專利名稱：阻止異常剪接的反義寡核苷酸及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是利用從國家衛(wèi)生研究院(NIH)獲得的政府資助完成的，基金號為GM32994，政府對本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
本發(fā)明涉及阻止前mRNA分子異常剪接和用反義寡核苷酸正調(diào)節(jié)基因表達的方法，以及用于相同目的的反義寡核苷酸。
寡核苷酸作為基因表達調(diào)節(jié)劑的可能性是當(dāng)前值得認真研究的。大多數(shù)嘗試集中在抑制像癌基因或病毒基因這樣的靶基因表達。寡核苷酸或是針對RNA的(反義寡核苷酸)(M.Ghosh and J.Cohen，Prog.Nucleic Acid Rev.Mol.Biol.42，79，(1992)；L.Neckers etal，Crit Rev Oncog.3，175(1992))或是針對DNA的，它們形成三鏈體結(jié)構(gòu)阻止了由RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄(J.Hanrey et al.，Science258，1481(1992)；W.Mcshan et al.J.Biol Chem.267，5712(1992)；M.Grigorier et al.，J.Biol.Chem.267，3389(1992))；G.Duval—Valentin et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA 89，504(1992))。為了獲得預(yù)期的效果，寡核苷酸必須通過有效地阻止事先存在的，不合需要的蛋白質(zhì)從頭形成從而消除它。這種技術(shù)不能應(yīng)用到目標(biāo)為正調(diào)節(jié)天然蛋白質(zhì)產(chǎn)生的領(lǐng)域。然而，假如因為突變，基因表達被負調(diào)節(jié)的話，那么通過反義技術(shù)正調(diào)節(jié)基因表達的手段將是非常有用的。
本發(fā)明提供了利用反義寡核苷酸正調(diào)節(jié)含有突變的DNA的表達，否則該突變將通過基因編碼的前mRNA的異常剪接負調(diào)控該基因的表達。
因此，本發(fā)明第一方面就是阻止含有突變的前mRNA分子的異常剪接的方法。當(dāng)前mRNA存在突變時，突變造成前mRNA不正確剪接并產(chǎn)生與前mRNA形成的mRNA不同的異常mRNA或mRNA片段。更具體地講，前mRNA分子含有(i)確定天然內(nèi)含子的第一組剪接元件，當(dāng)不存在突變時通過剪接除去天然內(nèi)含子，產(chǎn)生編碼天然蛋白質(zhì)的第一種mRNA分子，(ii)由突變造成的第二組剪接元件，該組剪接元件確定與天然內(nèi)含子不同的異常內(nèi)含子，當(dāng)存在突變時通過剪接除去異常內(nèi)含子產(chǎn)生與第一種mRNA分子不同的第二種異常mRNA分子。該方法包括反義寡核苷酸與前mRNA分子雜交。在允許剪接條件下產(chǎn)生雙鏈體分子。反義寡核苷酸不激活RNA酶H，并且選擇阻斷第二組異常剪接元件中的一個成員，從而通過剪接除去天然內(nèi)含子、產(chǎn)生編碼天然蛋白質(zhì)的第一種mRNA分子。
本發(fā)明第二個方面是正調(diào)節(jié)含有編碼天然蛋白質(zhì)的DNA的細胞中天然蛋白質(zhì)表達的方法，該DNA還含有通過其異常剪接引起負調(diào)節(jié)天然蛋白質(zhì)的突變。更具體地講，DNA編碼前mRNA，前mRNA具有前面所列的性質(zhì)。本方法包括給細胞具有前面所述性質(zhì)的寡核苷酸，以通過剪接除去天然內(nèi)含子，細胞產(chǎn)生天然蛋白質(zhì)。
本發(fā)明第三個方面是反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸用于阻止含有突變的前mRNA分子的異常剪接，前—mRNA分子含有前面所述性質(zhì)的第一組和第二組剪接元件。反義寡核苷酸包括的核苷酸(i)與前—mRNA雜交形成雙鏈體分子；(ii)不激活RNA酶H；(iii)阻斷第二異常剪接元件組的一個成員。
本發(fā)明前面和其它目標(biāo)及方面在圖中和下列說明中詳細闡述。
附圖的簡要說明

圖1顯示了前mRNA的結(jié)構(gòu)，盒子代表外顯子，粗線代表內(nèi)含子。與IVS1和IVS2核苷酸1相關(guān)的突變位置(110和705)分別在HB△6克隆上面顯示，下面的數(shù)字表明外顯子和內(nèi)含子的核苷酸長度。反義寡核苷酸用帶數(shù)字短線在β110和IVS705下面標(biāo)出，剪接方式用破折線表示。
圖2顯示了用寡核苷酸1回復(fù)異常剪接，寡核苷酸1是針對β珠蛋白前mRNA內(nèi)含子1的正常分支點。產(chǎn)物和中間體的結(jié)構(gòu)在右邊描述，它們的核苷酸大小在左邊顯示出來。星號表示含有套索的中間體的異常遷移。下面的圖中使用同樣的符號。泳道1顯示對照HB△6前—mRNA的剪接；泳道2顯示β110前—mRNA的剪接；泳道3—8顯示在逐漸增加寡核苷酸1的量(在圖上部表明)的情況下β110前—mRNA的剪接；泳道9顯示存在寡核苷酸3時，β110前—mRNA的剪接，寡核苷酸3是針對β—珠蛋白前—mRNA內(nèi)含子2的序列。
圖3顯示了寡核苷酸2的作用，它針對β110—前—mRNA內(nèi)含子1中的異常3’剪接位點。泳道1顯示了β110前—mRNA的剪接；泳道2—7顯示在寡核苷酸2的量(如圖的上部所示)逐漸增加時β110前—mRNA的剪接。
圖4顯示了用寡核苷酸3和寡核苷酸4回復(fù)IVS2705前—mRNA的異常剪接，寡核苷酸針對隱蔽3’剪接位點，寡核苷酸4針對IVS2705前—mRNA內(nèi)含子2中異常5’剪接位點。泳道1顯示原料RNA；泳道3和3顯示對照轉(zhuǎn)錄物(在圖上部表明)的剪接；泳道4—8和9—13顯示分別存寡核苷酸3和寡核苷酸4時IVS2705前—mR-NA的剪接。反應(yīng)中寡核苷酸的量在上部標(biāo)明。左邊的“？”表示明顯的降解產(chǎn)物。
圖5顯示了LIPOFECTINTM轉(zhuǎn)染試劑存在時，用針對3’隱蔽剪接位點的反義寡核苷酸2’—O—甲基—核糖寡核苷酸(17—mer)處理細胞的結(jié)果。泳道1、3和5，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RF—PCR)的總纖維素RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)用引物A進行(特異性檢測前—mRNA的異常剪接)，在2，4和6泳道中，用引物C進行RT—PCR(特異性檢測前—mRNA正確剪接)。在凝脈泳道圖下面圖解了沒有剪接的前—mRNA及其正確剪接和異常剪接的產(chǎn)物。泳道1和2顯示了從LIPOFECTINTM轉(zhuǎn)染試劑處理的細胞中獲得的前—mRNA的剪接和從2’—O—甲基—寡核糖核苷酸處理的細胞中獲得的3μM前mRNA的剪接，泳道3和4顯示單獨用LIPOFETCTINTM轉(zhuǎn)染試劑處理的細胞中的剪接；泳道5和6顯示未處理細胞的前mRNA的剪接。
圖6和上面圖5相似，顯示了在復(fù)制缺陷腺病毒顆粒存在時用5μM和20μM針對3’隱蔽剪接位點的反義寡核苷酸處理IVS2—654*細胞的結(jié)果。分別用與人β—珠蛋白基因中第二和第三個外顯子雜交的引物進行RT—PCR。泳道1顯示未處理細胞的前mRNA的剪接；泳道2和3顯示腺病毒存在時分別用5μM和20μM寡核苷酸處理的細胞中前mRNA的剪接。
圖7和上面圖5相似，顯示了用5μM或50μM針對異常5’剪接位點的反義寡核苷酸2’—O—甲基—核糖寡核苷酸處理的IVS2—654*細胞電穿孔結(jié)果。泳道1顯示未處理細胞的前—mRNA的剪接。泳道2和3分別顯示用5μM和50μM寡核苷酸處理的細胞前—mRNA的剪接。
內(nèi)含子是真核生物DNA中位于兩個編碼區(qū)即外顯子之間的部分。內(nèi)含子和外顯子轉(zhuǎn)錄出的RNA被稱為“初級轉(zhuǎn)錄物，mRNA前體(或前mRNA)。”內(nèi)含子必須從前mRNA中除去以便產(chǎn)生由外顯子編碼的天然蛋白質(zhì)(這里天然蛋白質(zhì)是指天然存在的、野生型、或功能性蛋白質(zhì))。在剪接過程中內(nèi)含子從前mRNA中除去，外顯子連接起來。
實際上剪接反應(yīng)是在轉(zhuǎn)錄后翻譯前由剪接因子介導(dǎo)的在RNA上進行的一系列反應(yīng)。因此前mRNA是既含內(nèi)含子又含外顯子的RNA；mRNA是內(nèi)含子被除去，外顯子順序連在一起，可被核糖體轉(zhuǎn)錄出蛋白質(zhì)的RNA。
內(nèi)含子是由一組“剪接元件”確定的，剪接元件是與進行剪接反應(yīng)的各種剪接因子結(jié)合的相對短的、保守的RNA片段。因此每個內(nèi)含子是由5’剪接位點，3’剪接位點和位于二者之間的分支點確定下來的。正如本文中所討論的那樣，當(dāng)反義寡核苷酸全部或部分與剪接元件重疊，或者在非?？拷奈恢门c前mRNA結(jié)合從而破壞了介導(dǎo)元件上特定剪接反應(yīng)的剪接因子的結(jié)合和功能時，這些剪接元件被“阻斷”(例如在要阻斷元件的3、6、9、12、15或18核苷酸處與前mRNA結(jié)合)。
天然DNA和前—mRNA中的突變可能是取代突變或者是缺失突變，這些突變形成新的異常剪接元件。異常剪接元件是形成異常內(nèi)含子的異常剪接元件組中的一個成員。異常剪接元件組中剩余成員也可能是決定天然內(nèi)含子的剪接元件組的成員。例如如果突變在天然3’剪接位點上游(即5’方向)和天然分支點下游(即3’方向)形成一個新的異常3’剪接位點，那么天然5’剪接位點和天然分支點既是天然剪接元件組成員也是異常剪接元件組成員。在其它情況下，突變可能激活處于正常休眠狀態(tài)的或不起剪接元件作用的RNA的天然區(qū)域，并且起剪接元件的作用。這樣的元件被稱為“隱蔽”元件。例如，如果突變在天然3’剪接位點和天然分支點之間形成一個新的異常突變的3’剪接位點，那么可能激活位于異常突變3’剪接位點和天然分支點之間的隱蔽分支點。在其它情況下，突變可能在天然分支點和天然5’剪接位點之間造成另一個異常5’剪接位點，并且進一步順序激活異常突變的5’剪接位點上游的隱蔽3’剪接位點和隱蔽分支點。在這利情況下，一個天然內(nèi)含子被分成兩個異常內(nèi)含子。進一步說，在天然剪接元件(特別是分支點)也是異常剪接元件組成員的情況下，可能阻斷天然元件，激活隱蔽元件(即隱蔽分支點)，激活的隱蔽元件將補充天然剪接元件組中剩余成員，以強行正確剪接克服錯誤剪接。還值得注意的是，當(dāng)隱蔽剪接元件被激活時，它可能位于內(nèi)含子中或一個相鄰的外顯子中。這樣，可以根據(jù)由特定突變引起的異常剪接元件組合成反義寡核苷酸，以阻斷各種不同的剪接元件來實施本發(fā)明它可以阻斷突變元件，隱蔽元件或天然元件；它可以阻斷5’剪接位點，3’剪接位點或分支點。通常，它不阻斷決定天然內(nèi)含子的剪接元件，當(dāng)然考慮到如上所述的阻斷天然剪接元件激活隱蔽元件，激活的隱蔽元件作為天然剪接元件組成員參與正確剪接的情況。
反義寡核苷酸的長度(即它的核苷酸數(shù)目)并不是關(guān)鍵的，只要它能選擇性地與預(yù)期的位置結(jié)合并能按常規(guī)方法測定。通常反義寡核苷酸的長度從8、10或12個核苷酸列20、30或50個核苷酸。
不激活RNA酶H的反義寡核苷酸可以按照已知的技術(shù)合成，見例如Pederson等的美國專利No.5,149,797(這里所引的所有專利文獻都并入本文作為參考)。這樣的反義寡核苷酸可能是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列，它含有一些結(jié)構(gòu)修飾，這些結(jié)構(gòu)修飾在空間上妨礙或防止RNA酶H與含有此寡核苷酸作為其一成員的雙鏈體分子結(jié)合，而結(jié)構(gòu)修飾基本不能妨礙或破壞雙鏈體的形成。因為在雙鏈體形成中涉及的寡核苷酸部分完全不同于那些RNA酶H結(jié)合部分，所以可得到許多不能激活RNA酶H的反義寡核苷酸。例如，這樣的反義寡核苷酸可能是其中至少一個或全部核苷酸間橋連磷酸酯殘基是被修飾的磷酸酯的寡核苷酸，像膦酸甲酯、硫代膦酸甲酯、嗎啉—1—基磷酸酯(Phosphoromorpholidate)、哌嗪—1—基磷酸酯(phosphoropiperazidate)和氨基磷酸酯。例如，每隔一個核苷酸間橋連磷酸酯殘基就可能如上所述被修飾。在另一個非限制實例中，這樣的反義寡核苷酸是至少一個或全部核苷酸含有2’低級烷基的寡核苷酸(例如C1—C4線性的或分枝的、飽和的或不飽和的烷基，像甲基、乙基、乙烯基、丙基、1—丙烯基、2—丙烯基和異丙基)。例如每隔一個核苷酸就可能如上所述被修飾。也可以參見P.Furdon等.Nucleic Acids Res.17，9193—9204(1989)；S.Agrawal等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，1401—1405(1990)；C.Baker等，NucleicAcids Res.18，3537—3543(1990)；B.Sproat等.Nucleic Acids Res.17，3373—3386(1983)；R.Walder和J.Walder.Proc Natl.Natl.Acad.Sci.USA85，5011—5015(1988)。
本發(fā)明的方法，寡核苷酸和制劑具有各種各樣的用途。它們對任何如下的發(fā)酵過程是有用的，需要在某一時間之前對表達基因進行負調(diào)節(jié)，之后正調(diào)節(jié)基因表達(例如，在發(fā)酵的生長期期間是負調(diào)節(jié)，在發(fā)酵的生產(chǎn)期期間是正調(diào)節(jié))。對于這樣的用途來說，被表達的基團可以是要發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的編碼基因，只要基因含有天然內(nèi)含子。該基因可用任何合適的方法突變，如位點特異性誘變(見T.Kunkel美國專利No.4,873,192)，以故意造成異常的第二組剪接元件，它確定了一個負調(diào)節(jié)基因表達的異常內(nèi)含子。利用標(biāo)準的重組技術(shù)將基因插入到合適的表達載體中，將表達載體導(dǎo)入宿主細胞(例如，像酵母、昆蟲或哺乳動物細胞(如人，大鼠)這樣的真核細胞)中。宿主細胞用標(biāo)準發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)生長。當(dāng)期望正調(diào)節(jié)突變基因的表達時，將反義寡核苷酸加到培養(yǎng)基中，以便正調(diào)節(jié)基因表達，反義寡核苷酸以合適的配方加入，與異常第二剪接元件組中某個成員結(jié)合。
本發(fā)明的方法，寡核苷酸和制劑也是可用做檢查人和動物基因剪接的體外或體內(nèi)工具，這些基因是由發(fā)育和/或組織調(diào)節(jié)的。這些實驗可以按下面討論的方法或其改進方法進行，這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員都是顯而易見的。
本發(fā)明的方法，寡核苷酸和制劑也可用做治療涉及異常剪接疾病的治療劑。例如β—地中海貧血(寡核苷酸與特別是人的β—珠蛋白前mRNA結(jié)合)；α—地中海貧血(寡核苷酸與α—珠蛋白前mRNA結(jié)合)；泰薩氏綜合癥(寡核苷酸與β氨基己糖苷酶α亞基的前mR-NA結(jié)合)；苯丙酮酸尿癥(寡核苷酸與苯丙氨酸羥化酶前mRNA結(jié)合)和某些類型的囊性纖維化(寡核苷酸與囊性纖維化基因前mRNA結(jié)合)，這些疾病中導(dǎo)致前mRNA異常剪接的突變已被證實(見，例如，S.Akli等，J.Biol.Chem.265，7324(1990)；B.Dworniczak等，Genomics 11,242(1991)；Tsui Trends in Genet.8,392(1992))。
本發(fā)明可以治療包括β110、IVS15、IVS16、IVS2654、IVS2705和IVS2745突變種類的β—地中海貧血，但不局限于這些突變類型(β珠蛋白前mRNA帶有上述的突變)。
“反義寡核苷酸”這—術(shù)語包括其生理和藥物可接受的鹽例如，保留母化合物的所需生物活性而不具有不想要的毒理效應(yīng)的鹽。這些鹽的實例為(a)與陽離子如鈉離子、鉀離子、NH4+、鎂離子、鈣離子，多胺如精胺和亞精胺等形成的鹽；(b)與無機酸，如鹽酸、溴化氫、硫酸、磷酸、硝酸和同類的酸形成的酸加成鹽；(c)與有機酸，如醋酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、單寧酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的鹽；(d)與陰離子，如氯、溴、碘形成的鹽。
本發(fā)明的制劑包括在生理和藥物上可接受的載體，如水溶性載體中的反義寡核苷酸。這樣，本發(fā)明所用的制劑包括那些適用于非腸道給藥方式的制劑，包括皮下、真皮下、肌肉、靜脈、動脈給藥，同樣也可以局部給藥(例如，患囊腫纖維化的病人可經(jīng)肺吸入微粒的霧劑給藥)，但不局限于上述給藥方式。制劑可以用單位劑量方便地給藥并且可在本領(lǐng)域中已知的方法制備。在任何特定的情況下，最合適的給藥途徑依賴于治療對象、性質(zhì)和嚴重程度、及選用的特定活性化合物。
如前面所述，本發(fā)明提供了具有前面所列性質(zhì)的反義寡核苷酸在制備用于患如上所述的異常剪接疾病的病人體內(nèi)正調(diào)節(jié)基因表達的藥物中的用途。在制備本發(fā)明藥物過程中，反義寡核苷酸一般與一種可接受的載體等混合。當(dāng)然載體必須與制劑中任何其它成分匹配，而且對病人無害。載體可以是固體或液體。在本發(fā)明制劑中可以有一個或多個反義寡核苷酸。這種制劑可以用各利已知的制藥技術(shù)制備，基本是將各成分混合，其中任選包括一種或多種輔助治療成分。
本發(fā)明制劑包括活性化合物的無菌水和非水注射液，同時制劑最好與受體血液等滲而且無熱原。制劑可含有抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑和使制劑與預(yù)定受體血液等滲的溶質(zhì)。水和非水無菌懸浮液含有懸浮劑和增稠劑。藥物可以存在于單位劑量或多劑量的容器中如密封的安瓿和小玻璃瓶，在凍干條件下貯存，在臨使用前只需加入鹽水或注射用水等無菌液體載體。
制劑中的反義寡核苷酸可以包含在脂質(zhì)顆?；蚰遗葜校缰|(zhì)體和微晶體，這樣適于腸外給藥。顆?？梢允侨魏魏线m的結(jié)構(gòu)，如單片狀或多片狀，只要反義寡核苷酸含在其中即可。帶有正電荷的脂類如N—[1—(2，3—二油酰氧)丙基]—N，N，N—三甲銨硫酸甲酯鹽即“DOTAP”特別優(yōu)選作為這種顆粒和囊泡，這樣的脂質(zhì)顆粒制劑是眾所周知的。見，如Janoff等的美國專利No.4,880,635；Kurono等4,906,477；Wallach4,911,928；Wallath4,917,951；Allen等4,920,016；Whentley等4,921,757；等等。
當(dāng)受治療者被給藥時，反義寡核苷酸給藥劑量要根據(jù)所用的特定方法、疾病、病人的健康狀況、特定的配方、給藥途徑等來定。通常，希望細胞內(nèi)寡核苷酸濃度為從0.05至50μM，從0.2至5μM更好。對于人這樣的給藥對象，所用劑量大約從0.01、0.1或1mg/kg至50、100或150mg/kg。
在下面非限定的實施例中非常詳細地解釋了本發(fā)明，這里所提到的核苷酸序列只是單鏈，方向5’到3’，從左到右。
實施例1前—mRNA的結(jié)構(gòu)和組建各種人類β—珠蛋白前—mRNA分子的組建和結(jié)構(gòu)如圖1所示。盒子代表外顯子，粗線代表內(nèi)含子。在HB△6克隆上面顯示了與IVS1和IVS2核苷酸1對應(yīng)的突變位置(110和705)。下面的數(shù)字代表外顯子和內(nèi)含子核苷酸長度。在β110和IVS2705下面用帶數(shù)字的短線代表反義寡核苷酸(下面將詳細討論的)，剪接方式用破折線表示。用SP6 RNA聚合酶(M.konarska等all 38,371(1984))從亞克隆到SP64載體上的人類β—珠蛋白合適片段上轉(zhuǎn)錄出所有前mRNA。HB△6(A.Krainer et al.，Cell36,993(1984))含有全部人β—珠蛋白基因。從原始地中海貧血克隆中亞克隆的110結(jié)構(gòu)含有外顯子1和2(R.Spritz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA78，2455(1981))。轉(zhuǎn)錄前，質(zhì)粒在BamHI位點線性化。為了構(gòu)建IVS2705質(zhì)粒。含有HB△6完整第二個外顯子，完整第二個內(nèi)含子和第三個外顯子主要部分的片段首先亞克隆到SP64中，然后按照已知的技術(shù)進行位點特異性誘變(T.Kunkel et al.，Methods Enzymol.154,367(1987))，在內(nèi)含子705核苷酸處產(chǎn)生T變成G的突變，然后將質(zhì)粒在PuvII位點線性化，進行轉(zhuǎn)錄。
實施例2
合成2’—O—甲基寡核糖核苷酸本實施例所用的2’—O—甲基寡核糖核苷酸是利用Glen Re-search(Sterling，VA)的試劑，按照已知的技術(shù)合成的，并且利用USBiochemicals公司的SUREPURETM純化試劑盒按照已知的技術(shù)純化。
生成的2’—O—甲基寡核糖核苷酸被稱為oligo1至oligo5。
oligo1(GUCAGUGCCUAUCA)(SEQID NO1)與內(nèi)含子1中82—95核苷酸互補，它針對正常分支點處；oligo2(AUAGACUAAUAGGC)(SEQ ID，NO2)與內(nèi)含子1中103—116核苷酸互補，它針對由β—珠蛋白基因內(nèi)含子1中β110突變造成的異常3’剪接位點；oligo3(CAUUAUUGCCCUGAAAG)(SEQ ID NO3)與內(nèi)含子2中573—589核苷酸互補，它針對第二個內(nèi)含子中579核苷酸隱蔽3’剪接位點；oligo4(CCUCUUACCUCAGUUAC)(SEQID NO4)與697—713核苷酸互補，它針對IVS2705前—mRNA中第二個內(nèi)含子705核苷酸突變造成的異常5’剪接位點；olig5(GCUAU-UACCUUAACCCAG)(SEQ ID NO5)針對由IVS2654突變(內(nèi)含子2中643—660核苷酸)造成的異常5’剪接位點；oligo6(GCCUGAC-CACCAAC)(SEQ ID NO6)針對珠蛋白前—mRNA外顯子1(對應(yīng)于內(nèi)含子1中核苷酸1的—23至—10核苷酸)中隱蔽5’剪接位點。
實施例3針對人β—珠蛋白內(nèi)含子1正常分支點的反義寡核苷酸回復(fù)異常剪接主要在希臘和塞浦路斯血統(tǒng)病人中發(fā)生的β110—地中海貧血，人β—珠蛋白的基因的第一個內(nèi)含子中110核苷酸發(fā)生A變成G的突變，從而造成一個附加的異常3’剪接位點(R.Spritz et al.，Proc.Natl.Acad.Sci USA78，2455(1981))。雖然存在正常3’剪接位點，但剪接機器優(yōu)先使用異常位點從而產(chǎn)生一個錯誤剪接的mRNA，該mRNA含有內(nèi)含子的19個核苷酸(圖1)。在用β110—珠蛋白等位基因轉(zhuǎn)染細胞(M.Busslinger et al.，Cell27,289(1981)，Y.Fukumakiet al，Cell28,585(1982))或在剪接核提取物轉(zhuǎn)錄物時(R.Reed andT.Maniatis，Cell41，95(1995)(也可見圖2，通道2)，正確剪接的mRNA大約只占剪接產(chǎn)物的10％，這一結(jié)果與從患有這種類型地中海貧血病中獲得的明顯低于正常血紅蛋白水平的結(jié)果是一致的。在β110前mRNA中，異常3’剪接位點和正確3’剪接位點競爭與內(nèi)含子中93核苷酸處的正常分支點結(jié)合，從而阻止正常剪接(R.Reedand T.Maniatis，Cell41，95(1985))。本工作的意義在于失活正常分支點的突變，激活在107核苷酸上的隱蔽分支點，導(dǎo)致在正確的3’剪接位點剪接(Y.Zhuang and A.Weiner，Genes and Dev.3，1545(1989))。因為隱蔽分支點和110位置的突變3’剪接點相近，所以異常剪接不能進行。
為了試驗針對正常分支點序列的反義寡核苷酸是否強迫剪接機器選擇隱蔽分支點并形成正確剪接的mRNA，一個長度為14個核苷酸的2’—O—甲基—寡核苷酸(寡核苷酸1(SEQ、ID NO.1))針對著β—珠蛋白前mRNA內(nèi)含子1的分支點序列處。選擇2’—O—甲基寡核苷酸做這個和以后實驗是因為它對核酸酶有抗性并且和RNA形成不被RNA酶H降解的穩(wěn)定雜合體(H.Inoue et al.，NucleicAcids Res.15，6131(1987)；H.Inoue et al.，F(xiàn)EBS Lctt.215，327(1987)；B.Sproat et al.，Nucleic Aoids Res.17，3373(1989))。當(dāng)使用反義寡脫氧核苷酸或它們的硫代磷酸酯衍生物時，被RNA酶H降解，破壞底物前—mRNA并且阻止任何剪接。
圖2顯示了針對β—珠蛋白前—mRNA內(nèi)含子1中正常分支點的寡核苷酸1回復(fù)異常剪接。用Hela細胞核提取物在體外進行P32標(biāo)記的β110前—mRNA(每個反應(yīng)大約105cpm，25fmoles)剪接，反應(yīng)2小時，除了反應(yīng)體積倍增到50μl外基本按已描述過的方法進行(A.Krainer et al.，Cell，36，993(1984)；Z.Dominski and R.Kole，Mol.Cell.Biol.12，2108(1992))。反應(yīng)產(chǎn)物在8％聚丙烯酰胺測序凝膠上分析并且放射自顯影顯色。右邊顯示了產(chǎn)物和中間體的結(jié)構(gòu)，左邊顯示了它的核苷酸大小，星號代表含有套索中間體的異常遷移。泳道1，對照HB△6前mRNA的剪接；泳道2，β110前—mRNA的剪接；泳道3—8，存在寡核苷酸1的量(在圖上部標(biāo)明)逐漸增多的情況下，β110前—mRNA的剪接；泳道9，存在寡核苷酸3時β110前—mRNA的剪接，寡核苷酸3的目標(biāo)為β—珠蛋白前—mRNA內(nèi)含子2中的序列。
這些數(shù)據(jù)的分析表明在沒有寡核苷酸的對照反應(yīng)中(圖2，泳道2)，錯誤剪接產(chǎn)物和正確剪接產(chǎn)物的比率大約為9∶1。每個反應(yīng)加入寡核苷酸1的濃度從0.01到1.0μg(0.05—5μM)引起依賴劑量的抑制底物異常剪接和誘導(dǎo)正確剪接(圖2，泳道3—6)。寡核苷酸為1.0μg時，剪接產(chǎn)物比率回復(fù)到1∶5。寡核苷酸的作用是序列特異性的，因為加入1μg并對β—珠蛋白基因第二個內(nèi)含子中隱蔽3’剪接位點的寡核苷酸(寡核苷酸3，(SEQ ID NO3)，也見下面)不影響剪接產(chǎn)物的原來比率(圖2，泳道9)。寡核苷酸1為2.0和4.0μg時，兩個剪接位點的剪接都被抑制，形成一個243—mer RNA片段(圖2，泳道7—8)。這種片段只在剪接條件下積累，例如在ATP和其它剪接混合物成份存在時，很可能代表在寡核苷酸接合位點被依賴于ATP的核酸酶降解的產(chǎn)物。
β110突變產(chǎn)生的異常3’剪接位點似乎也是異常剪接位點被反義寡核苷酸回復(fù)的靶位。強迫剪接機器使用內(nèi)含子末端原有的3’剪接位點的最簡單方法是阻斷這個序列。然而針對異常剪接位點的14—mer寡核苷酸(oligo2(SEQ ID NO2))是無效的；當(dāng)寡核苷酸濃度增加時兩種剪接產(chǎn)物的積累都被抑制，正確產(chǎn)物更有效地被抑制(圖3泳道2—5)。在關(guān)于圖2所述的同樣條件下進行剪接。令人感興趣的是，在5’剪接位點裂解并形成套索—外顯子中間體這一第一步剪接反應(yīng)受oligo2的影響似乎比最后形成剪接產(chǎn)物要小。當(dāng)剪接反應(yīng)中加入1或2μg寡核苷酸時仍存在中間體，顯示出這種作用(圖3，泳道5—6)。當(dāng)加入4μg時，在5’剪接位點的裂解反應(yīng)被抑制(圖3，泳道7)。
寡核苷酸1和2的不同作用反映了寡核苷酸、眾多的剪接因子和序列元件之間相互作用的復(fù)雜性，序列元件是指位于正常分支點和正確3’剪接位點之間的37個核苷酸序列。很清楚與這一區(qū)域5’末端的正常分支點雜交的寡核苷酸1阻止了剪接因子與這一序列的結(jié)合，從而強迫剪接因子選擇下游的隱蔽分支點，這樣就抑制了β110前—mRNA異常剪接并誘導(dǎo)了正確剪接。而寡核苷酸2與位于這一區(qū)域中的靶序列雜交，阻止了在這一區(qū)域裝配的大量剪接因子的結(jié)合和任何剪接。同時也注意到這個寡核苷酸阻斷一個重要的多嘧啶序列，這個序列對異常和正確3’剪接位點的剪接都是必需的。這就是為什么這個寡核苷酸不能恢復(fù)正常剪接的另一種解釋。
實施例4
用針對人β—珠蛋白內(nèi)含子2中5’和3’剪接位點的反義寡核苷酸回復(fù)異常剪接異常3’剪接位點能否仍用作同復(fù)不正常剪接的靶子還要在人β—珠蛋白基因第二個內(nèi)含子的705位帶有T變G突變的前mRNA上進一步試驗。在地中海地區(qū)的地中海貧血病人中發(fā)現(xiàn)的這種突變(IVS2705，在正常3’剪接位點上游145個核苷酸處造成一個附加的異常5’剪接位點(C.Dobkin and A.Bank，J.Biod.Chem26016332，(1985))。在剪接期間，內(nèi)含子579位置的3’隱蔽剪接位點被激活，從而切除作為獨立內(nèi)含子的1—578和706—850核苷酸，剩余內(nèi)含子部分合并到剪接產(chǎn)物中(圖1)。在這種RNA中每一個剪接序列元件之間的距離超過100個核苷酸，對于寡核苷酸來說沒有空間障礙效應(yīng)。
圖4顯示了用寡核苷酸3(SEQ ID NO.3)和寡核苷酸4(SEQ IDNO.4)回復(fù)IVS2705前mRNA異常剪接的結(jié)果，寡核苷酸3針對隱蔽3’剪接位點處，寡核苷酸4針對于IVS2705前—mRNA內(nèi)含子2中異常5’剪接位點處。除了RNA轉(zhuǎn)錄物使用前用6％測序凝膠電泳純化外，剪接反應(yīng)條件與前面關(guān)于圖2所述的相同。泳道1，原料RNA；泳道2和3，對照轉(zhuǎn)錄物的剪接(在圖上部標(biāo)明)；泳道4—8和9—13為分別存在寡核苷酸3和寡核苷酸4時IVS2705前—mRNA的剪接，反應(yīng)中寡核苷酸的量在上部標(biāo)出，左邊的“？”代表明顯降解產(chǎn)物。
含有正常β—珠蛋白前—mRNA第二個內(nèi)含子的對照轉(zhuǎn)錄物被有效地剪接(圖4，泳道2)，形成所期望的中間體(5’外顯子和大套索)和451個核苷酸長的正確剪接產(chǎn)物。IVS2705前—mRNA的剪接也可有效進行，產(chǎn)生一個577個核苷酸長的附加剪接產(chǎn)物和預(yù)計約348—mer的中間體，這是由突變造成的異常剪接方式形成的(圖4，泳道3)，RNA正確剪接和不正確剪接的比率為1∶2，與以前在體內(nèi)獲得的結(jié)果相似。作用于579核苷酸處被激活的隱蔽3’剪接位點的寡核苷酸3活性很高，誘導(dǎo)向正確剪接方式的劑量依賴性回復(fù)剪接(圖4，泳道6—8)。每個反應(yīng)加入0.1和0.4μg寡核苷酸可基本上完全回復(fù)。相似濃度的寡核苷酸4也可以獲得正確剪接，寡核苷酸4定位于由第二個內(nèi)含子中705核苷酸突變造成的異常5’剪接位點(圖4，泳道9—13)。兩者中任何一個寡核苷酸為1和2μg時都沒有別的效果，每個反應(yīng)4μg(20μM)時所有的剪接都被抑制(沒有顯示)。包括圖中用“？”標(biāo)出的強條帶在內(nèi)的附加條帶很可能是由核酸酶降解長的前mRNA(1301個核苷酸)造成的。
這些結(jié)果表明隱蔽3’剪接位點和突變5’剪接位點一樣為異常剪接的特定回復(fù)提供了適當(dāng)靶子。寡核苷酸3和4的相似作用表明它們與靶剪接位點的結(jié)合沒有太大的差別。這兩個寡核苷酸的效果比圖2所示實驗中用的寡核苷酸1大約高10倍。這種高性能可能是由于幾個因素造成的，寡核苷酸3和4比寡核苷酸1長3個核苷酸，從而與RNA形成更穩(wěn)定的雜交，它們阻斷異常剪接位點，允許剪接機器使用正確剪接位點和(假設(shè))正確分支點。而β110前—mRNA中寡核苷酸1強迫剪接機器利用次最適的隱蔽分支點，這樣造成形成正確剪接mRNA的效力較低。在圖4所示的實驗中，反應(yīng)2小時后長的原料前—mRNA幾乎檢測不列，說明它是不穩(wěn)定的。因此，盡管寡核苷酸的摩爾濃度與以前實驗基本相同，但對底物前—mRNA的過量更大。
在前面的實驗中，剪接反應(yīng)中同時加入寡核苷酸和其他組分。寡核苷酸與前mRNA預(yù)雜交不能增加它們的效果，反應(yīng)開始15分鐘后即形成剪接復(fù)合物后(B.Ruskin and M.Green，Cell43，131(1985))加入寡核苷酸具有同樣效果(數(shù)據(jù)未列出)。這些結(jié)果說明含有2’—O—甲基的寡核苷酸能夠有效地與剪接因子競爭他們的靶序列。這些化合物的高活性很可能是由于其與RNA的強雜交。
實施例5用阻斷IVS1—5和IVS1—6中隱蔽3’剪接位點的反義寡核苷酸回復(fù)異常剪接除了地中海貧血突變是IVS1—5和IVS2—6突變外，這個實驗基本按上面所述的方法進行，在IVS1—5和IVS1—6突變中IVS1的真正5’剪接位點發(fā)生突變。引起地中海貧血的異常剪接明顯是由于IVS1—5和IVS1—6突變削弱了5’剪接位點并且允許位于上游16個核苷酸的隱蔽剪接位點成功競爭剪接因子。因為剪接位點與在其他前—mRNA中表現(xiàn)出功能的突變剪接位點相似，所用本實驗試驗了一個隱蔽剪接位點的反義寡核苷酸是否能回復(fù)異常剪接返回突變的5’—剪接位點，并且不管突變而保持正確剪接。所用的寡核苷酸是oligo6(SEQ ID NO6)，它是按前面實施例2所述方法產(chǎn)生的2—O—甲基核糖寡核苷酸。
實施例6用阻斷IVS2654突變的異常5’剪接位點的反義寡核苷酸回復(fù)異常剪接除了所用的人β—珠蛋白前—mRNA含有IVS2654突變，所用的寡核苷酸為oligo5(SEQ ID NO5)外，實驗基本按前面所述方法進行。
IVS2654突變經(jīng)常在個別中國血統(tǒng)的地中海貧血病人中發(fā)現(xiàn)，它通過在內(nèi)含子2中653核苷酸處增加一個5’剪接位點并且激活通用的隱蔽3’剪接位點來影響剪接。IVS2654前mRNA異常剪接效率高于IVS2705前—mRNA異常剪接，在體外剪接時，相對異常剪接產(chǎn)物來說，只檢測到少量正確剪接產(chǎn)物。盡管異常剪接效率較高，但針對隱蔽3’剪接位點的oligo3和針對異常5’剪接位點的oligo5，以與前面所述的相似濃度有效地恢復(fù)正確剪接。兩種寡核苷酸之一濃度為2μM時積累正確剪接產(chǎn)物，而基本檢測不到異常剪接產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未列出)。
實施例7用阻斷人β—珠蛋白基因內(nèi)含子1分支點的反義寡核苷酸回復(fù)異常剪接除了寡核苷酸與位于β—珠蛋白基因內(nèi)含子1天然分支點序列近上游的序列(75—88核苷酸)結(jié)合外，本實驗基本如前面所述的回復(fù)β—110前mRNA突變的正確剪接的方法進行。寡核苷酸的序列為CCCAAAGACUAUCC(SEQ ID NO7)，恢復(fù)了正確剪接。
實施例8構(gòu)建表達人地中海貧血β—珠蛋白前—mRNA的細胞系用克隆在巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子下的地中海貧血珠蛋白基因轉(zhuǎn)染Hela細胞和CHO細胞，建立了一系列穩(wěn)定的細胞系。這些基因包括IVS1—110，IVS2—654和IVS1—5突變。
按照標(biāo)準技術(shù)獲得了穩(wěn)定的細胞系。見Current Protocols inMolecular Biology(P.Ausubel et al.編，1987)。簡單地說，就是用帶有巨細胞病毒啟動子控制下的地中海貧血珠蛋白基因的質(zhì)粒和帶有作為選擇標(biāo)記的新霉素抗性基因的質(zhì)粒(pSV2 neo)共轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染可以用電穿孔法(Z.Dominski和R.Kole，Mol，cel.Biol.116075—6083(1991)；Z.Dominski and R.Kole，Mol.Cell.Biol.122108—2114(1992)或者用磷酸鈣法。細胞涂平板，24—48小時后用含有G418的選擇培養(yǎng)基攻擊。按下面方法擴增存活的克隆并分析地中海貧血珠蛋白mRNA的表達。
利用商品化的三試劑(Tri—Reagent)(分子研究中心，辛辛那提，俄亥俄州)根據(jù)廠商流程從大約105個細胞中分離總RNA，這種方法可供處理大量的小樣品，并且獲得高產(chǎn)量的高質(zhì)量RNA。利用rT-th聚合酶，按廠商流程(Perkin Elmer)通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)分析剪接模式。在檢測瞬時轉(zhuǎn)染的細胞中剪接的RNA時，僅需要1—5％分離的RNA，因此這種方法足夠敏感以在穩(wěn)定細胞系中易于檢測。用與地中海貧血mRNA中異常序列雜交并且橫跨剪接接合點的3’引物進行逆轉(zhuǎn)錄，這樣保證傳染的DNA和正常珠蛋白RNA不被檢測并且不干擾分析。表達地中海貧血前—mRNA的克隆細胞系被用于如下所述的反義2’—O—甲基寡核苷酸處理。
實施例9在細胞培養(yǎng)中反義寡核苷酸的用法前面實施例8產(chǎn)生的細胞在24孔培養(yǎng)板上生長，每孔含有200μl培養(yǎng)基。每孔種入2×104個細胞，當(dāng)吸附時用含有50μM反義寡核苷酸的200μl培養(yǎng)基處理。細胞在寡核苷酸存在下培養(yǎng)4天達到匯合生長。因為2’—O—甲基寡核苷酸在含有培養(yǎng)基的血清中非常穩(wěn)定，所以每兩天以上更換一次培養(yǎng)基。50μM(每孔40μg)寡核苷酸濃度超過在體外有效率恢復(fù)剪接所需濃度100倍。即使按這種濃度算，1μmol規(guī)模的一次寡核苷酸合成，產(chǎn)生1—1.6mg寡核苷酸，為25至40個樣品提供了足夠的原料。
在另一種方法中，根據(jù)已知的技術(shù)(C.Bennett et al.，Mol.Pharm.411023—1033(1992))，在加入寡核苷酸前用10μg/ml的Lipofec-tionTM試劑(DOTMA，BRL產(chǎn))預(yù)處理細胞。
處理后，用前面方法分離總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)驗證正確剪接的mRNA的存在。在α—P32標(biāo)記的ATP存在的情況下進行引物擴增，增加檢測靈敏度，把循環(huán)次數(shù)降到15個。
前面的實施例是對本發(fā)明的解釋，但不對其構(gòu)成限制。本發(fā)明用下面的權(quán)利要求以及本文中所包括的權(quán)利要求的等同物來定義。
實施例10脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染被帶有IVS2—654地中海貧血突變的人β—珠蛋白克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Hela基礎(chǔ)細胞系用來做下面的實驗。IVS2—654細胞系的一個亞克隆表達大量異常剪接的β—珠蛋白mRNA和少量正確剪接的β—珠蛋白mRNA。被稱為ISV2—654*的第二個亞克隆表達的異常和正常剪接的β—珠蛋白的mRNA的比率大約為1∶1。用3μM與3’隱蔽剪接位點反義的2’—O—甲基核糖寡核苷酸(oligo3，CAU-UAUUGCCCUGAAAG，SEQ ID NO3)(17—mer)處理大約105個IVS2—654單層細胞，根據(jù)廠商說明書在不含血清的OPTI—MEM培養(yǎng)基中用20μg/ml LIPOFECTINTM脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑處理5小時。培養(yǎng)后，去掉培養(yǎng)基，細胞重新回到正常生長培養(yǎng)基中(MEM＋10％胎牛血清)。沒有處理的細胞和只用Lipofection處理的細胞作為對照。生長過夜后，根據(jù)廠商說明用三試劑(Tri—Reagent)(分子研究中心，辛辛那提，俄亥俄州)分離所有細胞RNA，RNA用260nm吸光度定量。
用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT—PCR)分析剪接。每個樣品的等量RNA用rTth RT—PCR試劑盒(Cetus—Perkin Elmer)分析。除了在RT—PCR反應(yīng)中加入1μciα—P32標(biāo)記的dATP外，按廠商說明進行。PCR產(chǎn)物在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析。與人β—珠蛋白基因第二個外顯子雜交的寡核苷酸被用作通用引物。異常剪接的特定引物(引物A)橫跨異常剪接接合點，而正常剪接引物(引物C)橫跨正常剪接接合點(圖5)。泳道1、3和5用引物A進行RT—PCR，泳道2、4和6用引物C進行RT—PCR。泳道1、3和5中PCR產(chǎn)物量是泳道2、4和6的1/5。泳道1和2顯示3LIPOFECTINTM試劑和3μM 2’—O—甲基寡核糖核苷酸處理的細胞中前—mRNA的剪接；泳道3和4顯示只用LIPOFECTINTM試劑處理的細胞中前—mR-NA的剪接；泳道5和6顯示未處理細胞中前—mRNA的剪接。注意到在泳道2，用寡核苷酸和LIPOFECTINTM試劑處理的正常剪接明顯增加。
實施例11腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移在106個復(fù)制缺陷腺病毒顆粒存在的情況下(d1—312株，Uni-versity of North Cerolina at Chapell Hill Hu博士贈送)，用5和20μM2’—O—甲基核糖寡核苷酸(17—mer)處理大約105個單層生長過夜的IVS2—654*細胞，該寡核苷酸與3’隱蔽剪接位點反義(SEQ IDNO3)。病毒和寡核苷酸在OPTI—MEM中預(yù)培養(yǎng)30分鐘，然后加入到細胞增養(yǎng)物中，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，吸出培養(yǎng)基用正常生長培養(yǎng)基代替。培養(yǎng)過夜后，按前面所述方法分離總RNA。使用分別與人β—珠蛋白基因第二和第三個外顯子雜交的引物，按前面所述方法進行RT—PCR反應(yīng)，等量的PCR產(chǎn)物加樣在凝膠上，按前面實施例10的方法分析產(chǎn)物，結(jié)果顯示在圖6中。泳道1顯示未處理細胞的剪接；泳道2和3顯示在腺病毒存在時，分別用5和20μM寡核苷酸處理的細胞的剪接。注意到對于5和20μM寡核苷酸處理的細胞來說，正常剪接明顯增加，同時異常剪接相應(yīng)減少(劑量依賴性)。
實施例12電穿孔法大約105個單層生成過夜的IVS2—654*細胞被胰蛋白酶消化并在0.5ml OPTI—MEM中轉(zhuǎn)移至10mm電穿孔樣品池中。將與5’剪接位點反義的5或50μM 2’—O—甲基核糖寡核苷酸(oligo4，(CCUCUUACCUCAGUUAC)，SEQ ID NO4)加到每個樣品中，混合物用1500V，0.75μF脈沖電穿孔，所用的電穿孔儀為威斯康辛大學(xué)電子實驗室產(chǎn)品。電穿孔后，細胞重新懸浮在正常生長培養(yǎng)基中單層生長過夜。按前面所述方法分離總RNA，按前面實施例11所述方法進行RT—PCR分析。
結(jié)果顯示在圖7中。注意到異常剪接明顯減小，同時正常剪接相應(yīng)增加，特別是使用50μM寡核苷酸的情況下。
序列目錄(1)一般資料(i)申請人(A)名稱北卡羅來納大學(xué)查珀爾希爾分校(B)街區(qū)大學(xué)4100信箱
(D)城市查珀爾希爾市(D)州北卡羅來納州(E)國家美國(F)郵編(五位號碼)27599—4100(ii)發(fā)明題目阻止異常剪接的反義寡核苷酸及其使用方法(iii)序列數(shù)7(iv)計算機閱讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件Patent In Release#1.0，版本#1.25(EPO)(V)本申請數(shù)據(jù)申請?zhí)朠CT/US94/05181(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO1GUCAGUGCCUAUCA(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征
(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO2AUAGACUAAUAGGC(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO3CAUUAUUGCCCUGAAAG(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是
(xi)序列說明SEQ ID NO4CCUCUUACCUCAGUUAC(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO5GCUAUUACCUUAACCCAG(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO6GCCUGACCACCAAC(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型RNA(基因組的)(iii)反義是(xi)序列說明SEQ ID NO7CCCAAAGACUAUCC
權(quán)利要求
1.阻止含有突變的前mRNA分子中異常剪接的方法，其中所述的前mRNA含有確定天然內(nèi)含子的第一組剪接元件，該內(nèi)含子在不存在所述突變時通過剪接被除去，產(chǎn)生編碼天然蛋白質(zhì)的第一種mRNA分子；其中所述前mRNA還含有由所述突變誘導(dǎo)的第二組剪接元件，這組剪接元件確定一個與所述天然內(nèi)含子不同的異常內(nèi)含子，當(dāng)所述突變存在時通過剪接除去該異常內(nèi)含子，產(chǎn)生與上述第一種mR-NA分子不同的第二種異常mRNA分子；所述方法包括反義寡核苷酸與所述前mRNA分子在允許剪接的條件下雜交，產(chǎn)生雙鏈體分子，其中所述反義寡核苷酸不激活RNA酶H；其中所述寡核苷酸阻斷所述第二組異常剪接元件的一個成員；以便通過剪接除去上述天然內(nèi)含子，產(chǎn)生編碼蛋白的所述第一種mRNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸阻斷一個突變的剪接元件。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸阻斷一個天然剪接元件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸阻斷一個隱蔽剪接元件。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸阻斷一個5’剪接位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸阻斷一個3’剪接位點。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸阻斷一個分支點。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述雜交在細胞內(nèi)進行，并且所述第一種mRNA在其中翻譯成所述天然蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述天然蛋白質(zhì)是β—珠蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述天然蛋白質(zhì)是人β—珠蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸的長度為8至50個核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸含有修飾的核苷酸間橋連磷酸酯殘基，這些磷酸酯殘基選自膦酸甲酯，硫代膦酸甲酯、嗎啉—1—基磷酸酯、哌嗪—1—基磷酸酯和氨基磷酸酯。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述反義寡核苷酸含有一個在其2’位置具有低級烷基取代基的核苷酸。
14.在含有編碼天然蛋白質(zhì)的DNA的細胞中正調(diào)節(jié)所述天然蛋白質(zhì)表達的方法，所述DNA含有通過其異常剪接引起所述天然蛋白質(zhì)的負調(diào)節(jié)的突變，其中所述DNA編碼前mRNA；其中所述前mRNA含有確定天然內(nèi)含子的第一組剪接元件，當(dāng)上述突變不存在時通過剪接除去天然內(nèi)含子，產(chǎn)生編碼所述天然蛋白質(zhì)的第一種mRNA；其中所述前mRNA還含有所述突變誘導(dǎo)的第二組剪接元件，這組剪接元件確定一個與所述天然內(nèi)含子不同的異常內(nèi)含子，當(dāng)所述突變存在時通過剪接除去該異常內(nèi)含子，產(chǎn)生與上述第一種mRNA不同的第二種異常mRNA；所述方法包括給予所述細胞反義寡核苷酸，反義寡核苷酸在允許剪接的條件下與所述前mRNA雜交，產(chǎn)生雙鏈體，其中所述反義寡核苷酸不激活RNA酶H；其中所述反義寡核苷酸阻斷上述第二組異常剪接元件的一個成員；以便通過剪接除去所述天然內(nèi)含子，并產(chǎn)生上述天然蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中所述細胞是選自由酵母、昆蟲和哺乳動物細胞的真核細胞。
16.用于抑制含有突變的前—mRNA分子中的異常剪接的反義寡核苷酸，其中所述前—mRNA含有確定天然內(nèi)含子的第一組剪接元件，在所述突變不存在時通過剪接除去天然內(nèi)含子，產(chǎn)生編碼天然蛋白質(zhì)的第一種mRNA分子；其中所述前mRNA還含有由所述突變誘導(dǎo)的第二組剪接元件，這組剪接元件確定一個與所述天然內(nèi)含子不同的異常內(nèi)含子，當(dāng)上述突變存在時通過剪接除去異常內(nèi)含子，產(chǎn)生與所述第一種mRNA分子不同的第二種異常mRNA分子；所述反義寡核苷酸包括的寡核苷酸(i)與所述前—mRNA雜交，形成雙鏈體分子；(ii)不激活RNA酶H；(iii)阻斷所述第二組異常剪接元件的一個成員。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的反義寡核苷酸，其中上述寡核苷酸長度為8到50個核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的反義寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有修飾的核苷酸間橋連磷酸酯殘基，這些磷酸酯殘基選自膦酸甲酯，硫代膦酸甲酯，嗎啉—1—基磷酸酯，哌嗪—1—基磷酸酯和氨基磷酸酯。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的反義寡核苷酸，其中所述反義寡核苷酸含有在其2’位置具有低級烷基取代基的核苷酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的反義寡核苷酸，其在生理上可接受的水溶性載體溶液中。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的反義寡核苷酸，其在脂泡囊中。
全文摘要
公開了含有突變的前-mRNA分子中阻止異常剪接的方法。當(dāng)前-mRNA中存在突變時，突變引起前-mRNA不正確剪接并且產(chǎn)生異常mRNA或mRNA片段，這些異常mRNA或mRNA片段與由前-mRNA通常編碼的mRNA不同。本方法包括反義寡核苷酸與前-mRNA在允許剪接條件下雜交，產(chǎn)生雙鏈體分子。反義寡核苷酸不激活RNA酶H，并且選擇阻斷由突變造成的異常剪接元件組的成員，從而通過剪接除去天然內(nèi)含子，產(chǎn)生編碼天然蛋白質(zhì)的第一種mRNA分子。還公開了本方法所用的寡核苷酸。
文檔編號C12P21/02GK1123038SQ94192083
公開日1996年5月22日 申請日期1994年5月10日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月11日
發(fā)明者R·科爾, Z·多明斯基 申請人:北卡羅來納大學(xué)查珀爾希爾分校