專利名稱：抗α6整合蛋白抗體的制作方法
侵入的癌細胞在血管內(nèi)皮上的粘連，是轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵性的第一步，也是具有選擇性的一步。在過去的幾年中，已發(fā)現(xiàn)大量的不同粘連分子參與造血細胞的細胞遷移和返巢機理。轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞能以某種不受控制的方式明顯誤用這種機理，從而導致在不同于其原來所在組織的組織中發(fā)生轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明的單克隆抗體具有抑制轉(zhuǎn)移的特異能力，在這一基礎(chǔ)上現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，另一種稱為α6整合蛋白(integrin)的分子(綜述見Hemler，Annu.Rev.Immunol.8∶365-400，1990)，即這些單克隆抗體所識別的抗原，也可被認為是參與轉(zhuǎn)移過程的內(nèi)皮粘連分子，而且可能是最重要的內(nèi)皮粘連分子。
文獻中已描述了針對α6整合蛋白鏈的三種其他抗體，它們的生產(chǎn)方法完全不同。抗體GoH3是通過用血小板免疫大鼠而產(chǎn)生的。選擇這種抗體是因為它識別血小板蛋白復合物Ⅰc-Ⅱa，該復合物后來被定義為α6/β1整合蛋白(Sonnenberg等，J.Biol.Chem.26210376-10383，1987;Hemler等，J.Biol.Chem.2637660-7665，1988)。抗體135-13C是在大鼠體內(nèi)針對純化的腫瘤聯(lián)結(jié)蛋白TSP-180制備的，該抗體現(xiàn)在被稱作α6/β4整合蛋白(Kennel等，Cancer Res.413465-3470，1981;Kennel等，J.Biol.Chem.26415515-15521，1989)。最后，抗體GB36是在小鼠體內(nèi)針對人胎盤微絨毛制備物而生產(chǎn)的。該抗體識別人癌細胞上的細胞表面蛋白(Hsi等，Placenta 8209-217，1987)?，F(xiàn)已有人提出，所識別的蛋白(α6/β1整合蛋白)可能對維持細胞極性有作用，但尚未進行功能測定。
癌、黑素瘤和內(nèi)皮細胞能夠與細胞外基質(zhì)分子昆布氨酸粘連。包括α1/β1和α2/β1和α6/β1在內(nèi)的幾種整合蛋白復合物，參與介導這種結(jié)合作用。其中的一種整合蛋白即α6/β1，似乎能與昆布氨酸發(fā)生單特異性反應(yīng)，而抗體GoH3則能阻斷細胞-昆布氨酸相互作用，該抗體將α6整合蛋白確定為由彈性蛋白酶消化產(chǎn)物得到的E8片段的受體(Sonnenberg等，1990)?？贵w135-13C也對細胞與昆布氨酸的結(jié)合有影響，但程度較低。
本發(fā)明的抗體不干擾細胞與昆布氨酸的結(jié)合，但卻阻斷黑素瘤細胞與血管內(nèi)皮細胞的細胞間相互作用。這一發(fā)現(xiàn)強烈提示，本發(fā)明的抗體識別α6整合蛋白鏈上的一個迄今為止尚屬未知的結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域明顯不同于GoH3、135-13C或GB36的結(jié)合位點。這可由如下事實進一步證實，即，GoH3與綿羊的皮膚返巢淋巴細胞發(fā)生交叉反應(yīng)，而本發(fā)明的抗體則不然。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種單克隆抗體或其功能衍生物，尤其是Fab片段，其特征在于它能與哺乳動物(例如小鼠，優(yōu)選人)的α6整合蛋白結(jié)合(抗α6整合蛋白單克隆抗體)，該抗體抑制轉(zhuǎn)化細胞的轉(zhuǎn)移，尤其是通過抑制轉(zhuǎn)化細胞與血管內(nèi)皮的相互作用。一般來說，這類轉(zhuǎn)化細胞一方面是以帶有α6整合蛋白作為表面分子為特征的細胞，例如黑素瘤、癌、T細胞淋巴瘤或肉瘤，優(yōu)選黑素瘤和癌，尤其是黑素瘤;另一方面是帶有迄今未確定的α6整合蛋白配體作為表面分子的細胞。
本發(fā)明的另一個目的是，提供分泌上述單克隆抗體的雜交瘤細胞系，以及由這些細胞系分泌的單克隆抗體。按本發(fā)明所述獲得的雜交瘤細胞系“F3C34”已保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)。本發(fā)明的另一個目的是提供上述單克隆抗體或其片段作為治療劑，尤其是用于通過抑制轉(zhuǎn)移而治療癌癥。
與α6整合蛋白結(jié)合的抗體可以用某些短肽作起始抗原來制備，這些短肽的氨基酸順序是由人α6整合蛋白的已知氨基酸順序衍生的(Hogervorst等，Eurp.J.Biochem.199425-433，1991)。這些肽可以用肽和蛋白質(zhì)化學合成領(lǐng)域內(nèi)已知的方法來制備，例如用如Gross和Meyenhofer("The Peptide"，Vols.1-9，Academic Press，Inc.，Harcourt Brace Jovanovich，Publs.，San Diego，1979-1987)或Fields和Nobel(Int.J.Pept.Prot.Res.35161-214，1990)所述的部分或完全液相或固相合成法。
然而，以這樣一種方式制備的抗體并不一定與天然α6整合蛋白反應(yīng)，也不一定具有本發(fā)明抗體的特定性質(zhì)。所以，本發(fā)明的抗體可以由α6整合蛋白陽性細胞起始來制備，例如內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞來源的轉(zhuǎn)化細胞，其中特別優(yōu)選的是一種eEnd2細胞系。
給非人類哺乳動物如小鼠、家兔、大鼠或綿羊注射上述抗原，就能用本領(lǐng)域已知的方法從血清中得到多克隆抗體?？梢杂靡韵路椒ㄖ苽鋯慰寺】贵w由上述免疫動物回收抗體生成細胞，并以常規(guī)方式使得到的所述細胞永久化，例如與骨髓瘤細胞(如PAI小鼠骨髓瘤細胞、SP2/0細胞或SP2/0-Ag14細胞(ATCC CRL1581;ATCC CRL8287))融合(關(guān)于抗體生產(chǎn)方法的一般性指導，參見例如冷泉港實驗室的Harlow，E.和Lane，D.所編的《抗體-實驗室手冊》一書，冷泉港實驗室出版社，1988)，或者如實施例Ⅰ所詳述的那樣制備單克隆抗體。
接著，必須用某種測定法篩選出分泌本發(fā)明抗體的雜交瘤培養(yǎng)上清液，這種測定法測定的是本發(fā)明抗體的轉(zhuǎn)移抑制性質(zhì)，例如如實施例Ⅰ所詳述的測定法。所以，本發(fā)明的又一個目的是，提供一種按本領(lǐng)域已知方法制備抗α6整合蛋白單克隆抗體及其片段的方法以及用這樣一種方法制得的化合物，所述方法中，借助所述上清液中所含的抗體抑制轉(zhuǎn)移的能力對所得的雜交瘤上清液進行篩選。
可以用常規(guī)色譜法從雜交瘤上清液中純化出抗α6整合蛋白單克隆抗體，例如象離子交換色譜、G蛋白親和色譜、與固相載體結(jié)合的抗免疫球蛋白抗體或抗原或其一部分、HPLC等。
為了按本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)大量的抗α6整合蛋白單克隆抗體，可以給小鼠腹膜內(nèi)注射分泌所需抗體的雜交瘤，小鼠在注射前已預先用(例如)樸日斯烷處理。這種腹水瘤在一只小鼠體內(nèi)最多可產(chǎn)生100mg左右的單克隆抗體?？梢杂蒙鲜龇椒◤母顾鏊a(chǎn)生的腹水中純化出抗體。
本發(fā)明的抗體可以用已知方法按其亞型來鑒定，例如用烏赫特朗尼氏免疫擴散法。雜交瘤細胞系“F3C34”所分泌的抗體為IgG2a亞型。另外，本發(fā)明的抗體可以借助它們抑制轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)移，尤其是抑制轉(zhuǎn)化細胞與血管內(nèi)皮相互作用的能力得到鑒定。這種活性可用本領(lǐng)域已知的測定法來測定，例如，在體外用實施例Ⅰ所述的測定法，或者在體內(nèi)用實施例Ⅱ所述的測定法，在這些測定法中，可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細胞和本發(fā)明抗體能夠與之結(jié)合的適宜組織材料(體外測定的情況)，以及轉(zhuǎn)化細胞系在其體內(nèi)誘發(fā)轉(zhuǎn)移且本發(fā)明抗體能與其交叉反應(yīng)的動物的類型，使用任何帶有α6整合蛋白作為表面分子的轉(zhuǎn)化細胞系，例如黑素瘤，如B16細胞(Vollmers等，Cell 40547-557，1985);癌，如KLN205(ATCC CRL1453)或CMT-93(ATCC CCL223)或MM45T(ATCC CRL6420);T細胞淋巴瘤，如BW5147(ATCC TIB48);或者肉瘤，如MM46T(ATCC CRL6420);這種轉(zhuǎn)化細胞系與血管內(nèi)皮相互作用的抑制，可以用本領(lǐng)域已知的測定法來測定，例如在單層內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮來源的細胞上進行體外粘連測定，或者如實施例Ⅰ所述和圖2所示進行測定，圖2中，箭頭清楚地指向與血管內(nèi)皮結(jié)合的轉(zhuǎn)化細胞的位置。最后，本發(fā)明的抗體可以通過在如實施例Ⅴ所述的測定中阻斷細胞遷移來鑒定，或者通過在如實施例Ⅵ所述的測定中不影響細胞生長來鑒定。
另外，正如在人內(nèi)皮細胞頂表面上檢測α6整合蛋白所證實的，本發(fā)明的抗體能與人α6整合蛋白交叉反應(yīng)(參見例如實施例Ⅲ)，這種檢測與小鼠α6整合蛋白在小鼠血管內(nèi)皮頂表面上的體內(nèi)染色相關(guān)(參見實施例Ⅳ)。
抗α6整合蛋白單克隆抗體可以象本領(lǐng)域所已知的那樣進行修飾以供各種不同用途，也可以如實施例Ⅱ所述制得這些抗體的仍具有抗原結(jié)合作用的片段(Harlow和Lane，同上)。例如，可以用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等對抗體進行酶解而制得片段。此外，本發(fā)明的抗體可以象本領(lǐng)域所已知的那樣，如美國專利4，179，337所述加入聚乙二醇亞單位進行修飾，也可以使抗體與熒光染料、生色物質(zhì)如酶(酶聯(lián)免疫吸附測定，ELISA)、或放射性物質(zhì)(放射免疫測定，RIA)偶聯(lián)，偶聯(lián)方法是本領(lǐng)域公知的，并象本領(lǐng)域所已知的那樣用于這些測定體系。另外，這些抗體可以按照本領(lǐng)域已知的方法進行“人化”，例如國際專利申請公開WO 90/7861中所公開的用于特異于人白細胞介素2受體亞基的抗體的方法，因此，上述的功能衍生物也是本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的單克隆抗體也可以作為治療劑使用，尤其是用于治療癌癥，例如通過抑制轉(zhuǎn)移治療癌癥，在手術(shù)過程中發(fā)生繼發(fā)性轉(zhuǎn)移的情況下尤其如此。
如果需要，這些抗體可以和其他藥物活性物質(zhì)配伍而與常用的可藥用固體或液體載體物質(zhì)混合使用，其他藥物活性物質(zhì)優(yōu)選單克隆抗體或肽，它們針對不同的粘連分子，這些粘連分子都應(yīng)存在于血管內(nèi)皮或轉(zhuǎn)移細胞上。劑量和單位劑量可以類似于目前用于各種疾病臨床治療的抗體的劑量和單位劑量加以選擇。
因此，本發(fā)明的又一個目的是提供可臨床使用的抗α6整合蛋白單克隆抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種藥物組合物，該組合物含有一種或更多種抗α6整合蛋白單克隆抗體或其片段，需要時與其他藥物活性物質(zhì)和/或治療上可配伍的無毒惰性載體物質(zhì)配伍。這些藥物組合物可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的方法來制備。
另外，本發(fā)明的單克隆抗體可以用作疾病尤其是癌癥的診斷標記。本領(lǐng)域公知，就這類目的而言，可以使單克隆抗體與熒光染料、生色物質(zhì)如酶(酶聯(lián)免疫吸附測定，ELISA)、或放射性物質(zhì)(放射免疫測定，RIA)偶聯(lián)，偶聯(lián)方法是本領(lǐng)域公知的，并象本領(lǐng)域所已知的那樣用于這類測定體系，如Harlow和Lane(同上)所述。
下列實施例說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實施例Ⅰ抗α6整合蛋白單克隆抗體的制備從150cm2培養(yǎng)瓶中取匯合內(nèi)皮細胞(eEnd2細胞系)，以10，000拉德進行照射，并用細胞刮刀(Costar Data Packaging)收集細胞。然后將這些細胞用Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)(Gibco BRL)洗滌，按1∶1與完全弗氏佐劑混合，使終體積達300μl，用此懸浮液給2月齡PVG大鼠(BRL，F(xiàn)üllinsdorf，CH)后足的背面進行皮下注射。7天和14天后重復只用細胞的DPBS懸浮液進行的注射。第17天從大鼠體內(nèi)剖出引流腘淋巴結(jié)。將該組織用下列酶貯液酶解150mg/ml Ⅸ型蛋白酶(P-6141;Sigma Chemical Co.，Buchs，CH);8mg/ml膠原酶CLS4(Worthington Biochemical Corp.，F(xiàn)reehold，NJ，USA);10mg/ml DNA酶Ⅰ(Sigma Chemical Co.)?；旌厦溉芤菏菇K體積為2ml(0.5ml膠原酶、0.1ml蛋白酶、0.1ml DNA酶、1.3ml IMDM(Iscoves改良型MEM;Gibco BRL，Gaithersburg，MD，USA))。用25號針頭做兩個小橫切口，打開一個淋巴結(jié)。然后將基質(zhì)于37℃下消化兩次，每次用1ml酶混合液消化30分鐘。然后用巴氏吸管將細胞小心地釋放到IMDM中，在50ml IMDM中洗滌，然后計數(shù)。然后如Harlow和Lane(1988)所述，將1份淋巴結(jié)細胞與5份小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞(ATCC CRL1581)混合，離心，用PEG 4000(E.Merck，Darmstadt，F(xiàn)RG)進行融合。然后將細胞(100μl，在IMDM選擇培養(yǎng)基中)以5×104個細胞/孔的密度涂布在微量滴定板(96孔，Costar Data Packaging)中的條件培養(yǎng)基中，選擇培養(yǎng)基中含有HAT(Gibco BRL)、10%胎牛血清(FCS，Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，F(xiàn)RG)、50μMβ-巰基乙醇、青霉素/鏈霉素、谷氨酰胺。條件培養(yǎng)基是在融合前在選擇培養(yǎng)基中將104個PVG大鼠胸腺細胞(100μl/孔)培養(yǎng)3天而制得的。
根據(jù)是否阻斷B16/129黑素瘤細胞與小鼠肺或肝組織冷凍切片的結(jié)合，篩選出含轉(zhuǎn)移抑制性單克隆抗體的雜交瘤上清液。
在新制備的成年小鼠組織冷凍切片上進行原位結(jié)合(Woodruff等，Annu.Rev.Immunol.5∶201-222，1987)。將器官包埋并冷凍在Tissue-Tek，O.C.T.Compound(Miles Inc.，Elkhart，IN，USA)中，切成5μm厚，并封固在玻璃載片上。用PapPen(SCI Science Services，Munich，F(xiàn)RG)畫下切片的輪廓，然后立即把切片放入含1%牛血清清蛋白(BSA)的DPBS中至少10分鐘。將載片上用PapPen標出的區(qū)域附近干燥，然后在組織切片上加105個懸浮在200μlDPBS中的B16黑素瘤細胞，該DPBS中含有20%如上所述制備的雜交瘤培養(yǎng)上清液或一種對照抗體(大鼠IgG，得自Jackson Immuno Research Lab)。使結(jié)合反應(yīng)在50rpm的小型搖床(Kuhner，Basel，CH)上于8℃下進行40分鐘。然后把載片垂直放入含0.5%戊二醛和2%甲醛的DPBS中，從而使未結(jié)合的細胞脫落。在室溫下固定20分鐘并在含20%乙醇的0.25%乙酸硫堇中復染后，用ZeissAxiophot光學顯微鏡計數(shù)與所研究的組織切片結(jié)合的B16細胞。

圖1給出了肺和肝組織切片以及按與上述肺和肝同樣的方式制備的其他組織切片(腎、胸腺、脾和心臟)的結(jié)果，其中左欄給出的是在沒有抗α6整合蛋白單克隆抗體的條件下與所示組織結(jié)合的B16細胞的平均數(shù)，右欄給出的是在含有抗α6整合蛋白單克隆抗體的雜交瘤上清液存在下的平均數(shù)。圖2顯示了與對照上清液(a)或含有抗α6整合蛋白單克隆抗體的雜交瘤上清液(b)一起保溫的肺組織切片，以及與對照上清液(c)或含有抗α6整合蛋白單克隆抗體的雜交瘤上清液(d)一起保溫的肝組織切片。
用如上所述制備的抗體進行免疫沉淀，并對所沉淀出的抗原進行部分N末端順序測定，表明該抗體是針對小鼠α6整合蛋白的，因為所測出的頭15個氨基酸的順序除14位(絲氨酸而非酪氨酸)外均與人α6整合蛋白的順序相同。
實施例Ⅱ抗α6整合蛋白單克隆抗體的體內(nèi)鑒定將得自B16-F10小鼠黑素瘤細胞的一個亞系(第3代)即B16-129細胞(Vollmers等，1985)解凍，在含有10%胎牛血清(FCS)(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，F(xiàn)RG)的DMEM(Gibco，BRL，Paisley，UK)中最多傳代培養(yǎng)2-3次，用胰酶迅速消化，用完全培養(yǎng)基洗滌，并重新懸浮于PBS中。靜脈注射1.5×105個細胞10天后造成每肺300-500處損害，注射7.5×104個細胞則造成30-50處損害。
為在體內(nèi)鑒定抗α6整合蛋白單克隆抗體，將B16-129細胞與對照大鼠單克隆抗體或抗α6整合蛋白單克隆抗體或其Fab片段一起給小鼠靜脈注射。10天后計數(shù)肺B16-129集落。結(jié)果示于表Ⅰ和表Ⅱ。
關(guān)于表Ⅰ，每組10只小鼠，每只小鼠注射7.5×104個細胞。關(guān)于表Ⅱ，給小鼠注射1.5×105個B16-129細胞(a)細胞與抗體同時注射;(b)在注射細胞24小時前注射抗體;(c)將黑素瘤細胞與抗體一起保溫60分鐘，洗滌后給動物注射。該表代表所做的三個實驗之一，每組注射5只小鼠。
表Ⅰ
單克隆抗體／小鼠 單克隆抗體Fab/小鼠 單克隆抗體Fab/小鼠每只小鼠的37(5－113) 1(0－4) 00肺損害表Ⅱ處理類型對照 抗α6整合蛋白 肺損害降低率單克隆抗體的Fab同時注射(a) 610(321-993) 147(3-481) 86%小鼠預處理(b) 742(321-1025) 474(45-1008) 36%B16－129黑素瘤預處理(C) 465(208-563) 224(145-253) 62%處理類型 對照 抗α6整合蛋白 肺損害降低率單克隆抗體的Fab同時注射(a) 610(321-993) 147(3-481) 86%小鼠預處理(b) 742(321-1025) 474(45-1008) 36%B16-129黑素瘤預處理(c) 465(208-563) 224(145-253) 62%用G蛋白親和柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)從雜交瘤上清液中純化抗α6整合蛋白單克隆抗體。用試劑盒"AvidChrom"(BioProbe International，Tustin，CA，USA)制備其Fab片段。作對照使用的是正常大鼠IgG(Jackson Immuno Research Laboratories，West Grove，PA，USA)。
實施例Ⅲ抗α6整合蛋白單克隆抗體與人內(nèi)皮細胞的結(jié)合用以下方法證明抗α6整合蛋白單克隆抗體在人內(nèi)皮細胞頂表面上的結(jié)合作用。象本領(lǐng)域所已知的那樣將HUV-EC-C細胞(ATCC CRL1730)培養(yǎng)至匯合，用甲醛固定法使其穩(wěn)定，并與100μg/ml抗α6整合蛋白單克隆抗體貯液的逐級稀釋液一起保溫，先用生物素化的小鼠抗大鼠抗體(Jackson Immuno Research，West Grove，PA，USA)，然后用與過氧化物酶偶聯(lián)的抗生蛋白鏈菌素及2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)即ABTS(Sigma)檢測表面結(jié)合抗體，ABTS是可在405nm讀數(shù)的底物。結(jié)果示于圖3。
實施例Ⅳ體內(nèi)血管表面染色在C57B1/6小鼠(IFFAC-CREDO，Lyon，F(xiàn))尾靜脈內(nèi)注射1mg經(jīng)過G蛋白-Sepharose純化的抗α6整合蛋白單克隆抗體。注射4小時后將動物處死，將組織包埋在Tissue-Tek(Miles Inc.，Elkart，IN46515，USA)中，用恒冷切片機切片，并準備用FITC結(jié)合的羊抗大鼠IgG抗體(Jackson Immuno Research，West Grove，PA，USA)進行免疫熒光染色。圖4(a)顯示了肺的相差顯微鏡照片，圖4(b)顯示了肺的免疫熒光染色。圖4(c)顯示了肝的相差顯微鏡照片，圖4(d)顯示了肝的免疫熒光染色。注射1mg大鼠IgG對照沒有顯示出任何信號。
實施例Ⅴ細胞遷移的阻斷在12孔組合培養(yǎng)皿(Costar)中，在含有0.3%、3%或10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，將B16-129黑素瘤細胞涂布至匯合。然后用藍色吸管頭(Gibco BRL，Gaithersburg MD，USA)在培養(yǎng)皿上畫痕，造成細胞單層的創(chuàng)傷，從而留下一個明確分開的無細胞區(qū)。再培養(yǎng)24小時后，觀察細胞向此區(qū)內(nèi)的遷移。細胞在3%或10%血清中培養(yǎng)時對細胞遷移沒有影響(未給出結(jié)果)，但在0.3%血清中培養(yǎng)時，抗α6整合蛋白單克隆抗體強烈阻斷B16-129細胞的遷移。圖5(a)和圖5(b)分別顯示了在30μg/ml對照大鼠IgG和30μg/ml抗α6整合蛋白單克隆抗體存在下，0.3%血清中的細胞向創(chuàng)傷區(qū)中部的遷移。
實施例Ⅵ對細胞生長的影響以每孔104個細胞的密度，將B16-129黑素瘤細胞涂布在24孔組合培養(yǎng)皿(3524，Costar，Cambridge，MA，USA)中的含0.3%、3%或10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加有30μg/ml抗α6整合蛋白單克隆抗體(A)或作為對照的30μg/ml大鼠IgG單克隆抗體(B)。在4天內(nèi)，每個條件取兩孔的細胞進行胰酶消化和計數(shù)。細胞在10%和3%血清中很容易生長，但在0.3%血清中，在所測試的4天內(nèi)都保持平靜。在這兩個條件下，抗α6整合蛋白單克隆抗體對細胞生長都沒有任何影響。結(jié)果示于圖6，其中實心方塊代表0.3%胎牛血清和(B)，實心圓代表0.3%胎牛血清和A，空心方塊代表3%胎牛血清和(B)，空心三角代表3%胎牛血清和(A)，實心三角代表10%胎牛血清和(B)，空心圓代表10%胎牛血清和(A)。
權(quán)利要求
1.一種制備單克隆抗體或其功能衍生物的方法，該單克隆抗體或其功能衍生物的特征是具有與哺乳動物α6整合蛋白結(jié)合和抑制轉(zhuǎn)移的能力，該方法的特征在于，給非人類哺乳動物注射α6整合蛋白陽性細胞作為起始抗原，由該免疫動物回收抗體生成細胞并以常規(guī)方式永久化，用測定轉(zhuǎn)移抑制作用的測定法篩選所得的雜交瘤細胞系，從相應(yīng)雜交瘤細胞系的上清液中分離所分泌的抗體，需要時用酶法或化學法進行水解。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中哺乳動物α6整合蛋白為人α6整合蛋白。
3.一種制備雜交瘤細胞系的方法，該細胞系分泌可由如權(quán)利要求1或2所述的方法制得的單克隆抗體，該方法的特征在于，給非人類哺乳動物注射α6整合蛋白陽性細胞作為起始抗原，從該免疫動物回收抗體生成細胞并以常規(guī)方式永久化，用測定轉(zhuǎn)移抑制作用的測定法篩選所得的雜交瘤細胞系。
4.一種制備藥物組合物的方法，其特征在于，使由如權(quán)利要求1或2所述的方法制得的化合物和(需要時)其他藥物活性物質(zhì)，與治療上可配伍的無毒惰性載體物質(zhì)混合，并將該混合物制成格林制劑使用形式。
5.一種藥物組合物，該組合物含有一種或更多種按如權(quán)利要求1或2所述方法制得的化合物，需要時與其他藥物活性物質(zhì)和/或治療上可配伍的無毒惰性載體物質(zhì)配伍。
6.按權(quán)利要求1或2所述方法制得的化合物在制備權(quán)利要求5的藥物組合物中的應(yīng)用。
7.一種單克隆抗體或其功能衍生物，其特征在于，無論何時由權(quán)利要求1或2所述的方法制得，它都具有與哺乳動物α6整合蛋白結(jié)合和抑制轉(zhuǎn)移的能力。
8.如上所述的發(fā)明。
9.一種分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系，所述單克隆抗體可由如權(quán)利要求1或2所述的方法制得。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體或其片段，其特征在于，它具有與哺乳動物α6整合蛋白(優(yōu)選人α6整合蛋白)結(jié)合和抑制轉(zhuǎn)移的能力。本發(fā)明還涉及一種分泌上述抗體的雜交瘤細胞系，制備該雜交瘤細胞系和抗體的方法，含有該抗體或其片段的藥物組合物，以及該抗體或其片段在治療疾病尤其是癌癥中的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/00GK1072687SQ92111620
公開日1993年6月2日 申請日期1992年10月17日 優(yōu)先權(quán)日1991年10月18日
發(fā)明者B·A·因姆霍夫 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司