專利名稱：用霉實(shí)假單胞菌膽甾醇酯酶水解膽甾醇酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水解膽甾醇酯的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及可從霉實(shí)假單胞菌菌株獲得的膽甾醇酯酶的應(yīng)用。
已經(jīng)了解屬于假單胞菌屬的一些菌株具有產(chǎn)生膽甾醇酯酶的性能，另一些菌株具有產(chǎn)生脂肪酶的性能，還有一些菌株可以產(chǎn)生這兩種酶。
美國專利4,283,494描述了從產(chǎn)堿假單胞菌獲得的脂肪酶可被膽汁鹽激活，并具有膽甾醇酯酶活性。
在Smirnov等人的研究中[Smirnov，V.V；Kornyushenko，O.N.；Bioko，O.I.；Kolesiva，E.A.；Govseeva，N.N.；Endt，V.P.；和Kiprianova，E.A.；Mikrobiologicheskii Zhurnal(Kiev)；42(5)，1980，566-570]，對屬于假單胞菌屬的25種細(xì)菌中的共591個(gè)菌株合成胞外膽甾醇酯酶的能力進(jìn)行了研究。僅有銅綠假單胞菌、類產(chǎn)堿假單胞菌、熒光假單胞菌、惡臭假單胞菌和嗜麥牙假單胞菌(占所研究培養(yǎng)物的3.4％)的個(gè)體菌株具有膽甾醇酯酶活性。發(fā)現(xiàn)致金色假單胞菌(占所研究菌株的100％)、洋蔥假單胞菌(占75％)、嗜麥牙假單胞菌(占60％)、熒光假單胞菌(占13.3％)和銅綠假單胞菌具有脂解活性。
從這些研究中可注意到所檢測的霉實(shí)假單胞菌培養(yǎng)物均不能產(chǎn)生膽甾醇酯酶。
根據(jù)本發(fā)明現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)霉實(shí)假單胞菌菌株能產(chǎn)生胞外膽甾醇酯酶。另外，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)具有膽甾醇酯酶活性的酶組分也是具有脂肪酶活性的組分。
從而，本發(fā)明涉及可從霉實(shí)假單胞菌菌株獲得的膽甾醇酯酶的使用，即通過用該種膽甾醇酯酶處理酯來水解膽甾醇酯的方法。本發(fā)明的方法特別適用于蛋類的處理、紙漿中樹脂的水解工藝、以及水解或合成甾醇或羊毛脂的工藝中。
另外，本發(fā)明提供了一種含有可從霉實(shí)假單胞菌菌株獲得的膽甾醇酯酶的清潔劑組合物。
通過參照附圖可進(jìn)一步說明本發(fā)明，其中

圖1顯示了用分光光度測定法獲得的各種酶的動(dòng)力學(xué)曲線(吸收度對時(shí)間)，參見實(shí)施例2。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)霉實(shí)假單胞菌菌株能夠產(chǎn)生具有膽甾醇酯酶活力的酶，并且，具有膽甾醇酯酶活性的酶與具有脂肪酶活性的酶是同一物質(zhì)，即同一種蛋白質(zhì)既具有脂肪酶活性又具有膽甾醇酯酶活性。
從而，本發(fā)明涉及水解膽甾醇酯的方法，該方法包括用可從霉實(shí)假單假菌菌株獲得的膽甾醇酯酶處得膽甾醇酯。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，膽甾醇酯酶來自霉實(shí)假單胞菌的脂肪酶B(得自日本W(wǎng)AKO Pure Chemical Industries，Ltd.，定貨號126—02931，是從霉實(shí)假單胞菌菌株22.39B，F(xiàn)ERM BP—1051，或其突變菌株或變種獲得的)。
在更為優(yōu)選的實(shí)施方案中，膽甾醇酯酶具有本說明書所附序列表SEQ ID No.1表示的N—末端氨基酸序列。
從而應(yīng)注意到用于本發(fā)明方法中的酶既具有膽甾醇酯酶活性又具有脂肪酶活性，該酶可被描述為例如有膽甾醇酯酶作用的脂肪酶或有脂肪酶作用的膽甾醇酯酶。
用于本發(fā)明方法中的膽甾醇酯酶可通過下列步驟獲得在含有碳及氮源和無機(jī)鹽的適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)其中培養(yǎng)霉實(shí)假單胞菌膽甾醇酯酶產(chǎn)生菌株，優(yōu)選霉實(shí)假單胞菌22.39B，F(xiàn)ERM BP—1051，或其突變菌株或變種，然后回收所需要的酶。
按本說明書中實(shí)施例1所述的方法，從上述日本W(wǎng)AKO PureChemicalIndustries Ltd.提供的脂肪酶制劑脂肪酶B126—02931中獲得了高度純化的脂肪酶。通過氨基酸降解，發(fā)現(xiàn)這種酶的N—末端氨基酸序列為本說明書所附序列表ID No.1表示的序列。按本說明書實(shí)施例2中所述的方法可見這種酶還具有膽甾醇酯酶活性。
也可用重組DNA技術(shù)獲得本發(fā)明方法中所用的膽甾醇酯酶。通過表達(dá)具有脂肪酶和膽甾醇酯酶雙重活性的蛋白，可達(dá)到特殊優(yōu)越性?？捎美缫訵O92/05249公開的國際專利申請(作為參考文獻(xiàn)并入本發(fā)明)中所述的方法獲得重組膽甾醇酯酶。
從而，本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種水解膽甾醇酯的方法，該方法包括用膽甾醇酯酶處理膽甾醇酯，該酶具有與從霉實(shí)假單胞菌FERMBP—1051獲得的膽甾醇酯酶相同的免疫化學(xué)性質(zhì)，并具有相當(dāng)高的膽甾醇酯酶活性。
膽甾醇酯酶和脂肪酶均具有廣泛的工業(yè)用途。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及用可從霉實(shí)假單胞菌脂肪酶產(chǎn)生菌株獲得的膽甾醇酯酶水解蛋類的方法，即用膽甾醇酯酶處理蛋類的方法。
本發(fā)明還進(jìn)一步涉及在水解紙漿中樹脂的過程中使用可從霉實(shí)假單胞菌脂肪酶產(chǎn)生菌株獲得的膽甾醇酯酶，即，一種處理含樹脂的造紙紙漿的方法。在紙漿生產(chǎn)中廣泛使用單獨(dú)的或與溫和化學(xué)處理相結(jié)合的機(jī)械制漿法。這些加工方法在PH為4—9的范圍內(nèi)進(jìn)行，木質(zhì)成份的化學(xué)變化較小。因此，紙漿中含有大量的樹脂中的甘油三酯、酯和蠟。
在隨后的流程中和/或使用紙漿時(shí)殘留的樹脂會(huì)引起一些問題。典型的，結(jié)塊的樹脂在造紙過程中或印刷過程中會(huì)引起紙的撕裂并降低紙的質(zhì)量。已知樹脂的疏水部分含有大量的甘油三酯及其它酯。由于水解產(chǎn)物在水溶液系統(tǒng)中更容易除去，因此，最好水解這些酯。
水解紙漿中樹脂的方法已公開于例如國際專利申請?zhí)朠CT/DK92/00115和PCT/DK92/00137，或國際專利申請?zhí)朩O92/07138和WO92/13130，并且可基本按照其中所述方法進(jìn)行水解。
本發(fā)明的方法還進(jìn)一步涉及用可從霉實(shí)假單胞菌脂肪酶產(chǎn)生菌株獲得的膽甾醇酯酶處理膽甾醇酯來水解或合成甾醇或羊毛脂。這種膽甾醇酯酶還可有利地在皮革生產(chǎn)中用于生皮的脫脂、在羊毛工業(yè)中用于羊毛脂的水解，以及用于甾醇/羊毛脂的水解/合成，例如，在妝品中所用的羊毛甾醇。
本發(fā)明還提供了一種含有可從霉實(shí)假單胞菌脂肪酶產(chǎn)生菌株獲得的膽甾醇酯酶的清潔劑組合物，特別是配制成凝膠的清潔劑組合物，即膠體清潔劑，可用于工業(yè)上硬質(zhì)表面的清洗，特別適用于屠宰場或其它食品廠。
具體的膠體清潔劑可按照如Research Disclosure[340，1992年8月，
發(fā)明者M·巴夫德 申請人:諾沃挪第克公司