1)包含一個在二者間相似的序列(即完整多核苷酸的一部分)，(2)進一步包括一個在二者之間有差異的序列，所以兩個或多個核苷酸之間的序列對比一般通過比較兩個多核苷酸的“比較窗口”來確認(rèn)并對比序列相似的局部區(qū)域來實現(xiàn)?！氨容^窗口”在此指至少包括20個連續(xù)的核酸位置的概念性區(qū)段，多核苷酸序列可在此與至少包括20個連續(xù)核苷酸的參考序列相比較。為了最適地對比這兩段序列，比較窗口內(nèi)的多核苷酸序列部分，與參考序列(不包含增補或缺失)相比，可以包括不超過20％的增補或缺失(即斷裂)。為確定比較窗口，被比較序列的最適對比可依照下列方法來完成Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2482(1981))的局部同源算法、Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48443(1970)的同源對比算法、Pearson和Lipman的相似性方法研究(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)852444(1988))(這些文獻以其全文作為本申請的參考資料)，這些算法的計算機化(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA及TFASTAintheWisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI)或目視法。然后選擇出按這種方法產(chǎn)生的最佳的對比(即在比較窗口處可導(dǎo)致最高的序列相似百分率)。術(shù)語“序列相同”指兩個核苷酸序列在比較窗口處是完全相同的(即，基于核苷酸與核苷酸的對比)。術(shù)語“序列相同百分率”通過下述方法算得比較在比較窗口處最適對比的兩個序列，確定在二序列中出現(xiàn)相同的核酸堿基(如，A、T、C、G、V或I)的位置數(shù)以獲得配對位置數(shù)，用比較窗口內(nèi)的總位置數(shù)(即，窗口大小)除配對位置數(shù)，將結(jié)果乘以100便得到序列相同百分率。術(shù)語“大體相同”指多核苷酸與參考序列相比在比較窗口上至少有85％的序列相同，優(yōu)選90-95％，更經(jīng)常的則是至少99％的序列相同，比較窗口至少有20個核苷酸，通常是25-50個核苷酸。其中序列相同百分率是通過將參考序列與多核苷酸序列(此序列在比較窗口處包括不超過參考序列的20％的增補或缺失)相比較而算得的。參考序列可以是一個較大序列(如示于圖10-17的序列)的一部分。對于多肽而言，術(shù)語“序列相同”指多肽在相對應(yīng)的位置上擁有相同的氨基酸?！靶蛄邢嗨啤眲t指多肽在相對應(yīng)的位置上有相同或相似的氨基酸(即保守取代)。術(shù)語“大體相同”指在最適對比下(如用GAP或BESTFIR程序)，兩個多肽序列至少有80％的序列相同，優(yōu)選的是不少于90％，95％以上更優(yōu)選(如99％的序列相同)，而且氨基酸殘基的不同最好由保守氨基酸取代引起。術(shù)語“大體相似”指二多肽有相應(yīng)百分比的序列相似。術(shù)語“大體上純的”指一種物質(zhì)是主要的存在成分(即以分子數(shù)而言，它比任何其它成分的量都大)，且大體上純的部分最好占所有大分子的50％(分子數(shù))以上。一般地，大體上純的成分應(yīng)占該組合物大分子總數(shù)的80-90％，該物質(zhì)最好被純化到基本均一的程度(常規(guī)手段不能測出污染物的存在)從而組合物便基本上只包含一種大分子。為了將氨基酸取代劃分為保守性的和非保守性的，氨基酸被分為以下幾組組I(疏水側(cè)鏈)包括正亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；組II(中性親水性側(cè)鏈)包括半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；組III(酸性側(cè)鏈)包括天冬氨酸、谷氨酸；組IV(堿性側(cè)鏈)包括天冬酰胺，谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸；組V(影響多肽鏈取向的殘基)包括甘氨酸、脯氨酸；組VI(芳香側(cè)鏈)包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。保守取代指同組內(nèi)氨基酸間的互換，非保守取代指不同組間氨基酸的互換。成熟的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸被分別稱為Hx和Lxx，其中x是按照Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1987)和(1991))的方案指明的氨基酸的位置數(shù)(以后這個參考文獻統(tǒng)稱為“Kabat等”，并以其全文作為本申請的參考資料)。Kabat等為每個抗體亞群列出了許多氨基酸序列，并在每個位置上列出了該亞群最常出現(xiàn)的氨基酸。Kabat等使用了一種為序列中每個氨基酸分配一個殘基數(shù)的方法，此方法已成為該領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法。通過將被研究抗體與Kabat等的保守序列一起對比，可以將Kabat等的方案擴展到不被其綱目所包括的其它抗體上。利用Kabat等的計數(shù)系統(tǒng)可以方便地認(rèn)明不同抗體的等價位置上的氨基酸。例如，一個人抗體的L50位上的氨基酸的位置等價于一個鼠抗體的L50位置。“免疫球蛋白”、“抗體”或“抗體多肽”指完整抗體或其可與完整抗體競爭的P-選擇蛋白的結(jié)合片段?！按篌w上抑制”指至少抑制50％，優(yōu)選抑制60％-80％，更經(jīng)常的則是大于85％(以體外競爭結(jié)合試驗來測量)。嵌合抗體是指從來源于不同種生物的免疫球蛋白基因片段，通常通過遺傳工程的方法，構(gòu)建出其重鏈和輕鏈基因的抗體。例如可將鼠單克隆抗體基因的可變區(qū)(V)部分與人的恒定區(qū)(C)部分如γ1和γ4相連接。顯然也可用其它的哺乳動物，但典型的治療用嵌合抗體是由鼠抗體的V區(qū)或抗原結(jié)合區(qū)與人抗體的C區(qū)或效應(yīng)子區(qū)組成的雜種蛋白。優(yōu)選實施方案的描述本發(fā)明提供了抑制由P-選擇蛋白介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的疾病及病情的藥物組合物和方法。本發(fā)明尤其提供了具有在體內(nèi)抑制P-選擇蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞吸附能力的免疫球蛋白。I、免疫球蛋白的特征A、概述眾所周知，抗體的基本結(jié)構(gòu)單位包括一個四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對多肽鏈有一個“輕”鏈(大約25KDa)和一個“重”鏈(約50-70KDa)。每個鏈的氨基端部分包括一個由約100110或更多的氨基酸組成的主要負(fù)責(zé)抗原識別的可變區(qū)。每個鏈的羧基端部分界定了一個負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。輕鏈分為k(kappa)或λ(lamda)兩種。重鏈則分為γ，μ，α，δ或ε，并分別將抗體確定為IgG，IgM，IgA，IgD和IgE型。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)由約12或更多個氨基酸組成的“J”區(qū)所連結(jié)，同時重鏈還包括一個約10個或更多個氨基酸組成的“D”區(qū)(主要見FundamentalImmunology(PaulW.編，第二版，Raven出版社，N.Y.1989)，第七章)。(以其全文作為本申請的參考資料)。每對輕/重鏈的可變區(qū)形成抗體的結(jié)合位點。所有的鏈都有由三個超變區(qū)(也稱為互補決定區(qū)或CDR)連結(jié)的相對保守的構(gòu)架區(qū)(FR)組成的一個相同的普遍結(jié)構(gòu)。每對的兩個鏈上的CDR由構(gòu)架區(qū)所排列，使之能與特異性抗原決定簇相結(jié)合。CDR和FR殘基按照上述Kabat等的標(biāo)準(zhǔn)序列定義進行描述。Chothia等建議了另外一種結(jié)構(gòu)定義(J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Natrue342878-883(1989)；及J.Mol.Biol.186651-663(1989))(此后統(tǒng)稱為Chothia等，并以其全文作為本申請的參考資料)。B、結(jié)合特異性和親和力本發(fā)明的免疫球蛋白(或抗體)可選擇性地結(jié)合與應(yīng)答組織損傷和發(fā)炎有關(guān)的P-選擇蛋白的有功能的抗原決定簇。一般地，抗體與P-選擇蛋白的有功能的抗原決定簇的結(jié)合能在體內(nèi)有效地抑制白細(xì)胞吸附激活的血小板和/或激活的血管內(nèi)皮。有此特性的抗體稱為“阻斷性抗體”。優(yōu)選的阻斷性抗體能抑制白細(xì)胞對激活的血管內(nèi)皮的吸附以預(yù)防或抑制發(fā)炎或血栓病情。本發(fā)明的許多阻斷性抗體與被稱為muMAbPB1.3的典型抗體競爭以特異與P-選擇蛋白結(jié)合。產(chǎn)生muMAbPB1.3抗體的一個雜交瘤依照布達佩斯條約已保藏于AmericanTypeCultureCollection，Rockville，Manyland，保藏號為HB11041。此單克隆抗體的生產(chǎn)述于實施例1。本發(fā)明的其它阻斷性抗體可與另外一個被稱為84/26的典型抗體相競爭。通過測量被測免疫球蛋白對一參考抗體(如muMAbPB1.3)與P-選擇蛋白分子上的一抗原決定簇的特異性結(jié)合的抑制來確定競爭。目前已經(jīng)知道了許多類型的競爭結(jié)合試驗，如固相直接或間接放射免疫試驗(RIA)，固相直接或間接酶免疫試驗(EIA)，夾心競爭試驗(見Stahli等，MethodsinEnzymology9242-253(1983))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(見Kirkland等，J.Immunol.1373614-3619(1986))；固相直接標(biāo)記實驗，固相直接標(biāo)記夾心試驗(見，Harlow和Lane，“Antibodies，ALaboratoryManual”，ColdSpringHarbor出版社(1988))；用I-125標(biāo)記的固相直接標(biāo)記RIA(見Morel等，Molec.Immunol.，25(1)7-15(1988))；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等，Virology，176546-552(1990))；以及直接標(biāo)記RIA(Moldenhauer等，Scand.J.Immunol.3277-82(1990))。一般地，這樣的試驗涉及到利用結(jié)合到固體表面的純化的P-選擇蛋白或產(chǎn)生P-選擇蛋白的細(xì)胞，未被標(biāo)記的待測免疫球蛋白及標(biāo)記的參考免疫球蛋白。競爭抑制可通過確定被測免疫球蛋白存在時結(jié)合到固體表面的標(biāo)記量來測定。通常被測免疫球蛋白過量存在。一個適當(dāng)?shù)母偁幗Y(jié)合試驗的例子可見于實施例8。由競爭試驗確認(rèn)的抗體(競爭性抗體)包括與參考抗體結(jié)合相同抗原決定簇的抗體和結(jié)合到距參考抗體結(jié)合的抗原決定簇足夠近的以致能發(fā)生位阻現(xiàn)象的鄰近抗原決定簇的抗體。通常，當(dāng)競爭抗體過量存在時，它至少可以將參考蛋白與P-選擇蛋白的特異結(jié)合抑制10％，25％，50％或75％。被muMAbPB1.3結(jié)合的抗原決定簇已被定位于P-選擇蛋白的448和467位氨基酸之間。見圖34和Johnson等，Cell561033-1044(1989)(在此以其全文作為本申請的參考資料)。此抗原決定簇位于P-選擇蛋白的第5個CRP區(qū)域。見圖30。與muMAbPB1.3競爭的抗體通常結(jié)合到448和467位氨基酸之間的片段上或第5個CRP區(qū)域內(nèi)的另一片段上。本發(fā)明的許多阻斷性抗體的結(jié)合特異性通過在鈣離子完全或大體上不存在時(如在體外測定中在25mmEDTA(一種鈣離子螯合劑)存在時以及鈣離子不存在時)，其與P-選擇蛋白的結(jié)合能力來進一步確定。阻斷活性要求鈣離子輔助因子的抗體在鈣離子的水平可能波動的體內(nèi)條件下可能是無效的。通過觀察其與P-選擇蛋白特異結(jié)合的能力不被具有CQNRYTDLVAIQNKNE氨基酸序列的P-選擇蛋白片段所抑制，進一步揭示了與muMAbPB1.3競爭的抗體的特征。在分子數(shù)上過量的該片段對這些抗體的特異結(jié)合的抑制通常小于5％。因此muMAbPB1.3及競爭性抗體可與已報道的被命名為G1，G2和G3的鼠抗體(Geng等，TheJournalofBiologicalChemistry26622313-22318(1991)相區(qū)別，這些鼠抗體與P-選擇蛋白的結(jié)合可被上述多肽部分或全部抑制。本發(fā)明的一些抗體的進一步的特征在于其可選擇性地抑制一些P-選擇蛋白介導(dǎo)的反應(yīng)而不損傷其它反應(yīng)的能力。例如，一些抗體在體內(nèi)能阻斷嗜中性白細(xì)胞對激活了的內(nèi)皮細(xì)胞的特異性結(jié)合而不抑制血小板凝聚。這樣的抗體在治療炎癥同時又不損傷病人對需要血小板凝集的狀態(tài)(如受傷)進行反應(yīng)的能力上尤其有用。本發(fā)明的抗體對P-選擇蛋白通常有至少107，108，109或1010M-1的特異性結(jié)合親和力。通常，抗體對P-選擇蛋白的結(jié)合親和力的上限位于muMAbPB1.3上限的大約3倍、5倍或10倍的一個因數(shù)內(nèi)。親和力的下限也位于muMAbPB1.3的下限的大約3倍、5倍或10倍的一個因數(shù)內(nèi)。在本文中，術(shù)語“大約”包含常在結(jié)合親和力測量中發(fā)生的小的實驗錯誤。II、免疫球蛋白的生產(chǎn)A、非人抗體非人的單克隆抗體(如鼠的、兔的、馬的)的生產(chǎn)已經(jīng)熟知且可通過如用含攜帶P-選擇蛋白的細(xì)胞(如凝血酶激活的血小板)、分離的P-選擇蛋白或其片段(如胞外區(qū)域)的制劑免疫動物來實現(xiàn)。由被免疫的動物獲得的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞被永久化并進行篩選，或先為可結(jié)合P-選擇蛋白的抗體的生產(chǎn)進行篩選再永久化。見上述的Harlow和Lane。另一種方法是，大體上單一特異性的抗體可通過多克隆血清的層析純化來生產(chǎn)。B、抗P-選擇蛋白的人抗體另一方面，本發(fā)明也提供了抗P-選擇蛋白的人抗體。一些人抗體通過競爭結(jié)合實驗篩得，要不然就是有與一鼠特異抗體如muMAbPB1.3相同的抗原決定簇特異性。這樣的抗體極可能具有muMAbPB1.3所顯示的有用的治療特點。按照Huse等，Science2461275-1281(1989)所述的一般方法，通過篩選人B細(xì)胞的DNA文庫可以生產(chǎn)P-選擇蛋白的人抗體。篩選能結(jié)合P-選擇蛋白的抗體或其片段，然后克隆并擴增編碼這些抗體(或結(jié)合片段)的序列。將Huse所述的方法與噬菌體展示技術(shù)結(jié)合使用會更加有效。見如Dower等，WO91/17271及McCafferty等，WO92/01047(每個都以全文作為本申請的參考資料)。在這些方法中，構(gòu)建由外表面展示不同抗體的成員構(gòu)成的噬菌體文庫?？贵w通常作為Fv或Fab片段展示出來。由對P-選擇蛋白多肽或其片段的親和力的強度可篩選攜帶有所需特異性的抗體的噬菌體。在一噬菌體展示方法的變異方法中，可生產(chǎn)具有被選定的鼠抗體的結(jié)合特異性的人抗體。見Winter，WO92/20791。在此方法中，被選定的鼠抗體(如muMAbPB1.3)的重鏈或輕鏈可變區(qū)被用作出發(fā)材料。如果，例如，輕鏈可變區(qū)被選為出發(fā)材料，則可構(gòu)建成員表現(xiàn)相同的輕鏈可變區(qū)(即鼠出發(fā)材料)和不同的重鏈可變區(qū)的噬菌體文庫?？梢詮闹嘏诺娜酥劓溈勺儏^(qū)文庫獲得重鏈可變區(qū)。從中選出對P-選擇蛋白具有強的特異結(jié)合力(如至少108，優(yōu)選至少109M-1)的噬菌體。然后將此噬菌體上的人重鏈可變區(qū)作為出發(fā)材料以構(gòu)建另外一個噬菌體文庫。此文庫中，每個噬菌體有相同的重鏈可變區(qū)(即，由第一個展示庫所確認(rèn)的可變區(qū))和不同的輕鏈可變區(qū)。這些輕鏈可變區(qū)來自重排后的人輕鏈可變區(qū)文庫。再次篩選對P-選擇蛋白具有強的特異結(jié)合力的噬菌體。這些噬菌體將完全具有抗P-選擇蛋白的人抗體的可變區(qū)。這些抗體通常具有與鼠出發(fā)材料(如muMAbPB1.3)相同或相似的抗原特異性。C、人源化抗體本發(fā)明提供了具有主要來自人免疫球蛋白(稱為受體免疫球蛋白)的可變構(gòu)架區(qū)和主要來自名為muMAbPB1.3(稱為供體免疫球蛋白)的鼠免疫球蛋白的互補決定區(qū)的人源化免疫球蛋白。恒定區(qū)，若存在的話，也主要來自人免疫球蛋白。本發(fā)明的人源化抗體在如下幾個方面優(yōu)于鼠供體抗體，此鼠供體抗體已在動物模型中證明有效。1)人免疫系統(tǒng)應(yīng)不會將人源化抗體的構(gòu)架區(qū)或恒定區(qū)作為外源物質(zhì)加以識別，因此對注入抗體的抗體反應(yīng)應(yīng)低于對全部外源性鼠抗體或一部分外源性嵌合抗體的反應(yīng)。2)由于人源化抗體的效應(yīng)子部分是人的，故它可以更好地與人免疫系統(tǒng)的其它部分相互作用。3)據(jù)報道，注入的鼠抗體在人體循環(huán)中的半衰期大大低于正常的人抗體的半衰期(Shaw等，J.Immunol，1384534-4538(1987))。注入的人源化抗體的半衰期則基本等于自然產(chǎn)生的人抗體的半衰期，從而可以較低的頻率和較小的劑量用藥。(1)muMAbPB1.3可變區(qū)域的克隆和測序編碼muMAbPB1.3抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA的克隆和測序述于實施例10，核苷酸和預(yù)期的氨基酸序列示于圖11和圖12，表1和表2表明了構(gòu)架區(qū)和互補決定區(qū)氨基酸編碼序列的再分。從N-末端到C-末端，輕鏈和重鏈都包含F(xiàn)R1，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3和FR4區(qū)域。按照上述Kabat等的傳統(tǒng)記錄方法將氨基酸分配到每一區(qū)域。(2)提供構(gòu)架殘基的人抗體的選擇如果人可變區(qū)構(gòu)架采用與產(chǎn)生CDR的鼠可變區(qū)構(gòu)架相同或相似的構(gòu)型，則將鼠的CDR取代入人的可變區(qū)構(gòu)架中極可能導(dǎo)致其正確空間定向的保留。這可以通過從構(gòu)架序列與產(chǎn)生CDR的鼠可變構(gòu)架區(qū)域序列高度相同的人抗體獲得人可變區(qū)域來實現(xiàn)。重鏈和輕鏈可變構(gòu)架區(qū)可從相同或不同的人抗體序列衍生出來。人抗體序列可以是自然發(fā)生的人抗體的序列，也可以是幾個人抗體的一致序列。見Kettleborough等，ProteinEngineering4773(1991)；Kolbinger等，ProteinEngineering6971(1993)。通過用計算機比較鼠可變區(qū)的氨基酸序列與已知的人抗體的序列可以確認(rèn)出適當(dāng)?shù)娜丝贵w序列。輕鏈和重鏈要分開比較但原理彼此相似。這種比較表明muMAbPB1.3輕鏈與人的kappa-1亞型的輕鏈有最大的序列相同，muMAbPB1.3重鏈與人的1亞型重鏈有最大的序列相同，見上述Kabat等所確定。因此，輕和重鏈的人構(gòu)架區(qū)通常來自這些亞型的人抗體或這些亞型的一致序列。與muMAbPB1.3的相應(yīng)區(qū)域有最大序列相同性的優(yōu)選的重鏈和輕鏈可變區(qū)分別來自抗體21/28’CL和DEN。(3)計算機模擬鼠CDR區(qū)與人可變構(gòu)架區(qū)的非自然并置會導(dǎo)致一些非天然構(gòu)型的限制，除非通過取代某些氨基酸殘基進行校正，否則這些構(gòu)型限制會導(dǎo)致結(jié)合親和力的喪失。要取代的氨基酸殘基的選擇部分上是通過計算機模擬確定的。產(chǎn)生免疫球蛋白的三維圖象的計算機硬件和軟件隨處可得。分子模型的產(chǎn)生一般是從免疫球蛋白鏈或其區(qū)域的已解決的結(jié)構(gòu)開始的。比較被模擬鏈與三維結(jié)構(gòu)已知的鏈或區(qū)域的氨基酸序列相似性。顯示最大序列相似性的鏈或區(qū)域被選為構(gòu)建分子模型的出發(fā)點。例如，對muMAbPB1.3的輕鏈，模擬的出發(fā)點是人輕鏈DEN。修改已知的出發(fā)結(jié)構(gòu)以容納被模擬的免疫球蛋白鏈或區(qū)域的真實氨基酸與出發(fā)結(jié)構(gòu)中的氨基酸的差異。然后將修改了的結(jié)構(gòu)拼湊成一綜合的免疫球蛋白，最后，通過能量最小化以及通過證實所有原子位于適當(dāng)?shù)木嚯x之內(nèi)、鍵長和鍵角位于化學(xué)上可接受的范圍內(nèi)來進一步完善此模型。這樣的一個模型反過來又可以用為預(yù)言一含有取代于人的構(gòu)架結(jié)構(gòu)中的muMAbPB1.3的互補決定區(qū)的抗體的三維結(jié)構(gòu)的出發(fā)點。當(dāng)下面將要討論的進一步的氨基酸取代被引入時，其它模型也可以被構(gòu)建出來以代表結(jié)構(gòu)。(4)氨基酸殘基的取代如上所述，本發(fā)明的人源化抗體包括主要來源于人免疫球蛋白的可變構(gòu)架區(qū)和主要來源于稱為muMAbPB1.3的鼠免疫球蛋白的互補決定區(qū)。在確認(rèn)了muMAbPB1.3的互補決定區(qū)和適當(dāng)?shù)娜耸荏w免疫球蛋白之后，下一步是要確定這些成分中哪些殘基(如果有的話)應(yīng)被取代以使產(chǎn)生的人源化抗體的性質(zhì)最佳。一般應(yīng)使鼠對人氨基酸殘基的取代最小化，因為鼠殘基的引入加大了抗體在人體中引起HAMA反應(yīng)的危險。用于取代的氨基酸的選擇基于其對CDR構(gòu)型和/或與抗原結(jié)合可能產(chǎn)生的影響。這種可能的影響用以下方式進行檢查，模擬，檢查特殊位置的氨基酸的性質(zhì)、或經(jīng)驗地觀察特定氨基酸取代或突變的效果。當(dāng)氨基酸在muMAbPB1.3可變構(gòu)架區(qū)和等價的人可變構(gòu)架區(qū)之間不同時，通常應(yīng)由等價的鼠氨基酸取代人構(gòu)架氨基酸，如果合理地希望這種氨基酸(1)直接非共價地結(jié)合抗原(如，位于muMAbPB1.3的H1，H2和L60的氨基酸)。(2)與CDR區(qū)相鄰，作為上述Chothia等人提出的另一種定義的CDR區(qū)的一部分，或否則與CDR區(qū)相互作用(如，位于CDR區(qū)大約3A的范圍內(nèi))(如，muMAbPB1.3的H73，表1和3)或(3)位于VL-VH界面。用于取代的其它候選物是在某位置對人免疫球蛋白不尋常的受體人構(gòu)架氨基酸。這些氨基酸可被來自更典型的人免疫球蛋白的等價位置的氨基酸所取代?；蛘?，當(dāng)muMAbPB1.3等價位置的氨基酸是人免疫球蛋白在等價位置上的典型氨基酸時，可將這些氨基酸引入人構(gòu)架區(qū)。一般說來，滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸的全部或大部分取代是需要的。然而，偶然情況下，某特定氨基酸是否符合上述標(biāo)準(zhǔn)比較難以確定。而且會產(chǎn)生可替換的不同的免疫球蛋白，其一具有那種特殊的取代，另一則不具備。令人吃驚的是，一種被稱為重構(gòu)的MAbPB1.3(HBLD)的典型的人源化抗體僅含有一個人重鏈可變區(qū)構(gòu)架殘基的取代和僅兩個人輕鏈可變區(qū)構(gòu)架殘基的取代，然而它對具有被融入了人恒定區(qū)的完整的鼠可變區(qū)的鼠抗體或嵌合抗體(稱為chiMAbPB1.3)有相似的結(jié)合親和力。本發(fā)明的一些人源化抗體在位置L21、L46，L60和L70中的至少1個，2個或3個，有時4個的位置上含有用相應(yīng)的muMAbPB1.3殘基對人輕鏈構(gòu)架殘基的一個取代(見表2和4)。一些人源化抗體通常在位置H1，H2，H71和H73的至少1個，2個或3個，有時4個的位置上含有人重鏈構(gòu)架殘基的一個取代(見表1和3)，許多人源化抗體同時含有輕鏈和重鏈可變構(gòu)架區(qū)的取代。優(yōu)選的抗體包含至少在位置H71上的人重鏈構(gòu)架殘基的取代和至少在位置21和46上的人輕鏈構(gòu)架殘基的取代。人源化抗體的CDR區(qū)通常大體上相同，與muMAbPB1.3抗體的相應(yīng)CDR區(qū)更常常相同。盡管一般并不期望，但有時可能會在不影響產(chǎn)生的人免疫球蛋白的結(jié)合親和力的情況下取代CDR殘基的一個或多個保守氨基酸。偶而，CDR區(qū)的取代會提高結(jié)合親和力。除上述的特殊氨基酸取代外，人源化免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)通常大體上是相同的，更經(jīng)常與產(chǎn)生它們的人源化抗體的構(gòu)架區(qū)相同。當(dāng)然，構(gòu)架區(qū)的許多氨基酸對抗體的特異性和親和力很少或沒有直接貢獻。因此，許多構(gòu)架殘基的單個的保守取代可以被容忍而不會明顯改變形成的人免疫球蛋白的特異性和親和性。然而，一般來說，這些取代是不受歡迎的。(5)可變區(qū)的產(chǎn)生在主觀上選擇了人源化免疫球蛋白的CDR和構(gòu)架成分之后，可利用多種方法生產(chǎn)這種免疫球蛋白。因為密碼的簡并性，許多核酸序列將為每一免疫球蛋白氨基酸序列編碼。期望的核酸序列可通過從頭固相DNA合成或通過期望的多核苷酸的一個早已準(zhǔn)備好的變種的PCR突變而產(chǎn)生。寡核苷酸介導(dǎo)的突變是制備靶多肽DNA的取代、缺失和插入變種的一種優(yōu)選的方法。見Adelman等，DNA2183(1983)，簡言之，靶多肽DNA可以通過將編碼目標(biāo)突變的寡核苷酸與一單鏈DNA模板雜交而被改變。雜交之后，用DNA多聚酶來合成一個完整的模板的第二互補鏈，第二模板鏈含有寡核苷酸引物，并且編碼靶多肽DNA上的被選擇的改變。(6)恒定區(qū)的選擇上述產(chǎn)生的人源化抗體的可變部分一般與免疫球蛋白恒定區(qū)(FC)、一般是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分相連。人恒定區(qū)DNA序列可以按照熟知的程序從多種人體細(xì)胞，但優(yōu)選的是永久傳代的B細(xì)胞(見上述Kabat等，和WO87/02671)(每個都可以其全文作為本申請的參考資料)中分離出來。一般，抗體同時包含輕鏈和重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)通常包括CH1區(qū)，關(guān)節(jié)區(qū)，CH2區(qū)，CH3區(qū)和CH4區(qū)。人源化抗體包括具有所有類型恒定區(qū)的抗體，包括IgM，IgG，IgD，IgA和IgE，和任一同型，包括IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。當(dāng)期望人源化抗體顯示細(xì)胞毒活性時，恒定區(qū)域通常為互補結(jié)合性的恒定區(qū)域，其類型一般為IgG1，當(dāng)不需要此細(xì)胞毒活性時，恒定區(qū)可為IgG4類。人源化抗體可包含來自不止一個類型或同型的序列。(7)表達系統(tǒng)編碼人輕、重鏈可變區(qū)(任選地與恒定區(qū)相連)的核酸被插入到表達載體中。輕、重鏈可被克隆到相同或不同的表達載體上。編碼免疫球蛋白各鏈的DNA片段被連接到確保免疫球蛋白多肽表達的表達載體的控制序列之后。此控制序列包括信號序列，啟動子，增強子和轉(zhuǎn)錄終止序列。表達載體在宿主體內(nèi)或作為獨立復(fù)制子或整合到宿主染色體DNA上，一般是可復(fù)制的。通常，表達載體將包含選擇標(biāo)記，如四環(huán)素或新霉素，以便檢測用所需DNA序列轉(zhuǎn)化了的那些細(xì)胞(如見美國專利4,704,362)。大腸桿菌是對克隆本發(fā)明的多核苷酸尤其有用的一種原核宿主。其它適合使用的微生物宿主包括芽胞桿菌如枯草芽胞桿菌以及其它腸細(xì)菌如沙門氏菌、沙雷氏桿菌和各種假單胞菌屬。在這些原核宿主中也可構(gòu)建表達載體，這些表達載體一般包含可與宿主細(xì)胞共存的表達控制序列(如復(fù)制起點)。而且，可存在任何數(shù)量的各種熟知的啟動子，如乳糖啟動子系統(tǒng)，色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)，β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)，或來自λ噬菌體的啟動子系統(tǒng)。這些啟動子將典型地控制表達，它們?nèi)芜x地帶有一操縱子序列，并且具有核糖體結(jié)合位點序列及其類似物，用于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始和完成。其它微生物，如酵母，也可用于表達。酵母屬是一種優(yōu)選的宿主，帶有含表達控制序列如啟動子，包括三磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，及復(fù)制起始位點，終止序列和其他的上述類似物。除微生物以外，哺乳動物組織細(xì)胞培養(yǎng)物也可用于表達和生產(chǎn)本發(fā)明的多鈦(見Winnacker，F(xiàn)romGenestoClones(VCH出版公司，N.Y.，N.Y.1987))。真核細(xì)胞實際上是優(yōu)選的，因為目前已發(fā)展了許多能夠分泌完整免疫球蛋白的合適的寄主細(xì)胞系。用于表達編碼本發(fā)明免疫球蛋白的核酸的優(yōu)選寄主細(xì)胞包括SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞系(COS-7ATCCCRL1651)；人胚腎細(xì)胞系(293)(Graham等，J.Gen.Virol.3659(1977))；幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCC，CC胞10)；中國倉鼠卵巢細(xì)胞DHFR(CHOUrlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)774216(1980)；鼠謝爾托立氏細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CV1ATCCCCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VER0-76，ATCCCRL1587)；人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2)；犬腎細(xì)胞(MDCK，ATCCCCL34)；布法羅兔肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75)；人肺細(xì)胞(HepG2，HB8065)；鼠乳腺癌細(xì)胞(MMT060562，ATCCCCL51)；和TRT細(xì)胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.38344-46(1982))；桿狀病毒細(xì)胞。含有感興趣的多核苷酸序列(如，重、輕鏈編碼序列和表達控制序列)的載體可用熟知的方法轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，這些方法由于細(xì)胞宿主類型的不同而不同。例如，CaCl2轉(zhuǎn)染通常被用于原核細(xì)胞，而磷酸鈣處理或電穿孔常被用于其它細(xì)胞宿主(主要見Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual(ColdSpringHarber出版社，第二版，1989)。(這些文獻以其全文作為本申請的參考資料)。當(dāng)重、輕鏈被克隆在不同的表達載體上時，這些載體便被共轉(zhuǎn)染以使完整的免疫球蛋白得以表達和組裝。重組DNA導(dǎo)入后，表達免疫球蛋白產(chǎn)物的細(xì)胞株是可選擇的。能穩(wěn)定表達的細(xì)胞株比較優(yōu)選(即，細(xì)胞株傳代50次以后表達水平仍不降低)。一旦被表達，整個抗體，其二聚體，單個輕、重鏈或本發(fā)明的其它免疫球蛋白形式可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的標(biāo)準(zhǔn)程序進行純化，這些程序包括硫酸胺沉淀，親和柱層析，柱層析，凝膠電泳等(主要見，Scopes，ProteinPurification(Springer-Verlag，N.Y.，1982))。作為治療用時，純度至少在90-95％的大體上純的免疫球蛋白較優(yōu)選，純度為98-99％或更高的最優(yōu)選。上述重組技術(shù)也可用于編碼人或鼠抗體的天然序列的表達。這一方法對從不穩(wěn)定細(xì)胞株分離出的人抗體的表達尤其有益。III、抗體片段本發(fā)明另一方面提供了上述完整抗體的片段。具有代表性的是，這些片段可與產(chǎn)生它們的完整抗體相競爭特異地結(jié)合P-選擇蛋白，并且以至少107、108、109M-1或1010M-1的親和力相結(jié)合?？贵w片段包括不同的重鏈和輕鏈Fab，F(xiàn)ab’F(ab’)2，F(xiàn)abc和Fv。這些片段可通過完整免疫球蛋白的酶法或化學(xué)法降解而產(chǎn)生。例如，F(xiàn)(ab’)2片段可運用一些如在Harlow和Lane，AntibodiesALaboratorvManual，ColdSpringHarbor出版公司，N.Y.(1988)中所述的標(biāo)準(zhǔn)方法，在pH為3.0-3.5時用胃蛋白酶進行蛋白質(zhì)分解消化從IgG分子中獲得。Fab片段可通過有限還原從F(ab’)2片段獲得，或在還原劑存在下用木瓜蛋白酶消化完整的抗體而獲得。(見同上)，這些片段也可通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。編碼選定片段的核酸片段可通過用限制性內(nèi)切酶消化全長編碼序列而產(chǎn)生，或通過從頭合成而產(chǎn)生。這些片段經(jīng)常以噬菌體外殼融合蛋白的形式被表達。這種表達方式對述于IV部分的抗體親和力的加強非常有益。IV、親和力強化抗體上述的許多免疫球蛋白能在結(jié)合特異性或效應(yīng)子功能不喪失或結(jié)合親和力的減退可容忍(即，大約在107M-1以下)的情況下，在可變區(qū)和恒定區(qū)進行非關(guān)鍵性氨基酸的取代、添加或缺失。通常，摻入了這些改變的免疫球蛋白與產(chǎn)生它們的對照免疫球蛋白的序列大體相同。偶而，可選擇到一個突變了的免疫球蛋白，與產(chǎn)生它的對照免疫球蛋白相比具有相同的特異性和提高了的親和力。噬菌體展示技術(shù)為選擇這些免疫球蛋白提供了有力的技術(shù)。(見例如，Dower等，WO91/17271；McCafferty等，WO92/01047；和Huse，WO92/06204)。V、雜交抗體本發(fā)明還提供了既與P-選擇蛋白的阻斷性抗體有相同特異性又與次級部分能特異結(jié)合的雜交抗體。在雜交抗體中，一對重鏈和輕鏈通常來自于一個P-選擇蛋白抗體，另外一對則來自于抗另一抗原決定簇的抗體。這就產(chǎn)生了多功能價的特性，即至少同時與兩個不同抗原決定簇相結(jié)合的能力，其中至少一個抗原決定簇是阻斷性P-選擇蛋白抗體結(jié)合的那個抗原決定簇。這些雜交抗體可通過產(chǎn)生相應(yīng)組分抗體的雜交瘤的融合或通過重組技術(shù)而形成。免疫球蛋白也可與來自其它基因(如，酶)的功能區(qū)相融合，以產(chǎn)生具有新性質(zhì)的融合蛋白(如，免疫毒素)。VI、核酸上述完整的抗體和抗體片段經(jīng)常通過核酸的表達而產(chǎn)生。編碼任何抗體或本申請所述抗體的所有核酸均清晰地包括在本發(fā)明中。核酸修飾可通過多種熟知的技術(shù)很容易地實現(xiàn)，如定點突變(見Gillman和Smith，Gene，881-97(1979)和Roberts等，Nature，328731-734(1987))。本發(fā)明的許多核酸與編碼muMAbPB1.3的重鏈和輕鏈或其典型的人源化衍生物的核酸大體上序列相同。VII、計算機另一方面，本發(fā)明提供了編程可以在監(jiān)視器或打印機上顯示出抗體三維圖象的計算機。例如，在UNIX操作系統(tǒng)下運行和使用QUANTA分子模擬塊的SiliconGraphicsIRIS4D工作站是很合適的。計算機對人源化抗體的變種形成可見模型很有用?？偟恼f來，本發(fā)明的抗體已提供了滿意的結(jié)合親和力。然而，通過某些氨基酸殘基的進一步變化以確認(rèn)具有更強結(jié)合親和力的抗體也是可能的。三維圖像也能確認(rèn)許多非關(guān)鍵氨基酸，這些氨基酸可以作為不影響抗體結(jié)合親和力的保守取代的對象。VIII、抗體的大批量生產(chǎn)為了得到大批量的抗體，產(chǎn)生在其染色體上含有編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的基因的多個拷貝的穩(wěn)定細(xì)胞。多拷貝通過擴增細(xì)胞染色體DNA的分離區(qū)而獲得。通過使用使在一定生長條件下很重要的細(xì)胞酶(如，DHTR)失活的選擇試劑，如氨甲碟呤(MTX)，可實現(xiàn)這種擴增。擴增，即DHFR基因多個拷貝的積累導(dǎo)致與更大量的MTX相應(yīng)的更大量的DHFR的產(chǎn)生。盡管存在內(nèi)源性的DHFR，通過在培養(yǎng)液中加入更大量的MTX擴增壓力也可發(fā)揮作用。目的基因(指編碼免疫核蛋白重鏈和輕鏈的基因)的擴增通過在相同或不同的質(zhì)粒上將每一基因連到DHFR基因的一個拷貝上并轉(zhuǎn)染此質(zhì)粒而實現(xiàn)。與MTX呼應(yīng)的DHFR基因的擴增導(dǎo)致了目的免疫球蛋白基因拷貝數(shù)量的伴隨上升。目的基因拷貝數(shù)量的增加又導(dǎo)致了期望的異源蛋白質(zhì)的更大量表達。每106個細(xì)胞每天大約表達10-100、20-50或30μg人源化免疫球蛋白的穩(wěn)定細(xì)胞株較為優(yōu)選。XI、P-選擇蛋白片段另一方面，本發(fā)明還提供了P-選擇蛋白的片段。這些片段包括來自P-選擇蛋白的第5個C3b-C4b調(diào)節(jié)區(qū)(第5CRP)。該片段包含被muMAbPB1.3結(jié)合的抗原決定簇和/或被競爭抗體結(jié)合的相鄰抗原決定簇。此片段通常包含總數(shù)至多為5，10，20，25，50，75，100或200個氨基酸。大多數(shù)片段包含了圖34所示的人P-選擇蛋白序列上448位到467位之間的部分或全部氨基酸。這些氨基酸決定了被muMAbPB1.3特異結(jié)合的抗原決定簇。在許多片段上，至少有5個連續(xù)氨基酸來自圖34所示氨基酸序列的448到467位之間。其它片段包含了448到467之間完整連續(xù)的氨基酸片段。某些片段基本上由氨基酸的這些連續(xù)片段組成。在這些片段上，不存在對片段結(jié)合特異性或親和性有貢獻的其它氨基酸。通常，任何種類的其他氨基酸都是不存在的。本發(fā)明的多肽片段有多種用途。這些片段可作為免疫原以產(chǎn)生與muMAbPB1.3相競爭而特異結(jié)合P-選擇蛋白的抗體。將該片段作為為免疫原使用縮小了分離具有所需特異性的抗體的篩選范圍。該多肽片段也可用于如下文所述的診斷方法和治療方法。一些片段可與全長P-選擇蛋白分子競爭結(jié)合激活的嗜中性白細(xì)胞。因此，這些片段可用于治療由P-選擇蛋白與其位于激活的嗜中性白細(xì)胞上的配體相互作用而介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)的疾病和癥狀。通過與位于這些細(xì)胞表面的P-選擇蛋白的配體相結(jié)合，一些片段也可用于檢測激活的嗜中性白細(xì)胞的存在。一些小的片段尤其適合于體內(nèi)用藥后藥物的有效分布。純粹來源于人的片段可降低用其它試劑可能導(dǎo)致的副作用的危險。X、治療和診斷方法治療方法運用上述的抗體(整個和結(jié)合片段)和P-選擇蛋白片段作為治療制劑來治療多種疾病。這些治療劑在預(yù)防和治療免疫系統(tǒng)多種疾病和紊亂方面有用。這些疾病和紊亂包括移植排斥，移植物抗宿主疾病，自身免疫疾病如依賴于胰島素的糖尿病，多發(fā)性腦脊髓硬化癥，人強直性綜合癥，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，重癥肌無力，紅斑狼瘡和發(fā)炎性疾病。這些制劑也可用于阻止腫瘤轉(zhuǎn)移，抑制循環(huán)性癌細(xì)胞的粘連，如結(jié)腸癌和黑素瘤。一些治療制劑通過阻斷或拮抗P-選擇蛋白分子與其配體的作用而行使功能。其他治療制劑通過殺死帶有本制劑所對抗的多肽的細(xì)胞而發(fā)揮功能。這些治療制劑尤其適合于發(fā)炎性和血栓性癥狀的治療，這些癥狀包括局部缺血后白細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷(再充血)，它起因于創(chuàng)傷休克，窒息，心肌梗塞，急性移植排斥，凍傷損傷，區(qū)域綜合癥，及與下列疾病有關(guān)的病理生理狀況，它們是心肺旁路，急性白細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷(如，成人呼吸困難綜合癥)，膿毒性休克與由病毒(如，皰疹病毒復(fù)合體)引起的膿毒癥有關(guān)的損傷，IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)(如急性哮喘病)和慢性炎癥(包括類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，皮炎和牛皮癬)。局部缺血/再充血損傷是一種發(fā)炎性疾病，它在患有供給阻斷導(dǎo)致的局部缺血(氧缺乏)的器官血流恢復(fù)時發(fā)生。除非通過再充血得以迅速緩解，局部缺血會導(dǎo)致周圍細(xì)胞的死亡并且最終造成整個器官或患者的死亡。然而，積累的證據(jù)表明再充血本身會對周圍組織造成惡性影響。據(jù)信導(dǎo)致再充血惡性影響的原因部分在于由恢復(fù)了的血流中的激活的嗜中性白細(xì)胞介導(dǎo)的發(fā)炎反應(yīng)。一些病人呈現(xiàn)全身局部缺血，另外一些病人局部缺血只限于身體某些特殊的部分或器官。例如，一個病人可患有表皮缺血，心肌缺血，腎缺血，大腦缺血，脾缺血，肝缺血，脊髓缺血，內(nèi)臟缺血，肺缺血，部分身體缺血或全身局部缺血。本發(fā)明的這些治療制劑通過拮抗這些淋巴細(xì)胞與P-選擇蛋白的相互作用而發(fā)揮作用。急性過敏癥(包括哮喘病)的一個主要成分是用抗原處理對此抗原特異致敏的對象后發(fā)生的肥大細(xì)胞脫粒化。肥大細(xì)胞脫粒化的結(jié)果包括支氣管收縮反應(yīng)，也包括以白細(xì)胞累積為部分特征的發(fā)炎反應(yīng)。與其它發(fā)炎介體一起包含于肥大細(xì)胞中的組織胺可誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞上P-選擇蛋白的表達，這表明肥大細(xì)胞的脫?？蓪?dǎo)致P-選擇蛋白表達和其后的白細(xì)胞積聚。由于肥大細(xì)胞脫粒在過敏癥的病理遺傳中是一個關(guān)鍵因素，運用P-選擇蛋白的抗體對人類過敏癥的治療將是有用的。這些方法對人類尤其有用，但也可用于獸類疾病。這些治療方法通常用于有生命的對象的器官。然而，一些方法，如局部缺血-再充血療法，同樣適用于被解剖了的器官，尤其是在這些器官正待移植入一個受體病人體內(nèi)時。治療方法也可在體外完成。針對P-選擇蛋白的治療制劑和組合物也與針對其它分子，尤其是可與不同粘連分子反應(yīng)的人源化或人抗體的制劑結(jié)合使用。合適的免疫球蛋白包括那些對CD11a、CD11b、CD18、E-選擇蛋白、L-選擇蛋白和ICAM-1有特異性的免疫球蛋白。這些免疫球蛋白應(yīng)與上述粘結(jié)分子的抗原決定簇結(jié)合，從而抑制白細(xì)胞尤其是嗜中性白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。在組合療法中使用的其它合適的抗體和那些對淋巴激活素(如IL-1，IL-2和IFN-γ及它們的感受器)有特異性的抗體。這些抗體用來阻斷內(nèi)皮細(xì)胞的活化，從而阻止它們在發(fā)炎反應(yīng)中與嗜中性白細(xì)胞的相互作用。本發(fā)明的阻斷性P-選擇蛋白抗體和藥物組合物對胃腸外用藥(即皮下用藥，肌內(nèi)用藥和靜脈用藥)尤其有用。目前正在發(fā)展許多新的給藥途徑。本發(fā)明的藥物組合物也適合于用這些新方法用藥。(見Langer，Science，2491527-1533(1990))。阻斷性P-選擇蛋白抗體可直接或間接地與化學(xué)藥劑結(jié)合使用?？捎矛F(xiàn)有技術(shù)中公知的各種方法實現(xiàn)的這種配合使用不應(yīng)明顯抑制免疫球蛋白結(jié)合受體的能力，也不應(yīng)明顯降低化學(xué)藥劑的活性?？蓢L試將許多化學(xué)療法與之配合使用以定向。例如，可被配合使用的抗發(fā)炎試劑包括免疫調(diào)節(jié)劑、血小板激活因子(PAF)拮抗劑、環(huán)化加氧酶抑制劑、脂肪氧合酶抑制劑和白三烯拮抗劑。一些較好的成分包括環(huán)孢菌素A，消炎痛、甲氧基甲基荼乙酸、FK-506、霉酚酸等。與之相似，抗氧化劑，如超氧化歧化酶，對治療再充血損傷是有用的。同樣，抗癌制劑，如道諾霉素、阿毒素、長春花堿、博菜霉素等也可被定向。P-選擇蛋白的定向也可經(jīng)由親水脂分子、或以聚集的形式存在于水溶液中的兩性分子(極性非極性)來實現(xiàn)。親水脂分子包括非極性脂類、極性脂類、甘油一酯和甘油二酯、硫酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、膽酸和膽鹽。這些分子的乳劑和泡沫、微團、不溶性單層、液晶、磷脂離散物和片層的形式存在。這些物質(zhì)在此統(tǒng)稱為脂質(zhì)體。在這些制劑中，欲在體內(nèi)輸送的藥物作為包埋了抗P-選擇蛋白免疫球蛋白的脂質(zhì)體的一部分被摻入。在這種方法中，只要免疫球蛋白能有效地將脂質(zhì)體定向于P-選擇蛋白分子，免疫球蛋白就不需要與P-選擇蛋白上有功能的抗原決定簇相結(jié)合。當(dāng)脂質(zhì)體被運送到被影響細(xì)胞的附近時，脂質(zhì)體便將治療藥物釋放出來。有許多方法可以用于制備脂質(zhì)體，如Szoka等，(Ann.Rev.Biophy.Bioeng.9467(1980))，美國專利4,235,871,4,501,728和4,837,028所述(它們以其全文作為本申請的參考資料)。用各種定向試劑(例如，配體、受體和單克隆抗體)進行的脂質(zhì)體定向方法已被熟知(見，如美國專利4,957,773和4,603,044，二者以其全文作為本申請的參考資料)。可利用標(biāo)準(zhǔn)方法將定向試劑與脂質(zhì)體結(jié)合?？贵w定向的脂質(zhì)體可用如結(jié)合了蛋白質(zhì)A的脂質(zhì)體構(gòu)建(見，Renneisen等，J.Biol.Chem.26516337-16342(1990)及Leonetti等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)872448-2451(1990))。腸胃外用藥使用的藥物組合物通常包括治療試劑(例如，抗P-選擇蛋白(完整的或結(jié)合片段或P-選擇蛋白片段)抗體)的溶液或溶于一可接受載體(優(yōu)選水載體)的幾個這種試劑的混合物。可使用多種水載體，如水、緩沖液、0.4％鹽水、0.3％甘氨酸等。這些溶液是無菌的，且通常不含特殊物質(zhì)。這些制劑可用熟知的常規(guī)消毒技術(shù)消毒。當(dāng)需要輔助物模擬生理條件，如調(diào)整pH值并起緩沖作用的試劑、體力調(diào)節(jié)劑等，如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉等時，這些組合物可以含有這些藥學(xué)上可接受的輔助物。在這些配制制劑中，抗體的濃度可以變化很大，即從低于0.5％，通常為或不低于0.1％到高達1.5％或2.0％(重量)，用藥濃度可依據(jù)用藥的特殊方式并基于液體體積、粘度等進行選擇。制備腸胃外用藥組合物的實際方發(fā)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的或顯而易見的，這些方法被詳細(xì)描述于如Remington的PharmaceuticalSciences，第17版，Mark出版公司，EastonPennsylvania(1985)(在此以其全文作為本申請的參考資料)。本發(fā)明的抗體可以冷凍干燥保存，并在使用前在一合適的載體中恢復(fù)。已經(jīng)表明這種技術(shù)對常規(guī)的免疫球蛋白是有效的，這種方法利用的是熟知的冷凍干燥法和恢復(fù)技術(shù)。冷凍干燥法和恢復(fù)技術(shù)可導(dǎo)致各種不同程度的抗體活性喪失(如，對常規(guī)免疫球蛋白，IgM抗體比IgG抗體有更大的活性喪失)，因此為了補償需調(diào)整用藥量。含有本發(fā)明抗體及其混合物的這些組合物可作為藥物用于預(yù)防和/或治療。在用于治療時，這些組合物以足以治愈或至少可部分阻止感染及并發(fā)癥的劑量施于患者。能夠?qū)崿F(xiàn)上述目的劑量定義為“有效治療劑量”。有效治療劑量依據(jù)患者疾病的嚴(yán)重程度和患者本身免疫系統(tǒng)總體狀況的不同而不同，但一般變化范圍大約為0.05毫克/千克體重-5毫克/千克體重，優(yōu)選的范圍大約為0.2毫克/千克體重-1.5毫克/千克體重。本發(fā)明的材料一般可用于程度較重的疾病，即危及生命的或潛在危及生命的情形。在這些情況下，考慮到外源物質(zhì)的最小化和本發(fā)明的人或人源化抗體所引起的異物排斥(如，HAMA)的較低的可能性，治療醫(yī)生使用大體上過量的這些抗體是可能的且值得的。在用于預(yù)防時，將含有本發(fā)明抗體及其混合物的組合物用于尚未處于患病狀態(tài)的病人以提高其抵抗力。這一劑量定義為“有效預(yù)防劑量”。在這一用途中，正確的劑量也依病人的健康狀況及其總體免疫水平的不同而不同，但通常在上述范圍內(nèi)?？捎弥委熱t(yī)生所選擇劑量的水平和形式使用這些組合物的一種或多種進行治療。任何情況下，藥方應(yīng)提供足以有效醫(yī)治病人的本發(fā)明免疫球蛋白的量。本發(fā)明的抗體(整體和結(jié)合性片段)和P-選擇蛋白片段也可用于診斷。足以達到這一目的的量定義為“有效診斷劑量”。用于診斷時，正確劑量依賴于病人的健康狀況，用藥方式，等等。這些抗體可以標(biāo)記也可不標(biāo)記。未標(biāo)記的抗體可與其它能與抗體反應(yīng)的標(biāo)記抗體(第二抗體)結(jié)合使用，如對特殊免疫球蛋白恒定區(qū)有特異性的抗體。另一方面，這些抗體可直接被標(biāo)記，如用放射性核素、熒光物質(zhì)、酶、酶底物、酶輔助因子、酶抑制劑、配體(特別是輔抗原)標(biāo)記。這些抗體(整體和結(jié)合性片段)對于測定帶有P-選擇蛋白受體的細(xì)胞的存在是有用的。這些細(xì)胞的存在可診斷出炎癥或疾病，并可能標(biāo)志著需要開始使用上述治療方法。通過從病人身上進行細(xì)胞取樣的方法可完成診斷。然而，樣本的個體細(xì)胞中被表達的P-選擇蛋白受體的量可通過如固定化細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色或?qū)⒓?xì)胞抽提物與本發(fā)明抗體進行Western雜交等方法加以確定。P-選擇蛋白片段對測定激活的嗜中性白細(xì)胞的存在有用，這一存在可能暗示著一個不希望的免疫反應(yīng)。診斷也可通過標(biāo)記抗體(優(yōu)選的是人源化的或人抗體)的體內(nèi)使用并經(jīng)體內(nèi)成象的檢測來實現(xiàn)。使用的MAb的濃度應(yīng)足量，從而與背景信號相比，與帶有靶抗原的細(xì)胞的結(jié)合可被檢測到。診斷試劑可用用于相機成像的放射性同位素，或用于磁共振或電子自旋共振成像的順磁性同位素來標(biāo)記。細(xì)胞樣品中或從個體抽出來的P-選擇蛋白的水平的變化(一般為上升)，即超出了臨床確定的常規(guī)水平可表明取得樣品的個體中一個不希望的發(fā)炎應(yīng)答反應(yīng)的存在，和/或表明個體傾向于發(fā)生(或正經(jīng)歷)一個這樣的反應(yīng)。P-選擇蛋白也可用作分化標(biāo)記以確認(rèn)并分類具有特定譜系和發(fā)育起源的細(xì)胞。這種細(xì)胞類型特異測定可用于不期望的免疫反應(yīng)的組織病理診斷。試劑盒也可與本發(fā)明抗體一起被提供使用。因此，本發(fā)明的抗體組合物通常以冷凍形式，單獨或與另外的對需要的細(xì)胞類型特異的抗體一起盛在一個容器中。這些抗體(可結(jié)合一個標(biāo)記或毒素或不結(jié)合)與緩沖劑如Tris，磷酸鹽，碳酸鹽等，穩(wěn)定劑，抗微生物劑、惰性蛋白(如血清蛋白等)等和一套使用指南一起包含在一個試劑盒中。通常，這些材料以活性抗體重量計以大約低于5％(重量)存在，并通?；诳贵w的濃度以大約至少為.001％(重量)的總量存在。通常有必要包括一個惰性補充劑或賦形劑以稀釋活性成分，在此賦形劑可以大約總制劑重量的1-99％的比例存在。在檢測中，當(dāng)利用可結(jié)合P-選擇蛋白抗體的第二抗體時，第二抗體通常盛在一個隔離小瓶中。第二抗體常常與一個標(biāo)記結(jié)合，并如上配制。下面提供一些實施例說明本發(fā)明但不是限制本發(fā)明。實施例1試劑的制備本實施例描述用于實施例2和實施例3中的免疫和實施例4中的ELISA的試劑的制備或分離。A“不新鮮血小板”血小板制備物是從由SanDiego血庫獲得的“不新鮮血小板”純化制得的。使用的方法是如Moore等，J.Cell.Biol.112491-499(1991)(在此以其全文作為本申請的參考資料)所述方法的改進方法。簡而言之，25單位的富含不新鮮血小板的血漿以1200rpm(300xg)，10分鐘離心兩次，以除去非血小板的血細(xì)胞雜質(zhì)。純化了的血小板制備物用含0.1M氯化鈉，20mMTris和5mM苯甲脒的緩沖液洗三次。該緩沖液還含有3.8％的檸檬酸鈉，其pH值用1N鹽酸調(diào)至7.5。純化后的血小板在70℃儲存，注射前在PBS中洗一次。B、純化的P-選擇蛋白血小板的分級分離洗過的不新鮮血小板基本上按Moore等，1991，如上述的方法分級分離。將25單位洗過的血小板溶于100mM的抑酶醛肽和1mM的4-(2-氨乙基)-苯磺?；?AEBSF)中，在干冰/甲醇中凍融三次，并用Dounce勻漿器攪拌十次。懸浮液在BeckmanTi70轉(zhuǎn)頭上以35,000rpm于4℃下離心60分鐘。離心所得的上清液是用于純化可溶性P-選擇蛋白的出發(fā)材料。將沉淀重新懸浮于30ml含1mM氯化錳，1mM氯化鈣，5mM苯甲脒-鹽酸，0.1M氯化鈉，20mMTris，2％TritonX-100，pH7.5的懸浮液中，用Dounce勻漿器攪拌十次，在4℃保溫1小時。將懸浮液在BeckmanTi70轉(zhuǎn)頭上以35,000rpm，4℃離心1小時。離心所得的上清液是分離“膜結(jié)合”P-選擇蛋白的出發(fā)材料。從被分離的血小板中分離P-選擇蛋白“可溶性”和“膜結(jié)合”P-選擇蛋白分離通過下述程序的一部分或全部進一步純化。用于分離膜結(jié)合形式的P-選擇蛋白的所有緩沖劑中均含有濃度為0.1％的非離子去垢劑Rennex30。(AccurateChemicalandScientific公司)。這些緩沖劑還都含有1mM氯化鈣和1mM氯化錳，含有P-選擇蛋白的部分通過用單克隆抗體PNB1.6進行Western雜交進行測定。扁豆凝集素層析法將從25單位血小板中獲得的“可溶性P-選擇蛋白”上清液或“膜結(jié)合P-選擇蛋白”去垢劑抽提物通過一個與瓊脂糖4B(Sigma化學(xué)公司，L-0511)結(jié)合的從扁豆獲得的凝集素(扁豆凝集素)的柱子(1.5×5.5cm)。然后用150ml，含20mMTris，0.1M氯化鈉，pH為7.5的溶液洗滌此柱。再用10×3ml等份的20mMTris，0.5M氯化鈉，0.5Mα-甲基-D-甘露吡喃糖苷，pH7.5的溶液從柱上洗脫被結(jié)合糖蛋白。含P-選擇蛋白的部分在AmiconCentriprep30中溶液到1.5-2ml。凝膠過濾層析法將從扁豆凝集素層析法獲得的濃縮部分注入用pH7.5，20mMTris，0.1M氯化鈉溶液平衡的TosoHaasG300SWHPLC柱(21.5mm×30cm)。用同樣的緩沖液以0.75ml/分的流速洗脫該柱。收集各部分(1.5ml)；并用Western雜交分析。合并含有P-選擇蛋白的各部分，在AmiconCentriprep30中濃縮到1.5-2ml，然后用20mMTris(pH7.5)換液幾次。肝素-瓊脂糖層析法將溶于20mMpH7.5的Tris的樣品置于1ml肝素-瓊脂糖中，用同一緩沖液洗柱，并用含20mMTris，1.5mM氯化鈉，pH7.5的緩沖液洗脫。陰離子交換層析法被洗脫的部分在20mMTris，pH7.5的溶液中進行透析，然后注入已用20mMTris，pH7.5溶液平衡的TosoHaasDEAE-5PW柱(7.5mm×7.5cm)，用1M氯化鈉的鹽梯度洗脫。合并含P-選擇蛋白的各部分，在AmiconCentriprep30中濃縮，存于-80℃。陽離子交換層析法將樣品在pH7的10mM磷酸鹽緩沖液中透析，注入已被同一緩沖液平衡的PorosCM/P(4.6/100)柱，然后用達1M氯化鈉的鹽梯度洗脫。C、新鮮的人血小板的分離和激活血小板分離程序中使用的全部化學(xué)試劑均購自Sigma化學(xué)公司，St.Louis，MO。1、從一志愿獻血者身上用含7ml酸性檸檬酸鹽葡萄糖抗凝血劑(ACD)的注射器抽取42ml血液。ACD抗凝血劑的制備物葡萄糖2.0克檸檬酸鈉2.49克檸檬酸1.25克加蒸餾水至100ml2、撥下針頭，將血液移至兩個無菌的50ml離心管中。3、將離心管在配有一個921轉(zhuǎn)頭(半徑為17.2cm)的離心機中室溫下800rpm(大約為90×g)離心15分鐘，不剎車。4、將上清液用塑料移液管移出，并盡可能取至凝血層。5、將上清液120rpm(大約300×g)離心6分鐘。6、移出上清液。7、將上清液以2000rpm(大約1200×g)離心10分鐘，血小板以細(xì)胞塊形式出現(xiàn)在離心管底部，棄掉上清液。8、按如下方式洗滌血小板加入含有終濃度為100mM的前列腺素E1(PGE1)的2mlpH6.5的Tyrode-Hepes緩沖液，輕輕重懸血小板。再加入同樣緩沖液10ml，將樣品3000rpm離心10分鐘。Tyrode-Hepes緩沖液的制備NaCl8.0克KCl0.2克NaH2PO4H2O0.057克MgCl26H2O0.184克NaHCO30.1克葡萄糖1.0克HEPES2.383克加蒸餾水至1升，用1NNaOH將pH值調(diào)至6.5。9、重復(fù)第8步，然后用不含PGE1的相同緩沖液洗滌一次血小板。10、用Coulter計數(shù)器計數(shù)血小板并稀釋至2×108/ml。11、將血小板懸浮液的pH值調(diào)至7.2，并確定達最大激活所要求的凝血酶(Humanthrombin-Sigma)的量。盡管存在一定量的供體變化，但是最適激活通常在0.25-0.5單位/ml的范圍內(nèi)獲得。最大激活，即最大的凝血酶誘導(dǎo)的凝集，表現(xiàn)為與P-選擇蛋白的最長表達相對應(yīng)。12、在血小板制備物中加入所要求的凝血酶量，將混合物室溫下放置20分鐘，不攪拌，以防止聚集。實施例2阻斷性P-選擇蛋白抗體的制備本實施例描述muMAbPB1.3，即抑制由凝血酶激活的血小板與嗜中性白細(xì)胞結(jié)合的P-選擇蛋白的單克隆抗體的制備。用從Jackson實驗受到獲得的一只RBF/DnJ雄鼠作為抗體產(chǎn)生細(xì)胞的來源，并按照以下程序進行免疫(所有注射均采用腹腔內(nèi)注射)。1、第一個月-200μl含有大約6×109血小板的濃縮的“不新鮮血小板”。2、第二個月-250μl濃縮的“不新鮮血小板”(8×109血小板)3、第四個月-250μl濃縮的“不新鮮血小板”(8×109血小板)4、第五個月-在扁豆凝集素上分離的P-選擇蛋白可溶性部分。5、第六個月-通過扁豆凝集素、凝膠過濾、肝素-瓊脂糖和離子交換層析法純化的可溶性P-選擇蛋白。免疫使用的所有制劑的詳細(xì)制備過程可參見實施例1。A、骨髓瘤融合細(xì)胞系FOX-NY，腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(APRT)和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPRT)缺陷的鼠構(gòu)髓瘤細(xì)胞系，得自AmericanTypeCultureCollection(CRL1732)，在含有10％胎牛血清(Hyclone)t1％L-谷氨酰胺的RPMI1640中維持。B、細(xì)胞融合程序最后一次免疫注射四天后，將RBF/DnJ雄鼠的脾摘除，分離得1.2×108個脾細(xì)胞。這些細(xì)胞按下面的程序用PEG1500(BMB)與FOX-NY骨髓瘤細(xì)胞融合在無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中洗滌分離出的脾細(xì)胞兩次。脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1∶4.8(骨髓瘤細(xì)胞∶脾細(xì)胞)的比例結(jié)合。在無血清培養(yǎng)液中洗滌結(jié)合后的細(xì)胞沉淀兩次，然后通氣致干。通過輕打并在37℃水浴中加熱一分鐘以重懸細(xì)胞沉淀。沉淀分布在50ml圓錐形離心管的管壁和底部。在60秒內(nèi)，邊旋轉(zhuǎn)以保持細(xì)胞薄層邊加入1ml事先加熱至37℃的PEG1500(50％w/v在75mMHEPES中，BMBLot#14702800)。在60秒內(nèi)緩慢加入1ml無血清培養(yǎng)液。稍快地加入另外1ml培養(yǎng)液。再加入8ml培養(yǎng)液，可將離心管放置8分鐘，然后300×g離心5分鐘。將最終的沉淀重懸于含10％胎牛血清(Hyclone)，1％L-谷氨酰胺，1％丙酮酸鈉和1×AAT(Sigma)的RPMI1640中。將細(xì)胞加入10個平底96孔微量滴定板(COSTAR)中。不使用任何飼養(yǎng)細(xì)胞。實施例3非阻斷性P-選擇蛋白抗體的制備本實施例描述MABPNB1.6，即不抑制凝血酶激活的血小板與嗜中性白細(xì)胞結(jié)合的P-選擇蛋白的單克隆抗體的制備。本實施例使用從Jackson實驗室取得的一RBF/DnJ雄鼠作為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞來源，并按以下程序?qū)ζ溥M行免疫(所有注射均為腹腔內(nèi)注射)1、第一個月-100μl凝血酶激活的新鮮分離出的血小板(大約為3×108個血小板)。2、第二個月-200μl凝血酶激活的新鮮血小板(6×109個血小板)3、第四個月-100μl凝血酶激活的血小板(3×109個血小板)最后一次注射四天后，將脾摘出并分離得脾細(xì)胞。大致按照Oi等，“Immunoglobulin-ProducingHybridCellLines”inSelectedMethodsinCellularImmunology，Mishell和Shiigi編，pp351-372，1980(在此以其全文作為本申請的參考資料)所述，使用PEG1500(Sigma)將這些脾細(xì)胞與FOX-NY骨髓瘤細(xì)胞融合。實施例4篩選抗體本實施例描述從實施例2和實施例3中產(chǎn)生的融合細(xì)胞上清培養(yǎng)液的篩選。實施例2的上清培養(yǎng)液用ELISA試驗測定(a)凝血酶激活的血小板；(b)純化的P-選擇蛋白和(c)重組P-選擇蛋白。實施例2的上清培養(yǎng)液用ELISA試驗測定凝血酶激活的血小板。下面分別敘述每一個試驗。每一試驗所用制劑的制備述于實施例1中。A、凝血酶激活的血小板1、以100μml/孔加入明膠并在37℃保溫15分鐘使96孔平底COSTAR滴定板被0.1％明膠(2％明膠-Sigma)包被。2、去除明膠并在每孔中加入100μl凝血酶激活的血小板(108/ml)3、滴定板在37℃保溫15分鐘。4、將滴定板800rpm(90×g)離心2分鐘。5、去除未結(jié)合的血小板，并用PBS洗滌滴定板兩次。6、每孔中加入含1％BSA的PBS100μl，可將滴定板室溫放置60分鐘。7、每孔中加入100μl上清液。將滴定板室溫放于一搖床上60分鐘。8、用PBS洗滌滴定板4次。9、每孔中加入100μl在含1％BSA的PBS稀釋至1/1000的過氧化物酶耦聯(lián)的山羊抗鼠IgG，可將滴定極室溫放置30分鐘。10、用PBS洗滌滴定板7次。11、每孔中加入100μlABTS底物系統(tǒng)(Kirkegaard和Perry，Laboratories，Inc.)。12、可使滴定板室溫發(fā)育達30分鐘之久。13、在TitertekMultiskanMCC/340上測量414nm處的OD值。B、純化的P-選擇蛋白1、經(jīng)扁豆凝集素層析、凝膠過濾層析和DEAE柱層析分離的“可溶的”或“膜結(jié)合的”P-選擇蛋白在DPBS磷酸鹽緩沖液(含CaCl2(1mM)和MgSO4(0.5mM)的磷酸鹽緩沖液(PBS)中稀釋，并在4℃過夜以覆蓋到Falcon96孔微量滴定板上。2、用DPBS＋1％BSA封阻滴定板1小時或更長時間。3、然后在孔中加入待檢上清注，室溫培養(yǎng)30-60分鐘。4、用DPBS洗滌滴定板，然后在孔中加入綿羊抗鼠IgG的辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(SigmaA-6782，DPBS＋1％BSA中1∶1000)，室溫保溫滴定板1小時。5、然后用DPBS洗滌滴定板，用TMBMicrowell底物系統(tǒng)(Kirdegard和Pery，Laboratories，Inc.)進一步處理。C、重組P-選擇蛋白1、用100μl已散布在用重組P-選擇蛋白基因轉(zhuǎn)染的一293個細(xì)胞克隆群的無血清培養(yǎng)液中的P-選擇蛋白4℃過夜，將96孔平底滴定板覆蓋。這一上清液中包含至少8ng/ml的P-選擇蛋白，并覆蓋于COSTAR滴定板上(不稀釋或用培養(yǎng)液稀釋1∶8)。2、用DulbeccoPBS(DPBS)洗滌一次滴定板，用200μl含1％BSA的DPBS室溫下封阻滴定板30分鐘。3、然后按照A部分(第9頁)第7-13步的程序處理滴定板以進行ELISA檢測。D、抗P-選擇蛋白的mABS的同型分析MuMAbPB1.3和MuMAbPB1.6的同型分析表明兩個單克隆抗體均為鼠免疫球蛋白亞綱，IgG1，同型分析使用BoehringerMannheimMouse-Hybridona-Substyping的方法。實施例5P-選擇蛋白的檢測本實施例描述用Western雜交法檢測P-選擇蛋白。將含有P-選擇蛋白的樣品與一等體積的SDS-PAGE樣品緩沖液(非還原性的)混合，在100℃加熱。使之通過一Novex8-16％梯度的凝膠，然后再通過電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。然后在磷酸鹽緩沖液(PBS)＋1％牛血清蛋白(BSA)中將硝酸纖維素膜封阻至少1小時。然后將硝酸纖維素膜與來自表達適當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w的雜交瘤的組織培養(yǎng)液或者用在PBS＋1％BSA中純化的抗體(5μg/ml)一起室溫保濁1小時或更長時間。然后在PBS＋1％BSA中洗滌硝酸纖維素膜若干次，并與溶于PBS＋1％BSA的經(jīng)1/1000稀釋的綿羊抗鼠IgG的辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma，A-6782)一起保溫1小時。然后洗滌此膜，并用四甲基聯(lián)苯胺/膜增強劑(Kinkegaard和Perry，Laboratories，Inc.)顯色染色帶。在產(chǎn)MuMAbPB1.3和MuMAbPB1.6的組織培養(yǎng)物上清液中檢測到一分子量為140kd的蛋白。在被溶解的血小板膜和純化的P-選擇蛋白的制備物中均出現(xiàn)了此現(xiàn)象。實施例6阻斷性P-選擇蛋白抗體在體內(nèi)對急性發(fā)炎損傷的抑制此實施例提供了證明本發(fā)明的阻斷性P-選擇蛋白抗體具有治療急性肺損傷的能力的數(shù)據(jù)。此實施例中，系統(tǒng)的補體激活是通過將眼鏡蛇毒液因子(CVF)經(jīng)血管注入鼠體產(chǎn)生的。在此模型中損傷發(fā)展迅速且已知依賴于嗜中性白細(xì)胞產(chǎn)生的有毒的氧產(chǎn)物。為了進行這些研究，采用了述于實施例2和實施例3中的兩個單克隆抗體。對本研究來說，極其重要的是阻斷性P-選擇蛋白抗體MuMAbPB1.3也抑制了凝血酶激活的鼠血小板對人嗜中性白細(xì)胞的吸附(圖1)。這些資料暗示MuMAbPB1.3可識別一保守的有功能的P-選擇蛋白抗原決定簇，也暗示了阻斷性P-選擇蛋白抗體可能在治療其它的發(fā)炎損傷上也是有用的。為了進行這些體內(nèi)實驗，將CVF以20單位CVF/千克體重靜脈注入300克的成年雄性Long-Evans大鼠中。這導(dǎo)致了血液中的嗜中性白細(xì)胞在肺內(nèi)和血管內(nèi)的快速隔離，同時導(dǎo)致在內(nèi)皮細(xì)胞和嗜中性白細(xì)胞的物理接觸位點上發(fā)生中間毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。使用時，將MuMAbPB1.3和MuMAbPB1.6以被指明的量與CVF一起以0.5ml的總體積靜脈注射。負(fù)對照的動物則靜脈注入0.5ml磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有情形中，注入物質(zhì)也都含有痕量的O-125標(biāo)記的牛血清白蛋白和同源的Cr-51標(biāo)記的血紅細(xì)胞(RBC)。30分鐘后按Mulligan等，J.ClinInvest.881396(1991)所確定的技術(shù)確定肺損傷的參數(shù)(白蛋白的泄露和RBC的外滲)。這些實驗的結(jié)果示于圖2A和2B中。與未經(jīng)自主蝗CVF正對照值相比，200μg的PNB1.6(非阻斷性抗P-選擇蛋白的抗體)與CVF的共同注射未能導(dǎo)致肺損傷的任何減輕。因此，注射CVE和溶于PBS的PNB1.6的動物便被作為正對照。婁用100μgMuMAbPB1.3抗體與CVF一起注射時，通透性降低了19.2％(p＝0.02)，出血降低了37.5％(p＝0.001)(數(shù)據(jù)未列出)。當(dāng)加入200μgMuMAbPB1.3時，通透性降低了50.8％(P＜0.001)(圖2A)，出血分別降低了70.0％(P＜0.001)和70.1％(P＜0.001)(圖2B)。來自動物伴組的肺經(jīng)超聲波勻漿，測量髓過氧化物酶的活性(MP0)以估計肺中嗜中性白細(xì)胞的含量。通過按照標(biāo)準(zhǔn)程序(Warren等，J.Clin.Lnvest.841873(1989))測量雙氧水在鄰聯(lián)菌香胺存在下的分解可以確定MP0。如圖3A所示，用100μg，200μg或400μgMuMAbPB1.3處理可使MP0含量分別比正對照組降低26％(P＝0.024)，41％(＜＝0.001)和50％(P＜0.001)，用200μgPNB1.6注射的動物中MP0含量沒有降低(圖3A)，這與此抗體不能保護CVF誘導(dǎo)的肺損傷相一致。因此，阻斷性抗體MuMAbPB1.3的保護作用是與其干擾嗜中性白細(xì)胞在肺組織中的聚集相關(guān)的。透射式電子顯微鏡對肺部的檢查證實用MuMAbPB1.3處理導(dǎo)致嗜中性白細(xì)胞在肺部中間毛細(xì)血管聚集的降低，嗜中性白細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞吸附的減少和內(nèi)皮細(xì)胞受損事實的減少(圖3B)。為了檢查CVF靜脈沖射后P-選擇蛋白在肺部的表達，將另一組大鼠用CVF注射并在0，5，10，15，20和60分鐘后殺死。用0.C.T.灌肺，快速冷凍，切片，并用MuMAbPB1.3用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測P-選擇蛋白的存在。在0分鐘時，肺部的血管結(jié)構(gòu)中幾乎沒有可檢測到的反應(yīng)活性，而在5分鐘時有非常清楚的著色，在CVF注射后的15分和20分著色進一步增強。著色模式涉及肺部小靜脈和隔區(qū)，與中間毛細(xì)血管的著色模式一致。60分鐘時，著色基本消失(數(shù)據(jù)未列出)。雖然推測在CVF注射前P-選擇蛋白存在于胞內(nèi)的貯存顆粒中，但顯然P-選擇蛋白向內(nèi)皮表面的移動大大增強了其與MuMAbPB1.3抗體的反應(yīng)活性。實施例7競爭結(jié)合試驗從人血中分離血小板、用凝血酶激活被分離的血小板以及分離PMNS(嗜中性白細(xì)胞)的方法已述于上面的實施例1中。攜帶P-選擇蛋白的單克隆抗體的凝血酶激活的血小板的培養(yǎng)a、向24個Eppendorf離心管(1.5ml)中每個加入20μl凝血酶激活的血小板(2×108/ml)。b、向其中8只管中加入20μl由PNB1.6純化制得的溶于含1mMCaCl2，pH7.2的Tyrode-Hepes緩沖液中的濃度為10μg/ml的IgG部分。向另外8只管中加入20μl濃度為1μg/ml的的相同的IgG制備物。向余下的8只管中只加入20μl緩沖液。c、混合并在室溫放置20分鐘。d、向每8只管中加入20μl由MuMAbPB1.3純化制得的濃度為10μg/ml到0.03μg/ml的IgG部分。e、混合，室溫放置20分鐘。f、加入20μg濃度為3×106/ml的嗜中性白細(xì)胞。g、混合，室溫放置20分鐘。h、以如下方法在顯微鏡下估計吸附每個樣品計數(shù)100個嗜中性白細(xì)胞。結(jié)合了兩個或更多的血小板的細(xì)胞計為正，結(jié)合的血小板少于2個的細(xì)胞計為負(fù)。計算正細(xì)胞的百分率。如圖1所示，用MuMAbPB1.6預(yù)處理凝血酶激活的血小板并不影響MuMAbPB1.3阻斷血小板在P-選擇蛋白介導(dǎo)下對嗜中性白細(xì)胞吸附的能力。實施例8阻斷性P-選擇蛋白抗體的結(jié)合的說明I、(a)單克隆抗體的純化通過將組織培養(yǎng)物上清液通過一蛋白質(zhì)G瓊脂糖4快流柱(Pharmacia)可分離制得單克隆抗體PNB1.6和84/26。柱子要用磷酸緩沖液(PBS)充分沖洗，用0.1MpH2.7的甘氨酸-鹽酸溶液將結(jié)合的抗體洗脫到裝有0.2-0.5倍體積的pH8.8的1MTris的管子中。用于分離MuMAbPB1.3的方法與此相同，只是結(jié)合到Q蛋白上的抗體是用0.1M，pH2.5的醋酸-鹽酸洗脫到裝有0.3倍體積的pH10的2MTris的管子中。合并含有各種成分的抗體，并在4℃下在PBS中透析，PBS要更換幾次。(b)muMAbPB1.3親和柱的制備為了用于P-選擇蛋白的純化，按照生產(chǎn)商的親和指南(Schliecher和Schuell)將muMAbPB1.3與tresyl活化的瓊脂糖相結(jié)合。(c)P-選擇蛋白的純化向上述制得的洗過的不新鮮人血小板中加入1％體積的5mg/ml抑酶醛肽和1％體積的35mg/ml的AEBSF(Calbiochem)混合后，將血小板在干冰/甲醇浴中或液氮中凍融3次，用Dounce勻漿器攪拌10次，用Beckman70TI轉(zhuǎn)頭4℃，35，000rpm離心1小時。沉淀重懸于Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS，whittakerBioproducts，它包含約0.9μMCa++和0.5mMMg++)，并加入5mM苯甲脒-鹽酸，100mM的抑酶醛肽和2％的Tritonx-100。重懸懸液并用Dunce勻漿器攪拌10次，4℃保溫1小時，在Beckman70TI轉(zhuǎn)頭上4℃，35,000rpm離心1小時。將上清液通過一已用DPBS＋0.05％Rennex30(AccurateChemicalandScientificCorp.)平衡的muMAbPB1.3-瓊脂糖柱。用DPBS＋0.05％Rennex30充分洗柱，再用0.1M三乙基胺-鹽酸，0.05％Rennex30，pH11.5的溶液將結(jié)合在柱上的P-選擇蛋白洗脫到裝有0.1倍體積的pH6.8的1M磷酸鹽溶液的試管中。合并含P-選擇蛋白的各部分洗脫物，在DPBS＋0.05％Rennex30中透析，用Centricon30或Centriprep30旋轉(zhuǎn)濃縮儀(Amicon)濃縮，分裝，-80℃存放。(d)多肽CQNRYTDLVAIQNKNE(Cys-Glu-Asn-Arg-Tyr-Thr-Asp-Leu-Val-Ala-Glu-Asn-Lys-Asn-Glu-NH2)的制備用Fmoc保護的氨基酸和用于氨基酸激活的2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3，-四甲基脲六氟磷酸酯在AppliedBiosystems公司(FosterCity，CA)的43OA多肽合成儀上合成此肽。每個氨基酸一般都加倍結(jié)合。Fmoc保護的氨基酸和羥基苯并三唑購自AppliedBiosystems公司。所有溶劑均購自Burdick和Jackson公司。HBTU購自RichelienBiotechnologies公司(St.Hyacinthe，Canada)，哌啶和三氟乙酸，乙酸酐，苯甲硫醚，苯酚和二硫乙烷購自Sigma公司。將Fmoc-Amide樹脂(BachemBiosciences)放入多肽合成反應(yīng)容器中，并用N-甲基吡咯烷酮(NMP)洗滌一次。然后按下面操作順序進行1、用溶于NMP的25％哌啶處理結(jié)合了氨基酸的樹脂以除去Fmoc保護基團。2、用NMP洗滌樹脂五次。3、向反應(yīng)容器中加入含N-α-Fmoc-L-谷氨酸γ-叔丁酯，二異丙基乙胺，HBTU和NMP的混合物，劇烈攪拌下反應(yīng)30分鐘。4、排出溶劑，用NMP洗滌樹脂三次。5、再重復(fù)做兩遍第(3)、(4)步。6、再用NMP洗滌樹脂四次。對多肽的每一氨基酸重復(fù)第1-6步。在最后一次偶聯(lián)循環(huán)之后，通過與在NMP中的25％哌啶反應(yīng)與樹脂結(jié)合的多肽被去保護，用NMP洗滌此多肽七次，用二氯甲烷洗滌兩次。真空干燥此樹脂24小時。通過用含2.5％二硫乙烷，5％苯甲硫醚，7.5％苯酚和5％水的三氟乙酸處理，從此樹脂中分出多肽。通過過濾從三氟乙酸溶液中分離出聚苯乙烯樹脂。真空蒸發(fā)去除三氟乙酸。用二乙醚研磨粗肽，并溶于水中。用冷凍干燥去除水。然后用乙腈、水(均含0.1％TFA作為調(diào)節(jié)劑)梯度通過在C8柱(VYDAC)上反相HPLC純化多肽。(e)單克隆抗體的生物素標(biāo)記抗體在pH8.5的0.1MNaHCO3溶液中透析。加入NHS-LC生物素(Pierce)至0.3mg/ml，室溫兩小時后，抗體在PBS中透析并換液幾次。(f)包被用于ELISA的微量滴定板以50μl/孔加入溶于DPBS的2μg/ml經(jīng)親和純化的P-選擇蛋白，4℃過夜，包被96孔微量滴定板(FalconMicrotestIII)。(g)Western雜交當(dāng)血小板被溶于SDS-PAGE電泳緩沖液(未還原)，進行SDS-PAGE電泳并被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上時，muMAbPB1.3，muMAbPNB1.6和84-26全部與一個140KD的帶結(jié)合(數(shù)據(jù)未列出)。還發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品用β-巰基乙醇還原時，muMAbPB1.3和muMAbPNB1.6在Western雜交法中不再識別P-選擇蛋白。II、二價陽離子的螯合對單克隆抗體與P-選擇蛋白結(jié)合的作用用上述經(jīng)親和層析純化的P-選擇蛋白包被兩個微量滴定板。滴定板1用200μl/孔PBS＋1％BSA阻斷，而滴定板2用200μl/孔DPBS＋1％BSA(DPBS含Ca++和Mg++)阻斷。1小時后，洗滌二滴定板(滴定板1用PBS洗滌，滴定板2用DPBS洗滌)。在滴定板1的孔中加入25μl含25mMEDTA的PBS＋1％BSA溶液，在滴定板2中加入25μlDPBS＋1％BSA。1小時后，兩個滴定板的孔中分別加入25μl的各種稀釋度的適當(dāng)抗體的溶液。對應(yīng)滴定板1的各種稀釋用PBS＋1％BSA完成，對應(yīng)滴定板2的各種稀釋用DPBS＋1％BSA完成。1小時后，洗滌兩個滴定板，加入50μl1/1000稀釋度的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的綿羊抗鼠IgG(滴定板1的各種稀釋用PBS＋1％BSA完成，滴定板2用DPBS＋1％BSA完成)。1小時后，洗滌兩個滴定板，加入50μl過氧化物酶底物TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺，Kirkagaard和PerryLaboratories，Inc.)待顏色達適宜水平后，通過加入25μl1M的磷酸結(jié)束底物反應(yīng)，在450nm處讀吸收值。圖4顯示了在含有Ca++和Mg++的DPBS緩沖液中和在PBS＋25mMEDTA(一種二價金屬陽離子螯合劑)中，P-選擇蛋白單克隆抗體與P-選擇蛋白的結(jié)合。為支持嗜中性白細(xì)胞吸附到P-選擇蛋白上，DPBS中二價陽離子濃度過量(Geng等，1991)；而為阻斷嗜中性白細(xì)胞吸附到P-選擇蛋白上，25mM的螯合劑EDTA過量。EDTA的存在對所有單克隆抗體與P-選擇蛋白結(jié)合幾乎沒有影響，這表明Ca++對結(jié)合的發(fā)生不是必需的。muMAbPB1.3是一種阻斷性抗體，這就是說，它能阻斷嗜中性白細(xì)胞與P-選擇蛋白(如在激活的血小板上)的結(jié)合。PNB1.6是另一種非阻斷性抗體。84/26阻斷嗜中性白細(xì)胞與P-選擇蛋白結(jié)合的能力尚未被完全闡明。相對而言，在Geng等所述的P-選擇蛋白單克隆抗體中，只有非阻斷性抗體S12在Ca++不存在情況下能夠結(jié)合。III、多肽CQNRYTDLVAIQNKNE對muMAbPB1.3與P-選擇蛋白結(jié)合的作用用上述經(jīng)親和層析純化的P-選擇蛋白包被一個微量滴定板，用200μl/孔DPBS＋1％BSA阻斷該滴定板1小時，然后洗滌。各種稀釋度的含muMAbPB1.3的DPBS＋1％BSA溶液與與溶于PBS的0.35mg/mlCQNRYTDLVAIQNKNE混合，或作為對照只與PBS混合。1小時后，將50μl每種稀釋度的抗體加入微量滴定板中，并保溫1小時。用DPBS洗滌滴定板，加入溶于DPBS＋1％BSA的稀釋度為1/1000的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的綿羊抗鼠IgG。1小時后，洗滌滴定板，加入底物TMB，按如上所述終止顯色反應(yīng)并讀吸收值。圖5顯示了當(dāng)多肽濃度為0.35mg/ml時，與P-選擇蛋白凝集素結(jié)構(gòu)域的殘基19-34同源的多肽CQNRYTDLVAIQNKNE對muMAbPB1.3與P-選擇蛋白的結(jié)合沒有影響。這一特點將這種特殊的單克隆抗體與單克隆抗體G1、G2和G3區(qū)別開來，這些單克隆體與P-選擇蛋白的結(jié)合可被這一多肽部分或全部阻斷。IV、CytelmuMAbPB1.3，muMAbPNB1.6和84/26阻斷彼此與P-選擇蛋白結(jié)合的能力用DPBS＋1％BSA阻斷由經(jīng)上述親和層析純化的P-選擇蛋白包被的微量滴定板1小時，然后洗滌滴定板。在適當(dāng)?shù)目字屑尤?5μl溶于DPBS＋1％BSA的50μg/ml的muMAbPB1.3，muMAbPNB1.6或84/26溶液，保溫1小時。然后，加入25μl生物素標(biāo)記的抗體的DPBS＋1％BSA稀釋液。滴定板在平臺型搖床上保溫1小時。洗滌后，加入50μl1/1000稀釋度的鏈親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物，并保溫1小時。用DPBS洗滌后，如上所述用底物TMB處理滴定板。圖6顯示了muMAbPB1.3，muMAbPNB1.6和84/26干擾彼此與P-選擇蛋白結(jié)合的能力。圖6A中顯示出只有muMAbPNB1.6能夠阻斷生物素標(biāo)記的muMAbPNB1.6與P-選擇蛋白的結(jié)合，這表明muMAbPB1.3和84/26一定是識別與muMAbPNB1.6不同的抗原決定簇。同樣，在圖6B中，muMAbPB1.3，而不是muMAbPNB1.6或84/26，能夠阻斷生物素標(biāo)記的PB1.3與P-選擇蛋白的結(jié)合，這表明其它兩種單克隆抗體一定是識別不同的抗原決定簇。圖6C中，muMAb84/26和muMAbPB1.3(但非muMAbPNB1.6)均能阻斷生物素標(biāo)記的muMAb84/26與P-選擇蛋白的結(jié)合。V、阻斷性P-選擇蛋白抗體不抑制凝血酶誘導(dǎo)的人血小板的凝聚本實施例表明P-選擇蛋白抗體，muMAbPB1.3和PNB1.6不抑制血小板的凝血酶誘導(dǎo)的凝聚。按前述方法分離新鮮的人血小板，并以2×108/ml的濃度重懸于pH7.2的Tyrode-Hepes緩沖液中。血小板凝聚在Lumi凝聚儀(Chrono-LogCorp.)中完成。為此試驗，將0.45ml血小板懸浮液置于一個標(biāo)準(zhǔn)的硅化過的小杯中。在其中加入10μl抗體或載體對照。5分鐘后，37℃下加入0.1單位的凝血酶(人的，Sigma)，并記錄凝聚。在對照條件下抗體不存在時，測量血小板凝聚時，獲得了71單位的凝聚反應(yīng)。當(dāng)來自產(chǎn)生muMAbPB1.3抗體的細(xì)胞10μl未稀釋培養(yǎng)物上清液存在時，獲得了一個相同程度的凝聚(圖7)。在血小板懸浮液中加入不同濃度的muMAbPB1.3(1-100μg/ml)。在任何濃度的muMAbPB1.3存在下，血小板凝聚與抗體不存在時測定的反應(yīng)均相同(圖7)。實施例9阻斷性P-選擇蛋白抗體muMAbPB1.3在貓心肌局部缺血和再充血過程中的體內(nèi)保護作用按照Tsao的方法(Circulation821402-1412(1990))用貓完成了心肌局部缺血和再充血損傷的模型。簡而言之，用戊巴比妥鈉(30mg/kg)麻醉雄貓(2.5-3.5千克)。通過中線切口插入一個氣管內(nèi)管子，并通過一個Harvard小型動物呼吸器對所有貓實現(xiàn)間歇性正壓通氣。將一個聚乙烯導(dǎo)管插入外部的頸靜脈，右股靜脈插管并與一個StathamP23AC壓力轉(zhuǎn)換器連接以測量動脈血壓。實施中線胸廓切開術(shù)，將心包打開暴露心臟。用一個2-0線小心地圍住距其起始點10-12mm的左前方下行動脈(LAD)。穩(wěn)定30分鐘后，通過完全捆住LAD，心肌局部缺血開始，1.5小時后，進行4.5小時的再充血。再充血開始前10分鐘，進行劑量為1mg/kg的阻斷性抗體(muMAbPB1.3)和非阻斷性抗體(muMAbPNB1.6)的靜脈內(nèi)用藥。將氮藍四唑未著色的組織部分確定為局部缺血的心肌，并以危及面積的百分比來表示。在再充血末期將左前方下行動脈(LAD)重新閉合，通過向左心房注入Evans藍染料來確定危及面積。因此，危及面積是用負(fù)染色法確定的。通過測量乙酰膽堿誘導(dǎo)的原先用凝血噁烷A2類的U46619收縮的環(huán)的舒張確定了冠狀動脈環(huán)的內(nèi)皮依賴舒張。實驗數(shù)據(jù)以舒張百分比來表達。用polytron勻漿的心肌組織的髓過氧化物酶活性測量了心肌中嗜中性白細(xì)胞的聚集。這些實驗的結(jié)果示于圖8中。在用非阻斷性P-選擇蛋白抗體muMAbPNB1.6處理的貓中，心肌局部缺血的范圍為危及面積的33±5％。相對而言，在用muMAbPB1.3處理的貓中，局部缺血的范圍明顯低于(p＜0.01)危及面積的15±5％。與muMAbPNB1.6相比，從用muMAbPB1.3處理的貓中取出的局部缺血再充血冠狀動脈中，乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴舒張也明顯被保護(67±＋6％對11±3％，p＜0.01)。與muMAbPNB1.6處理的動物相比，用muMAbPB1.3處理的動物中取出的心肌組織中PMN數(shù)量的明顯減少(136±12PMN/mm2對64±7PMN/mm2)(p＜0.1)，表明這些現(xiàn)象可歸因于心肌白細(xì)胞濾出的減少。實施例10P-選擇蛋白人源化抗體的生產(chǎn)A、muMAbPB1.3可變區(qū)的克隆和測序muMAbPB1.3的分離述于實施例2。將總RNA從產(chǎn)生muMAbPB1.3的雜交瘤細(xì)胞中分離出來。編碼muMAbPB1.3的重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)得以擴增。利用在前導(dǎo)序列中雜交的簡并引物和與v-c接合區(qū)附近的鼠恒定區(qū)雜交的單一引物的混合物擴增完整的鼠可變區(qū)。見Jones和Bending，Bio/Technology，988-89(1991)和Bio/Technology9579(1991)。將PCR片段克隆、測序。muMAbPB1.3重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別示于圖9和圖10。B、muMAbPB1.3可變區(qū)的結(jié)構(gòu)模擬建立一muMAbPB1.3VL和VH區(qū)的分子模型。此模型建立在一個在UNIX操作系統(tǒng)下運行并使用分子模擬包QUANTA(PolygenCorp.USA)的SiliconGraphicsIRIS4D工作站上。muMAbPB1.3可變區(qū)的氨基酸序列與結(jié)構(gòu)已知的免疫球蛋白可變區(qū)序列進行了比較。見表1、2。C、重構(gòu)的muMAbPB1.3可變區(qū)的設(shè)計選擇與在muMAbPB1.3可變區(qū)發(fā)現(xiàn)的構(gòu)架區(qū)域極為相似的人可變區(qū)。選擇人mABDEN輕鏈可變區(qū)和人mAb21/28’CL重鏈可變區(qū)作為構(gòu)架區(qū)與相應(yīng)的muMAbPB1.3的互補決定區(qū)(CDR)連接。人構(gòu)架區(qū)的修飾使用MonoclonalAntibodies，2ApplicationsinClinicalOncology(EditorA.EpenetosChapman和Hall，1992，在此以其全文作為本申請的參考資料；尤其是，Bending等，TheHumanizationofMouseMonoclonalAntibodiesbyCDR-GraftingExampleswithAnti-ViralandAnti-TumorCellAntibodies，在此以其全文作為本申請的參考資料)所述的方法。導(dǎo)致重構(gòu)的人源化PB1.3可變區(qū)的設(shè)計的可變區(qū)氨基酸的對比示于表1，2。重鏈可變區(qū)的三個模本被摸擬，并被命名為CY1748RHA，CY1748RHB，和CY1748RHC。這些信號肽和可變區(qū)的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列分別示于圖11，12和13中。CY1748RHB中，在CY1748RHA中前兩個保守鼠氨基酸殘基(谷氨酸和丙氨酸)被重新變成在人FR1供體中發(fā)現(xiàn)的原來的人氨基酸(谷氨酰胺和纈氨酸)；在CY1748RHC中，計算機模擬表明73位的鼠賴氨酸可能與CDR2中的第55個殘基(天冬氨酸)形成一個鹽橋。若果真如此，則賴氨酸將對H2環(huán)的穩(wěn)定極為重要。此位上的人蘇氨酸殘基將不能形成這樣一個鹽橋。因此，模本CY1748RHC在CY1748RHA的73位上換用了鼠的賴氨酸，模本CY1748RHB包含最高數(shù)目的人氨基酸殘基。重鏈的這三個模本間的氨基酸差異總結(jié)于表3中。輕鏈可變區(qū)的四個模本被模擬，并被命名為CY1748RLA，CY1748RLB，CY1748RLC，和CY1748RLD。這些可變區(qū)和信號肽的核苷酸和氨基酸序列分別示于圖14，15，16和17中。計算機模擬表明60位上的鼠谷氨酸殘基在結(jié)合P-選擇蛋白時有重要作用。此殘基被摻入模本CY1748RLA，但在模本CY1748RLB中被原始的人構(gòu)架的絲氨酸殘基所取代。鼠天冬氨酸殘基可能與環(huán)1(L1)上的24位殘基有電荷相互作用，因此除了在70位上用鼠的天冬氨酸殘基取代了人構(gòu)架的谷氨酸殘基外，CY1748RLC是與CY1748RLA，完全相同的。CY1748RLD將這兩個氨基酸取代都含于其中，并是這四個模本中包含了最高數(shù)目的人氨基酸殘基的模本。輕鏈的這四個模本間的氨基酸差異總結(jié)于表4。D、將編重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA亞克隆到表達載體上(1)表達載體的構(gòu)建(a)pHCMV-1748RL-KR-neo此表達載體包含人細(xì)胞肥大病毒(HCMV)的增強子和啟動子以驅(qū)動重組的免疫球蛋白輕鏈的轉(zhuǎn)錄，編碼細(xì)菌neo基因的序列以在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化中作為顯性選擇標(biāo)記，以及SV40的復(fù)制起點以在cos細(xì)胞中產(chǎn)生高水平的瞬時表達。為構(gòu)建此載體，通過利用合適的寡核苷酸接頭將一個來自包含HCMV的PstI-m片段的pUC8載體(Boshartetal.，Cell41521-530(1985))的HindIII-SacII片段轉(zhuǎn)換成EcoRI-HindIII片段。在三片段連接反應(yīng)中，含HCMV增強子-啟動子的1.2kb的EcoRI-HindIII片段與來自pSV2neo的5.05kb的BamHI-EcoRI片段(SouthernandBerg，J.Mol.App.Gener1327-341(1982))和含VLlyskappa輕鏈可變區(qū)的0.5kb的HindIII-BamHI片段(FooteandWinter，J.Mol.Biol.224487-499(1992))相連接。在此之前，pSV2-neo中的Hindm切點已經(jīng)Klenow聚合酶補平去掉，形成了命名為pHCMV-VLlys-neo的質(zhì)粒。一個2.6kb的基因組人kappa區(qū)片段已被克隆(Rabbitts等，Curr.Top.Microbiol.Immuno.113166-171(1984))并亞克隆到名為pUCKR17的pUC載體上(Mengle-Gaw，EMBOJ.61959-1965(1987))。利用EcoRI-BamHI接頭將BamHI切點加到此片段的兩端，然后將此片段以適當(dāng)方向插入pHCMV-VLlys-neo的BamHI位點，以產(chǎn)生質(zhì)粒pHCMV-VLlys-KR-neo。為了便于重構(gòu)的人可變區(qū)的插入，用Klenow聚合酶補平除去了人kappa恒定區(qū)3’側(cè)的BamHI位點。在形成的命名為pHCMV-1748RL-KR-neo的質(zhì)粒中，含VLlys的HindIII-BamHI片段很容易地為一重構(gòu)的抗體的VL所取代。(b)pHCMV-1748-γ1C-neo此載體的構(gòu)建過程始于與上述構(gòu)建pHCMV-VLlys-neo相同的三片段連接，只是用0.7kb的含VHlys重鏈可變區(qū)的HindIII-BamHI片段(Verhoegen等，Science2391534-1536(1988))取代了0.5kb的含VLlyskappa輕鏈的HindIII-BamHI片段。編碼人γ1恒定區(qū)的cDNA經(jīng)PCR擴增從分泌人γ1抗體的人細(xì)胞株中克隆到。在此cDNA的兩端構(gòu)建出了BamH位點，且拼接受體位點和65bp的內(nèi)含子序列被導(dǎo)入了此cDNA的5-末端。然后將包含人γ1cDNA及拼接受體位點和內(nèi)含子序列的BamHI片段(1176bp)克隆到表達載體上。當(dāng)用輕鏈表達載體時，人γ1恒定區(qū)的3’側(cè)的BamHI切點被Klenow聚合酶補平除去。利用此命名為pHCMV-1748-γ1C-neo的載體，含不想要的VHlys的HindIII-BamHI片段可容易地用重構(gòu)抗體的VH取代。(2)免疫球蛋白編碼序列的插入通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼muMabPB1.3的重鏈可變區(qū)和三個人源化模本的cDNA插入了表達載體HCMV-γ1C-neo中，得到表達質(zhì)粒HCMV-1747CH-γ1C-neo、HCMV-1748RHA-γ1C-neo、HCMV-1748RHB-γ1C-neo和HCMV-1748RHC-γ1C-neo。人IgG1恒定區(qū)cDNA的核苷酸序列及相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列見Etlison等，Nrc.Acids.Res.，104071-4079(1982)。將編碼CY1747(PB.3)的輕鏈可變區(qū)和四個人源化的模本的cDNA插入到表達載體HCMV-KR-neo上，得到質(zhì)粒HCMV-1747CL-KR-neo，HCMV-1748RLA-KR-neo等。人kappa恒定區(qū)基因的核苷酸序列和相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列見Hieter等，Cell22179-207(1980)(在此以其全文作為本申請的參考資料)。重鏈和輕鏈表達載體的簡圖見圖18和19。通過適當(dāng)組合的重鏈和輕鏈的共表達，幾種抗體可被表達出來。如HCMV-1748RHA-γ1C-neo和HCMV-1748RHB-γ1C-neo的共表達會產(chǎn)生重構(gòu)的MAbPB1.3(HA/LA)，HCMV-1747CH-γ1C-neo和HCMV-1747CL-KR-neo的共表達會產(chǎn)生chiMAbPB1.3(即包含鼠可變區(qū)和人可變區(qū)的嵌合抗體)。E.COS細(xì)胞的電穿孔轉(zhuǎn)化為瞬時表達chiMAbPB1.3和MAbPB1.3抗體的各種重構(gòu)的模本，在COS細(xì)胞中檢測上述DNA構(gòu)建物。用GenePulser儀(Biorad)以電穿孔法將DNA導(dǎo)入COS細(xì)胞中。將COS細(xì)胞用胰酶消化并在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗一次。將DNA(重鏈質(zhì)粒和輕鏈質(zhì)粒10μg)和0.8ml的懸于PBS中濃度為1×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞放入無菌的基因脈沖小杯(Biorad，0.4cm縫寬)中，以1900伏，25微法的電容發(fā)射一脈中。室溫下經(jīng)過10分鐘的回復(fù)期后，向其中加入20ml含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(GIBCO/BRL)。保溫48小時，收集培養(yǎng)液，離心除去細(xì)胞碎片，在無菌條件下短時間內(nèi)存放于4℃。實施例11人源化抗體的分析用ELISA測定此轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞培養(yǎng)液以定量化所產(chǎn)生的人抗體的水平并分析與重組的可溶性P-選擇蛋白(rsP-選擇蛋白)的結(jié)合能力。以每孔100μl終濃度為12.5μg/ml的山羊抗人IgG(完整分子，Sigma#I-1886)溶液(DPBS)或在Dulbecco磷酸鹽綏沖液(DPBS)中稀釋了的rsP-選擇蛋白溶液(1.2mg/ml)包被免疫用微量滴定板(Dynatech，#011-101-3355)，4℃過夜或37℃2小時包被。用DPBS洗板三次，然后用DPBS＋1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，#A-7888)以400μl/孔在室溫下阻斷滴定板1個小時或更長時間。然后用DPBS洗三次。將在DPBS＋1％BSA中連續(xù)稀釋的單克隆抗體加入到滴定板中(100μl/孔)，室溫保溫1小時。然后用DPBS洗三次。將在DPBS＋1％BSA中稀釋到1∶1000的第二抗體(山羊抗人IgG的過氧化物酶偶聯(lián)物，Sigma#A-8867)以100μl/孔加入滴定板中，室溫保溫1小時。然后用DPBS洗三次。將四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物/H2O2(TMB，Kirkegaard和Perry實驗室，#50-76-00)以100μl/孔加入滴定板中，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臅r間進行顯色(一般為3-15分鐘)，向每孔加入100μl1M磷酸以終止反應(yīng)。在TitertekMultiskanMCC/340上讀取450nm處的吸收值。通過將IgG的ELISA結(jié)果與已知濃度的人IgG1抗體(kappa輕鏈，Sigma#I-3889)相比，確定所有COS細(xì)胞上清液中的抗體濃度。P-選擇蛋白的結(jié)合以光密度值比IgG濃度的形式來表達。chiPB1.3和重構(gòu)的MAbPB1.3的各種重構(gòu)的模本結(jié)合曲線示于圖20，21和22中。目的是要選出一具有基本上與chiMAbPB1.3不可區(qū)分的結(jié)合特性的人源化抗體。如果不止一個人源化抗體有如此特性，則以含有最多人氨基酸殘基(或最少的鼠氨基酸)的那個為優(yōu)選，因為此模本在臨床應(yīng)用上最不可能引起HAMA反應(yīng)。與重鏈CY1748RHA共表達的四個重構(gòu)的輕鏈都產(chǎn)生了可與rsP-選擇蛋白和chiMAb1.3結(jié)合的抗體。其中輕鏈可變區(qū)CY1748LRD被選出來做進一步實驗，因為它含有最多的人氨基酸殘基。當(dāng)與輕鏈可變區(qū)CY1748RLA和CY1748RLD共表達時，重鏈可變區(qū)CY1748RHA和CY1748RHB也產(chǎn)生了可以與chiMAbPB1.3相同程度的結(jié)合rsP-選擇蛋白的抗體(圖22)。這些重鏈中，優(yōu)選的是重鏈CY1748RHB，因為它含有最多的人氨基酸殘基。因此，從輕鏈D和重鏈B出發(fā)構(gòu)建了一優(yōu)選的人源化抗體，命名為MAbPB1.3(HB/LD)。實施例12重構(gòu)的MAbPB1.3(HB/LD)在CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達A、將人源化的免疫球蛋白鏈導(dǎo)入CHO細(xì)胞(1)載體的構(gòu)建(a)pHCMV-1748RH-γ1C-dhfr此載體與述于實施例11中的pHCMY-1748RH-γ1C-neo相同，只是用連接到一缺陷的SV40啟動子-增強子序列的二氫葉酸還原酶基因(dhrf)取代了neo基因。為了從SV40早期啟動子中去掉增強子序列，將pSV2-dhfr(Subramani等，Mol.Cell.Biol.1854-864(1981))的質(zhì)粒DNA用SphI和PvuII消化，Klenow聚合酶補平，并自連以得到pSV2-dhfr-△E。用EcoRI從質(zhì)粒pHCMV-VHlys-γ1-neo上切下一包含HCMV啟動子，VHlys重鏈可變區(qū)和人γ1恒定區(qū)的基因組DNA克隆的3.7kbEcoRI片段。將此片段連接到EcoRI消化的pSV2-dhfr-△E質(zhì)粒上以產(chǎn)生pHCMV-VHlys-γ1-dhfr。用述于實施例11的含人γ1恒定區(qū)的cDNA克隆的BamHI片段取代γ1恒定區(qū)的基因組克隆。然后象實施例11中一樣，人γ1恒定區(qū)的3’側(cè)的BamHI位點通過用Klenow聚合酶補平以除去。形成的質(zhì)粒命名為pHCMV-174RH-γC-dhfr。載體中含不想要的VHlys的HindIII-BamHI片段很容易地用一重構(gòu)的抗體的VH取代。(b)pHCMV-1748RH-γ4-dhfr此載體與上述pHCMV-1748RH-γ1C-dhfr相同，只是用人γ4恒定區(qū)的基因組克隆取代了人γ1恒定區(qū)的cDNA克隆。為構(gòu)建此載體，將一含人γ4恒定區(qū)基因組克隆的7.0kb的DNA片段(Bruggeman等，J.Exp.Med.1661351-1361(1987)亞克隆到pUC19的HindIII位點以產(chǎn)生質(zhì)粒428D。因為人γ4片段已在3’端有一BamHI位點，故此亞克隆以使此位點位于pUC19的多酶接頭的BamHI位點的遠側(cè)的方向插入pUC19。用BamHI將此7.0kb的人γ4片段從428D上切下，連入pHCMV-VHlys-neo以產(chǎn)生質(zhì)粒pHCMV-VHlys-γ4-neo。將一個含HCMV增強子-啟動子和pSV2-dhfr-/E質(zhì)粒序列的5.4kb的BamHI-HindIII片段，一個0.5kb的含重構(gòu)的人1748抗體的VH的HindIII-BamHI片段和此7.0kb的含人γ4恒定區(qū)基因組克隆的BamHI-BamHI片段經(jīng)過一個三片段連接反應(yīng)，構(gòu)建出目的質(zhì)粒。(2)免疫球蛋白編碼序列的插入將編碼1748RHA重鏈可變區(qū)的cDNA克隆到表達載體HCMV-1C-dhfr上，得到質(zhì)粒HCMV-1748RHA-1C-dhfr。將編碼1748RHB的cDNA克隆到表達載體HCMV-1C-dhfr和HCMV-4C-dhfr上，分別得到質(zhì)粒HCMV-1748RHB-1C-dhfr和HCMV-1748RHB-4C-dhfr。人IgG4恒定區(qū)基因的核苷酸序列和相應(yīng)的氨基酸序列見Ellison等，DNA，111-18(1981)。當(dāng)與kappa輕鏈載體共表達時，載體HCMV-1C-dhfr表達IgG1型抗體，載體HCMV-γ4C-dhfr表達IgG4型抗體。dhfr表達載體的簡圖分別示于圖23和24。在αMEM(+核苷酸，GIBCO/BRL)和10％胎牛血清中培養(yǎng)dhfr缺陷的CHO細(xì)胞。用電穿孔的方法利用GenePulser儀將質(zhì)粒DNA導(dǎo)入CHO細(xì)胞。用胰酶消化CHO細(xì)胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗一次。將DNA(每個重鏈質(zhì)粒和適當(dāng)?shù)妮p鏈質(zhì)粒10μg)和一份0.8ml的懸于PBS中的濃度為1×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞放入一無菌的GenePulser小杯中(0.4cm的裂縫)。以1900伏，25微法電容發(fā)射一脈沖。室溫回復(fù)10分鐘，將電穿孔的細(xì)胞加入到20mlαEME(+核苷酸)/10％PBS中。培養(yǎng)24-48小時后用胰酶消化細(xì)胞，鋪入含αMEM(+核苷酸)/10％透析過的PBS(以選擇含dhfr質(zhì)粒的表達)并補加了500μg/mlG418(GIBCO/BRL，以選擇含neo質(zhì)粒的表達)的100mm培養(yǎng)皿中。每3-4天換液一次直至克隆出現(xiàn)。用克隆圓筒分離單克隆，擴增，并用ELISA分析IgG的產(chǎn)量。有三組DNA被導(dǎo)入CHOdhfr缺陷的細(xì)胞1)HCMV-1748RHA-γ1C-dhfr和HCMV-1748RLA-KR-neo，表達重構(gòu)的IgG1型的MAbPB1.3(HA/LA)；2)HCMV-1748RHB-γ1C-dhfr和HCMV-1748RLD-KR-neo，表達重構(gòu)的IgG1型的MAbPB1.3(HB/LD)；和3)HCMV-1748RHB-γ4C-dhfr和HCMV-1748RLD-KR-neo，表達重構(gòu)的IgG4型的MAbPB1.3(HB/LD)。擴增CHO細(xì)胞并種入10室(總表面積6000cm2)Nunc細(xì)胞工廠中。72小時后收集培養(yǎng)液，并使之通過蛋白質(zhì)A瓊脂糖快流柱(Pharmacia)。洗柱，并在pH4.5洗脫牛IgG。在pH3.5洗脫人源化抗體，在PBS或20mM醋酸，0.15MNaCl，pH5.5的溶液中透析。用分光光度法測定抗體濃度并用人IgGELISA實驗證實。(純化的人IgG4抗體(kappa，Sigma#1-4639)被用為IgG4型的muMAbPB1.3(HB/LD)的對照。)用SDS-PAGE確證純度。B、競爭結(jié)合試驗用競爭ELISA試驗測量了重構(gòu)的MAbPB1.3的各種模本對P-選擇蛋白的相對結(jié)合親和力。試驗測量了將標(biāo)記的muMAbPB1.3與P-選擇蛋白的結(jié)合抑制50％時未標(biāo)記的抗體的濃度。將2ml純化的MAbPB1.3(1mg/ml)與100.8μlNHS-LC-生物素(1mg/ml，Pierce)混合，4℃過夜。將2.1ml樣品上NAP25柱(sizeexclusion柱，Pharmacia)。用PBS每0.3ml組分洗脫此柱，在280nm計數(shù)每組分的吸收值。合并有最高O.D.280nm的各組分。用此生物素標(biāo)記的MAbPB1.3滴定rsP-選擇蛋白以選出用于競爭結(jié)合試驗的合適濃度。以50μl/孔的rsP-選擇蛋白(在DPBS中稀釋至2μg/ml)包被96孔板，4℃過夜或37℃，90分鐘。將板倒置并取出殘余的液體。以200μl/孔的DPBS＋1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma#A-7888)阻斷此被包被的板和另外一空白板，室溫1小時。倒置空白板并取出殘液。在稀釋抗體期間使rsP-選擇蛋白包被的板繼續(xù)阻斷，將(在DPBS＋1％BSA中)連續(xù)稀釋了的樣品抗體以50μl/孔加入空白板，這些抗體的初始濃度為100μg/ml。將生物素標(biāo)記的PB1.3(在DPBS＋1％BSA中稀釋至0.3μg/ml)以50μl/孔加入空白板的樣品抗體中，吹吸混合。將rsP-選擇蛋白包被的板用DPBS洗三次。將樣品抗體/生物素標(biāo)記的PB1.3混合物吸入rsP-選擇蛋白包被的板中，50μl/孔，室溫保溫1小時，然后用DPBS洗三次。向板中以50μl/孔加入在DPBS＋1％BSA中稀釋至1∶2000的鏈親和素辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Pierce#21124)，室溫溫育1小時。然后用DPBS洗板三次。將四甲基聯(lián)苯胺過氧化物酶底物/H2O2(TMB，Kirkegaard和PerryLaboratories#50-76-00)以50μl/孔加入板中，經(jīng)適當(dāng)時間(通常3-10分鐘)顯色，以50μl/孔加入1M磷酸以終止反應(yīng)。在TitertekMultiskanMCC/340上讀取450nm處的吸收值。表觀結(jié)合親和力以光密度為450nm處的最大光密度的二分之一時與rsP-選擇蛋白結(jié)合的抗體的濃度來表示。在二分之一最大結(jié)合處的樣品抗體的濃度與對照抗體(未標(biāo)記的PB1.3)的濃度之比用于估計被測抗體對rsP-選擇蛋白的相對結(jié)合親和力。兩個典型競爭結(jié)合實驗的結(jié)果示于圖25和26中。在第一個實驗中，將標(biāo)記的PB1.3的結(jié)合抑制到最大值的50％時所需要的重構(gòu)的IgG1型MAbPB1.3(HALA)(2.0μg/ml)是PB1.3(1.0μg/ml)的兩倍。因此，此人源化抗體能結(jié)合rsP-選擇蛋白的50％和PB1.3。與此相似，在第二個實驗中，PB1.3/(HBLD)(IgG4型)能結(jié)合rsP-選擇蛋白的50％和PB1.3。實施例13用DHFR擴增提高CHO細(xì)胞中的抗體產(chǎn)量將CHO細(xì)胞鋪入培養(yǎng)瓶并在換液前長至?xí)?T-25cm2的瓶中加入8ml或T-75cm2的瓶中加入20ml)。培養(yǎng)48-72小時后收集培養(yǎng)液，并用ELISA測定IgG的產(chǎn)量。用胰酶消化細(xì)胞并計數(shù)。以24小時內(nèi)每百萬細(xì)胞所分泌的抗體的微克數(shù)來表達抗體的產(chǎn)率。將3到6個產(chǎn)量最高的克隆分開擴增，將剩余的7個最好的合并擴增。以1×105細(xì)胞/100mm皿的濃度將細(xì)胞鋪入含選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。在第一輪擴增中，將細(xì)胞鋪入含αMEM(-核苷酸)/10％透析過的FBS并補加了500μg/ml的G418和10，20或50nM氨甲喋呤(Sigma#A0-6770)的三套培養(yǎng)皿中。每四天換液一次。在10-14天時用克隆園筒分離單克隆，擴增，并用ELISA測定IgG的產(chǎn)量。另外幾輪的擴增是針對各單克隆或克隆合并物進行的，氨甲喋呤的濃度為其起始濃度的5-10倍。表5總結(jié)了表達PB1.3的三個人源化模本的CHO細(xì)胞的抗體產(chǎn)量。一個被擴增的表達重構(gòu)的MAbPB1.3(HBLD)(IgG4型)的細(xì)胞克隆選自表達量低于0.2μg/106細(xì)胞/天的克隆合并物，在第一輪中擴增到2.0μg/106細(xì)胞/天，在第三輪后達到33.0μg/106細(xì)胞/天。選擇此克隆進行培養(yǎng)以大規(guī)模生產(chǎn)重構(gòu)的MAbPB1.3。實施例14生物反應(yīng)器的運轉(zhuǎn)將160g膠原蛋白包被的微載體珠(150-200微米，JRHBiosciences#60142-100)在800ml無菌水中水合30分鐘，將水慢慢倒出。將珠子重懸于800ml水中，高壓滅菌30分鐘。冷至室溫后，用無菌的無血清αMEM(-核苷酸)洗兩次，重懸于1升αMEM(-核苷酸)/5％透析過的FBS完全培養(yǎng)基中。以33.0μg/106細(xì)胞/天的速率表達重構(gòu)的MAbPB1.3(HBLD))(IgG4型)的細(xì)胞株CHO-48B4被擴展到36個含αMEM(-核苷酸)/10％透析過的FBS/500nM氨甲喋呤的T-225cm2培養(yǎng)瓶中。當(dāng)細(xì)胞長至?xí)蠒r，用胰酶消化并以5.0-8.0×104細(xì)胞/ml的終濃度重懸于2升完全培養(yǎng)液中(無氨甲喋呤)。通過無菌操作將1升珠子，2升細(xì)胞懸浮物和2升新鮮的完全培養(yǎng)液加入Proteus2000生物反應(yīng)器(Wheaton)的滅過菌的10升容器中。用空氣和5％CO2對上部空間連續(xù)灌氣。為使細(xì)胞吸附到微載體上，對Proteus編程，使之以70rpm攪拌細(xì)胞/微載體懸浮物一分鐘，然后0rpm，59分鐘。48次循環(huán)后，向反應(yīng)器中加入5升培養(yǎng)液。將反應(yīng)器編程，使懸浮物維持在37℃，pH7.0，并以空氣中的氧的30％溶氧，以50rpm連續(xù)攪拌。3天后對反應(yīng)器編程使之以5升/天的速度更換完全培養(yǎng)液，用一重力濾器接在收集口處(以使微載體留在反應(yīng)器內(nèi))，收集的培養(yǎng)液存于4℃，備用。生物反應(yīng)器運轉(zhuǎn)5-7天，直至積累的細(xì)胞碎片使培養(yǎng)液收集物變模糊(起因于通氣破壞)。將培養(yǎng)液收集物通過Millipak-600.45微米的濾器(Millipore)以澄清。將20升過濾后的上清液以0.55升/小時的流速通過一蛋白質(zhì)A瓊脂糖快流柱(2.5×12cm)(Pharmacia)，用1.5升PBS(Biowhittaker，#17-516Y)洗柱。然后用8×40mlpH4.5的0.2M乙酸鈉預(yù)洗脫，用8×40mlpH3.5的0.2M甘氨酸，0.5MNaCl溶液洗脫，二者都洗入裝有10mlpH8.0的2MTris-HCl的管中。將在280nm有最大吸收值的單一組分在pH5.5的20mM乙酸，0.15MNaCl溶液中透析，于4℃貯存。在5-7天中，每天可收集200mg抗體。純化產(chǎn)率約為50％，因此生物反應(yīng)器一次可生產(chǎn)500-700mg純化抗體。實施例15muMAbPB1.3對兔耳重植后由局部缺血再充血引起的損傷的作用用氯胺酮和甲苯噻嗪合劑麻醉一些紐西蘭兔，然后用利多卡因滲透耳朵根部。將左耳部分切除，佘下完整的中央動脈、中央靜脈和一軟骨橋。切斷所有的神經(jīng)以使耳朵完全麻木。然后把耳朵重新貼上，用一小血管鉗夾住動脈以使完全局部缺血。將這些兔子放在維持在23.5℃的房間中，6小時，然后移去小血管鉗，使耳朵再充血。在再充血以前用muMAbPB1.3(2mg/kg)或鹽水或同型(IgG1)的稱為PNB1.6的鼠單克隆抗體(2mg/kg)進行處理。通過排水量連續(xù)7天每天測量耳朵的容積以定量化組織水腫。第七天以總表面積的百分率來估計壞死。再充血后在用鹽水或PNB1.6處理的對照動物中，耳朵容積有明顯增大(圖27)。由于未發(fā)現(xiàn)這兩個對照組有差異所以合并了它們的數(shù)據(jù)。在用MAbPB1.3處理的動物中水腫也增大了，但增大的程度在所測的所有時間點上都明顯低于對照組。在用muMAbPB1.3處理的動物中，第七天所測得的壞死程度也明顯低于對照組(圖28)。因此，隨后又再充血的重植兔耳的局部缺血首先導(dǎo)致了水腫反應(yīng)，然后是廣泛的組織壞死，在用P-選擇蛋白抗體muMAbPB1.3預(yù)處理的動物中這兩種組織損傷現(xiàn)象大體上明顯降低了。實施例16muMAbPB1.3對狗骨骼肌局部缺血再充血后血管開放作用本實驗利用了一個分離的狗股薄肌局部缺血再充血的模型。再充血損傷的一個特點是所謂的“不復(fù)流”現(xiàn)象，即經(jīng)過原來局部缺血組織的微循環(huán)的血流在再充血后未出現(xiàn)或嚴(yán)重減少。如原先所述(Carden等，Circ.Res.661436-1444(1990))，本實驗利用了一個分離出的狗股薄肌肌肉。簡單說來，將成年雜種狗用戊巴比妥鈉麻醉，切開股薄肌上的皮膚，經(jīng)鈍解剖將肌肉與其周圍組織分開，切斷閉孔肌神經(jīng)，向近端臀動脈和臀靜脈中插入插管并捆住其它所有的并行血管，將股動脈插管連到一恒流充血泵上，從股靜脈流出的血排入一再充血儲存器中，經(jīng)由側(cè)枝檢測動脈和靜脈壓，調(diào)整血流將充血壓力維持在100mm汞柱，若關(guān)掉充血泵時動脈充血壓力降至低于20mm汞柱，則可認(rèn)為血管的分離是徹底的。通過在實驗程序結(jié)束時向分離的股薄肌肌肉中灌注對比介質(zhì)(墨汁)以估計微血管的開放。將分離出的狗股薄肌肌肉連續(xù)充血4.5小時，或先局部缺血4小時再充血0.5小時或先局部缺血4小時再在P-選擇蛋白抗體muMAbPB1.3以40μg/ml存在于灌注液中再充血0.5小時。然后用計算機控制的圖象成像定量這些股薄肌肌肉的組織切片中每個肌纖維中含墨水的微血管(直徑＜10μm)的數(shù)目。在對照動物中，局部缺血再充血方法將開放的微血管數(shù)降低至36±3％。當(dāng)muMAbPB1.3被加入到灌注液中時，局部缺血再充血后開放的微血管數(shù)是對照組的119±18％。因此，以開放微血管數(shù)而言，P-選擇蛋白抗體muMAbPB1.3在局部缺血再充血的狗股薄肌肌肉中完全防止了“不復(fù)流”現(xiàn)象的發(fā)生。實施例17muMAbPB1.3對由組織肥大細(xì)胞脫粒誘導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的影響I、方法a)活體體內(nèi)顯微鏡檢術(shù)雄性Wistar鼠(200-250克)購自HarlanSpragueDawley，Indianapolis，在手術(shù)前禁食12-24小時。通過肌肉內(nèi)注射氯胺酮/甲苯噻嗪/乙酰丙嗪進行手術(shù)麻醉。在左頸脈靜脈內(nèi)放入一個導(dǎo)管，并實施胸廓切開術(shù)以便于自發(fā)呼吸。去毛并清洗腹部，沿中線切入腹腔，切口3/4英寸長，注意避免任何出血。將鼠放于專為活體體內(nèi)顯微鏡檢術(shù)而設(shè)計的顯微鏡鏡臺上。將管化好的回腸后環(huán)拉出，將腸系膜覆蓋在加熱到37℃的觀察基座上。整個實驗中，用加熱的碳酸氫鹽緩沖液(37℃，pH7.4)以2ml/分的速度使腸系膜過冷。另外，將若干片小的Saran-Wrap保鮮膜(事先在酒精中浸泡并用鹽水沖洗)放于回腸和觀察區(qū)域周圍的腸系膜區(qū)域上以保持這些區(qū)域濕潤。用配有10x目鏡和20x物鏡(水浸；鏡口率為0.4)的活體顯微鏡(MikronInstruments，SanDiego)觀察微循環(huán)床。包括一個裝于顯微鏡上的圖象攝影機(Hitachi彩色CCD)，一個VCR(SonySVO-9500MD)和一個探測器(SonyTrinitron)的高分辨系統(tǒng)使顯微鏡圖像得以記錄。在每個腸系膜制備物中，按下列標(biāo)準(zhǔn)挑選3個大約長18μm的后毛細(xì)血管微靜脈段用于重復(fù)記錄(1)真正的從直徑為15-30μm的會合毛細(xì)血管接受血液的毛細(xì)血管微靜脈；(2)快捷的血流，從而不能分辨出單個血紅細(xì)胞；(3)白細(xì)胞的某種基底循環(huán)(任何給定時間內(nèi)在血管段中存在的白細(xì)胞少于8個)，但沒有牢固吸附的白細(xì)胞。如果在血管壁停留的時間超過30秒，則將其定義為牢固吸附的白細(xì)胞。b)實驗程序手術(shù)過程完成后的第20分鐘和25分鐘時，作了所選擇的靜脈管內(nèi)基底白細(xì)胞相互作用的一分鐘圖像記錄。第二次基數(shù)記錄前所有處理全部采用靜脈內(nèi)用藥。手術(shù)后30分時，開始向過冷緩沖液中注入化合物48/80(Sigma，目錄號#(4257)，并在實驗的其余部分繼續(xù)注入，使之在腸系膜上的終濃度為10μg/ml，這樣做是為了誘導(dǎo)肥大細(xì)胞脫粒。開始使用48/80化合物后20分鐘和30分鐘時再次進行微靜脈記錄。在實驗結(jié)束時，通過分析錄相帶確定白細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的程度。從記錄序列中0秒，15秒，30秒，45秒和60秒固定的畫面可以確定清晰可見的白細(xì)胞(即與血管壁相互作用的細(xì)胞)的數(shù)量，并由這五個值計算平均數(shù)。這樣，計數(shù)的白細(xì)胞既包括牢固吸附的細(xì)胞也包括循環(huán)的細(xì)胞。c)統(tǒng)計數(shù)字每個實驗組包括5-6個動物，從每個動物身上取2-3個微靜脈。給出了平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。各組平均數(shù)的顯著差異通過變量分析再配以Tukey-KramerHSD試驗得以測試。單個微靜脈在處理前后的差異通過成對t-測驗進行研究。所有測試均使用運行于MacintoshIIsi上的JMP軟件進行，p＜0.05時則認(rèn)為有顯著性。II、結(jié)果對鼠腸系膜局部運用化合物48/80，在使用后3分鐘內(nèi)導(dǎo)致了90％肥大細(xì)胞的可見的脫粒。隨后，可發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞的循環(huán)和吸附有所增加。使用48/48化合物后發(fā)現(xiàn)20分鐘和30分鐘時間點之間白細(xì)胞聚集無明顯差異，因此在統(tǒng)計分析中使用這兩個時間點的平均數(shù)。模型中微靜脈間變異性很大，伴有單個微靜脈中的白細(xì)胞數(shù)目在0-4.8之間變化的基底相互作用和PBS處理組中的白細(xì)胞數(shù)目在2.8-25.6之間變化的肥大細(xì)胞誘導(dǎo)的相互作用(變異性系數(shù)，CV，37％)。動物平均數(shù)顯示的變異性很低(CV，16％)；因此，為了統(tǒng)計將每個單一的微靜脈作為一個單獨的實驗對象進行處理。如圖29所示，與配制的緩沖液對照組相比，用muMAbPB1.3進行靜脈內(nèi)處理抑制了90％的肥大細(xì)胞誘導(dǎo)的血管內(nèi)白細(xì)胞聚集。無反應(yīng)活性的抗體P6H6在本模型中不起作用。因此，用P-選擇蛋白抗體muMAbPB1.3對鼠用藥完全阻止了白細(xì)胞與血管內(nèi)皮的相互作用及白細(xì)胞隨后向被肥大細(xì)胞脫粒試劑48/80誘導(dǎo)的組織的遷移。實施例18muMAbPB1.3抗原決定簇的定位P-選擇蛋白是在血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的分泌顆粒中發(fā)現(xiàn)的一種完整的膜糖蛋白。細(xì)胞激活后，P-選擇蛋白迅速重新分布于原生質(zhì)膜。成熟的分子是擁有多個區(qū)域的蛋白質(zhì)，這些區(qū)域包括一個“凝集素”區(qū)，EGF區(qū)域，九個串聯(lián)的相同的“C3b-C4b調(diào)節(jié)蛋白”(CRP)重復(fù)區(qū)，一個跨膜區(qū)域和一個細(xì)胞質(zhì)區(qū)域。見Johnston等，Cell，561033-1044(1989)(在此以其全文作為本申請的參考資料)關(guān)于P-選擇蛋白的描述。圖30顯示了P-選擇蛋白各區(qū)域的一個推測的折疊模式。P-選擇蛋白缺失分析為了定位被muMAbPB1.3結(jié)合的抗原突變的P-選擇蛋白基因的SalI-HpaI部分被克隆到表達載體pcDNAI的XhoI和XbaI位點(Invitrogen)。將這些pcDNA克隆轉(zhuǎn)入E.coliMC1061菌株(Invitrogen)并純化質(zhì)粒DNA以轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法本方法述于Kriegler，M.的GeneTransferandExpressionALaboratoryManual，W.H.FreemanandCompany(1990)，以1×106細(xì)胞/100mm培養(yǎng)皿將COS細(xì)胞植入裝有DMEM(Biowhittaker)和10％胎牛血(FBS)的培養(yǎng)皿中。第二天，將質(zhì)粒DNA用乙醇沉淀，并以20μg/ml的濃度重懸于無菌TE(10mMTris，pH8.0，1mMEDTA)，將150μlDNA與300μl無菌TBS(Tris緩沖的鹽溶液，140mMNaCl，5mMKCl，1.4mMNa2PHO4，25mMTris-base，pH7.5，1.0mMCaCl2和0.5mMMgCl2)及30μl無菌DEAE葡聚糖(Sigma，#D-9885，TBS中1mg/ml)混合。向生長培養(yǎng)液通氣，將細(xì)胞單層用PBS和TBS各洗一次。將750μlDNA/DEAE葡聚糖/TBS混合物加入單層中。將培養(yǎng)皿在環(huán)境溫度下置于分層通風(fēng)櫥中，每五分鐘搖動一次共1小時。培養(yǎng)1小時后，向DNA溶液通氣，并將細(xì)胞先用TBS再用PBS各洗一次。使細(xì)胞在一決定簇，通過缺失連續(xù)的CRP區(qū)域(圖31)構(gòu)建了重組P-選擇蛋白的突變體。這種定點誘變是使用對每一CRP區(qū)域特異的引物通過PCR擴增實現(xiàn)的。用于PCR突變的模板是一個被截短并在DNA序列2354位突變的P-選擇蛋白的pUCDNA克隆。(序列位置與上述Johnston等發(fā)表的P-選擇蛋白序列一致)。最早通過體外誘變獲得的這一模板質(zhì)粒PG△1，T缺少P-選擇蛋白的跨膜區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)羧基端，且轉(zhuǎn)而編碼SV40大T抗原的羧基端11氨基酸殘基。此SV40衍生的C末端可被單克隆抗體KT-3識別(見MacArthur等，JournalofVirology52483-491(1984))。PCR擴增后，將此缺失的DNA分子純化、連接、轉(zhuǎn)化細(xì)菌，并按下述進行克隆和測序。將帶有CRP與T-抗原tag序列適當(dāng)連接的DNA亞克隆到pCDNA1表達載體上(Invitrogen)，并轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。在質(zhì)粒pGMP△1，T上完成PCR誘變。5’端磷酸化后，將表6中的引物以1μM的濃度與T抗原序列引物lys-1一起加到每個PCR反應(yīng)中。在PerkinElemer-Cetue機器中95℃、50秒，50℃、1分鐘，73℃、4分鐘循環(huán)30次來完成PCR反應(yīng)，根據(jù)制造者建議的條件使用Pfr多聚酶(Stratagen)。用瓊脂糖凝膠電泳純化及用Qiaex(QiagenCorp.)洗脫后，突變的pUCDNA被連接并轉(zhuǎn)化E.coliInvF’α細(xì)胞(Invitrogen)。通過DNA序列分析確認(rèn)帶有期望突變的克隆的DNA，含個補加了100μM氯喹(Sigma，#C-6628)的完全培養(yǎng)液中于37℃，5％CO2培養(yǎng)。4小時后，將此培養(yǎng)液用完全培養(yǎng)液取代。37℃，5％CO2培養(yǎng)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時后，用不含血清的DMEM生長培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。24小時后收集培養(yǎng)液，在臺式醫(yī)用離心機中1500rpm離心5分鐘除去細(xì)胞碎片。用捕獲ELISA分析被分泌的P-選擇蛋白的突變蛋白質(zhì)將96孔Costar滴定板用KT-3抗體(在腹水中產(chǎn)生并經(jīng)蛋白質(zhì)G瓊脂糖純化，Pharmacia)以40μg/ml的濃度100μl/孔4℃過夜包被。將滴定板用DPBS洗三次，用250μl/孔DPBS＋1％BSA室溫阻斷1小時。滴定板用DPBS洗三次。以100μl/孔加入COS細(xì)胞上清液，室溫保溫2小時。用DPBS洗滌滴定板三次后，通過加入100μl/孔的(a)1ng/ml兔抗P-選擇蛋白多克隆Ig，或(b)生物素標(biāo)記的muMAbPB1.3，或(c)在DPBS/1％BSA中稀釋的生物素標(biāo)記的P6H6，室溫1小時，以檢測結(jié)合的P-選擇蛋白。用DPBS洗滌滴定板3次后，用100μl/孔1∶1000稀釋度的HRP偶聯(lián)的山羊抗免抗體(Biorad)檢測抗體，并用來自KT-3細(xì)胞系的組織培養(yǎng)液(10％)在DPBS＋1％BSA中室溫阻斷30分鐘。生物素標(biāo)記的抗體用100μl/孔1∶1000稀釋度的HRP-鏈親和素(Pierce)室溫下30分鐘來檢測。被結(jié)合的HRP與TMB一起保溫并用1M磷酸終止。圖32顯示所得信號低于來自模擬物轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的上清的背景。此“模擬”柱指來自一全長P-選擇蛋白轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的上清液，其不含SV40T-抗原tag，因此KT-3捕獲ELISA未能檢測到它。X軸指由不同突變的P-選擇蛋白cDNA表達的CRP量，從第2個柱的9個CRP第10個柱的1個CRP。結(jié)果表明，盡管缺少羧基末端的5個CRP的P-選擇蛋白突變體通過多克隆大鼠Ig可檢測到，但這些分子并不與PB1.3反應(yīng)。這表明PB1.3的結(jié)合位點位于第五個CRP重復(fù)區(qū)域內(nèi)。為了證實抗原決定簇定位的結(jié)果，缺失分析擴展到僅缺失第五個CRP區(qū)域，而使P-選擇蛋白的羧基端序列保持完整(見圖30)。設(shè)計用與上述相同的方法設(shè)計PCR擴增引物的除去P-選擇蛋白的編碼407-466氨基酸(表6)的區(qū)域。用抗體muMAbPB1.3和P6H6直接通過ELISA分析細(xì)胞上清液(圖33)。雖然muMAbPB1.3可結(jié)合完整的P-選擇蛋白，但它未能結(jié)合缺失的分子。而P6H6可同樣地結(jié)合這兩種分子。合成多肽分析通過合成跨越P-選擇蛋白第五個CRP的62個氨基酸區(qū)域(圖34)的多肽及用ELISA實驗為muMAbPB1.3的結(jié)合進行篩選進一步闡明了muMAbPB1.3的抗原決定簇。根據(jù)Johnston等的命名法，第五個CRP從氨基酸序列407位延伸到468位。多肽序列為968.01，氨基酸#408-426；968.02，氨基酸#418-436；968.04.氨基酸#408-433；968.05為968.04的氧化模本；968.06，氨基酸#428-447；和968.08，氨基酸#448-467。將每個多肽溶于二甲亞砜(DMSO)中至2mg/ml，用1微克/100μlPBS的稀釋液將其包被于96孔微量滴定板上，37℃過夜干燥。用PBS洗滌被包被的孔，并用250μl/孔的PBS/1％BSA溶液室溫阻斷30分鐘。將孔用PBS洗滌，并以100μl/孔與用PBS1％BSA稀釋至1微克/ml的PB1.3室溫保溫1小時。結(jié)合的muMAbPB1.3用HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠抗體試劑和前述的TMB底物檢測。圖34顯示了PB1.3與多肽反應(yīng)活性的比較。羧基端多肽#968.08可與PB1.3劇烈反應(yīng)。因此，由PB1.3識別的抗原決定簇定位于人P-選擇蛋白第五個CRP的448位到467位氨基酸之間。為清晰和便于理解起見，通過上述實施例和上述公開詳細(xì)描述了本發(fā)明。然而，顯然可以在后附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)進行某些變動和修改。上面引用的所有出版物和專利申請在此均以其全文作為本申請的參考資料，如同每個都被分別引述一樣。表1(8-1)用于設(shè)計重構(gòu)的人PB1.3重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的對比<>表1(8-2)表1(8-3<p>表1(8-4)表1(8-5)表1(8-7)表1(8-8)表2(7-1)用于設(shè)計重構(gòu)的人PB1.3輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的對比<p>表2(7-2)<p>表2(7-3)<<p>表2(7-4)</tables>表2>表2(7-7)表2(7-6)<<p>表3三個重構(gòu)的PB1.3模本的重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列的差異構(gòu)建物氨基酸1273<<p>表4四個重構(gòu)的PB1.3模本的輕鏈可變區(qū)域的氨基酸序列的差異構(gòu)建物氨基酸6070表5生產(chǎn)人源化PB1.3(CY1748)的三個不同模本的擴增的CHGO細(xì)胞株的抗體產(chǎn)率(微克/106細(xì)胞/天)抗體未擴增第1輪第3輪第2輪1748A-IgG10.362.18.229.60.362.113.721.80.360.909.919.71748B-IgG10.101.623.90.241.521.1＜0.27.318.60.101.617.81748B-IgG4＜0.3＜2.0＜0.3＜2.026.90.752.623.2＜0.33.020.80.806.520.8＜0.3＜2.019.40.782.518.60.788.817.8表6用于產(chǎn)生人P-選擇蛋白CRP缺失突變體的PCR擴增引物的DNA序列權(quán)利要求1.一種阻斷性P-選擇蛋白抗體，其在以競爭抑制試驗測量時可競爭性地抑制由ATCC保藏號為HB11041的細(xì)胞株分泌的抗體與P-選擇蛋白的結(jié)合。2.如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體，在鈣離子不存在時可抑制嗜中性白細(xì)胞與P-選擇蛋白的結(jié)合。3.如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體，在多肽CQNRYTDLVAIQNKNE存在時可抑制嗜中性白細(xì)胞與P-選擇蛋白的結(jié)合。4.如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體，其為一IgG免疫球蛋白。5.如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體，其為一鼠抗體。6.如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體，其是由ATCC保藏號為HB11041的細(xì)胞株產(chǎn)生的。7.如權(quán)利要求1所述的抗體，其為Fab、Fab’F(ab’)2，F(xiàn)abc或Fv片段。8.一種檢測P-選擇蛋白的方法，該方法包括給予病人或其組織樣品如權(quán)利要求1所述的抗體；以及檢測該抗體與待檢樣品中的P-選擇蛋白特異結(jié)合所形成的復(fù)合體。9.一種治療免疫系統(tǒng)疾病的方法，該方法包括給予患此疾病的病人藥物學(xué)上有效劑量的包含一藥學(xué)上可接受的載體和如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體的藥物組合物。10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中阻斷性P-選擇蛋白抗體是IgG1。11.如權(quán)利要求9所述的方法，其中阻斷性P-選擇蛋白抗體是鼠抗體。12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中阻斷性P-選擇蛋白抗體是由ATCC保藏號為HB11041的細(xì)胞株所產(chǎn)生。13.如權(quán)利要求9所述的方法，其中的疾病是急性肺損傷的結(jié)果。14.如權(quán)利要求9所述的方法，其中的疾病是局部缺血-再充血損傷。15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中阻斷性P-選擇蛋白抗體經(jīng)靜脈內(nèi)用藥。16.一種治療免疫系統(tǒng)病情的方法，該方法包括給予有此病情的病人藥物學(xué)上有效劑量的包含一藥學(xué)上可接受的載體和如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體的藥物組合物。17.一種抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞或血小板吸附的方法，該方法包括運用藥物學(xué)上有效劑量的包含如權(quán)利要求1所述的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。18.一種藥物組合物，包括一藥學(xué)上可接受的載體和如權(quán)利要求1所述的阻斷性P-選擇蛋白抗體。19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其中的阻斷性P-選擇蛋白抗體由ATCC保藏號為HB11041的細(xì)胞株所分泌。20.如權(quán)利要求19所述的藥物組合物，其中的抗體是鼠抗體。21.一包含ATCC保藏號為HB11041的細(xì)胞株的組合物。22.一種包含人源化重鏈和人源化輕鏈的人源化免疫球蛋白(1)所述的人源化輕鏈包含三個具有來自鼠PB1.3免疫球蛋白輕鏈的相應(yīng)互補決定區(qū)的氨基酸序列的互補決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)，和來自人kappa輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架；以及(2)所述的人源化重鏈包含三個具有來自鼠PB1.3免疫球蛋白重鏈的相應(yīng)互補決定區(qū)的氨基酸序列的互補決定區(qū)(CDR1、CDR2和CDR3)，和來自人重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的可變區(qū)構(gòu)架；其中所述的人源化免疫球蛋白以下限約為107M-1和上限約是鼠PB1.3免疫球蛋白結(jié)合親和力的5倍的結(jié)合親和力特異性地與P-選擇蛋白結(jié)合。23.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中人kappa輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列在選自由L21、L46、L60和L70組成的第一組中的至少一個位置上被鼠PB1.3免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的等價位置上的氨基酸取代；以及人重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列在選自由H1、H2、H71和H73組成的第二組中的至少一個位置上被鼠PB1.3重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列的等價位置上的氨基酸取代。24.如權(quán)利要求23所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化重鏈可變區(qū)構(gòu)架是一個21/28’CL重鏈可變區(qū)構(gòu)架序列。25.如權(quán)利要求24所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化輕鏈可變區(qū)構(gòu)架是一DEN輕鏈可變區(qū)構(gòu)架序列。26.如權(quán)利要求25所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化輕鏈可變區(qū)構(gòu)架至少在第一組的兩個位置上被取代。27.如權(quán)利要求26所述的人源化免疫球蛋白，其中人源化重鏈可變區(qū)構(gòu)架至少在第二組的兩個位置上被取代。28.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化輕鏈包含圖14所示的1748RLA成熟輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。29.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化輕鏈包含圖15所示的1748RLB成熟輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。30.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化輕鏈包含圖16所示的1748RLC成熟輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。31.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化輕鏈包含圖17所示的1748RLD成熟輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。32.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化重鏈包含圖11所示的1748RHA成熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。33.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化重鏈包含圖12所示的1748RHB成熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。34.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化重鏈包含圖13所示的1748RHC成熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。35.如權(quán)利要求31所述的人源化免疫球蛋白，其中所述的人源化重鏈包含圖12所示的1748RHB成熟重鏈可變區(qū)氨基酸序列(序列號為__)。36.如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白，其為Fab，F(xiàn)ab’F(ab’)2、Fabc或Fv片段。37.如權(quán)利要求35所述的人源化免疫球蛋白，進一步包含一恒定區(qū)域。38.如權(quán)利要求37所述的人源化免疫球蛋白，其中的恒定區(qū)域具有效應(yīng)子功能。39.如權(quán)利要求35所述的人源化免疫球蛋白，其中的恒定區(qū)域沒有效應(yīng)子功能。40.如權(quán)利要求38所述的人源化免疫球蛋白，其中的效應(yīng)子功能是能夠進行補體結(jié)合或有抗體依賴的細(xì)胞毒性。41.編碼如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白重鏈的核酸。42.編碼如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白輕鏈的核酸。43.編程在監(jiān)視器或打印機上顯示如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白的三維構(gòu)型的計算機。44.一種包含如權(quán)利要求35所述的人源化抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。45.一種包含如權(quán)利要求22所述的人源化免疫球蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。46.如權(quán)利要求45所述的藥物組合物，其中所述的人源化免疫球蛋白是Fab片段。47.一種檢測P-選擇蛋白的方法，該方法包括將如權(quán)利要求35所述的人源化免疫球蛋白給予病人或其組織樣品；以及檢測由該免疫球蛋白和待測樣品中的P-選擇蛋白特異結(jié)合形成的復(fù)合體。48.一種抑制白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞或血小板吸附的方法，該方法包括給予藥物學(xué)上有效劑量的如權(quán)利要求45所述的藥物組合物。49.一種治療患免疫系統(tǒng)疾病的病人的方法，該方法包括給予患此病的病人藥物學(xué)上有效劑量的如權(quán)利要求45所述的藥物組合物。50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中的疾病是急性肺損傷的結(jié)果。51.如權(quán)利要求49所述的方法，其中的疾病是局部缺血-再充血損傷。52.如權(quán)利要求51所述的方法，其中的病人患有表皮、心肌、腎、大腦、脾、肝、脊髓、內(nèi)臟、肺、部分身體或全身性的局部缺血。53.一種治療處于免疫系統(tǒng)病態(tài)的疾人的方法，該方法包括給予患此癥狀的病人藥物學(xué)上有效劑量的如權(quán)利要求45所述的藥物組合物。54.一種穩(wěn)定細(xì)胞株，包含編碼如權(quán)利要求35所述的人源化免疫球蛋白重鏈的核酸片段，所述的片段可通過操作與一啟動子相連以表達該重鏈；編碼如權(quán)利要求35所述的人源化免疫球蛋白輕鏈的另一核酸片段，所述的片段可通過操作與另一啟動子相連以表達該輕鏈；其中的穩(wěn)定細(xì)胞株能產(chǎn)生如權(quán)利要求35所述的人源化免疫球蛋白。55.如權(quán)利要求54所述的細(xì)胞株，其能產(chǎn)生約30μg人源化免疫球蛋白/106細(xì)胞/天。56.如權(quán)利要求55所述的細(xì)胞株，記為CHO-48B4，ATCC保藏號為__。57.具有多達100個氨基酸的純化的P-選擇蛋白多肽，該多達100個的氨基酸包括圖34所示的氨基酸序列(序列號為__)的448位到467位間的至少5個連續(xù)的氨基酸。58.如權(quán)利要求57所述的純化多肽，其中多達100個的氨基酸包括圖34所示的氨基酸序列(序列號為__)的448位到467位間的連續(xù)氨基酸片段。59.如權(quán)利要求58所述的純化多肽，其主要由圖34所示的氨基酸序列(序列號為__)的448位到467位間的氨基酸的連續(xù)片段組成。全文摘要本發(fā)明涉及利用抑制白細(xì)胞對激活的血小板和/或?qū)せ畹难軆?nèi)皮進行吸附的新型阻斷性P-選擇蛋白抗體在體內(nèi)治療發(fā)炎和其它病理狀況的藥物組合物和方法。同時提供了人抗體和鼠抗體。文檔編號C12P21/00GK1124928SQ94192352公開日1996年6月19日申請日期1994年5月4日優(yōu)先權(quán)日1993年5月4日發(fā)明者羅伯特·W·切斯納特,瑪格麗特·J·波利,S·塔蘭·瓊斯,喬斯·W·薩爾丹那,瑪麗·M·斑迪格,邁克爾·克賴格勒爾,卡爾·佩里茨,羅伯特·拜爾,邁克爾·努恩,詹姆斯·C·波爾森申請人:賽特爾公司