專利名稱：一種多硫酸酯甾醇化合物及其提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甾醇化合物，具體地說(shuō)是一種多硫酸酯甾醇化合物及其提取分離方法。
背景技術(shù)：
海綿是最低等多細(xì)胞動(dòng)物，在生物進(jìn)化中屬于特殊的分支。海綿種類(lèi)多，分布廣。目前，已從海綿中分離出多種天然產(chǎn)物，主要有萜類(lèi)、環(huán)肽、氨基酸的衍生物、腺苷、含溴化合物、生物堿、甾類(lèi)等，其中有許多具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這些物質(zhì)在抗病毒、抗腫瘤、抗癌、抗菌等方面具有明顯的活性。
海洋生物中含有豐富的非常規(guī)甾類(lèi)化合物，這些化合物包括通過(guò)甾核與側(cè)鏈的衍生化而的到的新化合物，如增加羥基、側(cè)鏈的烷基化等等。這些非常規(guī)的甾類(lèi)物質(zhì)作為次級(jí)代謝產(chǎn)物，一般在體內(nèi)的含量非常少。但從海綿中已發(fā)現(xiàn)一些非常規(guī)甾類(lèi)物質(zhì)在海綿體內(nèi)的含量卻非常高，它們被認(rèn)為可能作為膜功能分子在體內(nèi)起作用，取代一些具有膜功能的常規(guī)甾類(lèi)分子(文獻(xiàn)1Anna Aiello，Ernesto Fattorusso，Marialuisa Menna；Steroids fromspongeRecent reports Steroids 1999；64687-714)。從海綿中分離的到一些多硫酸酯甾醇類(lèi)化合物，不僅可以作為膜功能性分子存在于海綿體中，更重要的是這類(lèi)化合物有很強(qiáng)的抗HIV病毒的生理活性(文獻(xiàn)2Sun HH，Cross SS，Gunasekera M，Koehn FE.Weinbersterol disulfates A and B，antiviralsteroid sulfates from the sponge Petrosia weinbergi.Tetrahedron 1991；471185-90)，例如從Pseudoaxinissa digitata Cabioch中分離的到的2個(gè)2β，3α，6α-三硫酸酯甾醇，有極強(qiáng)的抗HIV活性，其EC50分別為3和6μg/ml(文獻(xiàn)3G.Bifulco，I.Bruno，L.Minale，and R.Riccio NOVELHIV-INHIBITORY HALISTANOL SULFATES F-H FROM A MARINESPONGE，PSEUDOAXINISSA DIGITATA Journal of Natural Products 1994；57(1)164-67)；同時(shí)還具有抑制酶活性的作用]和溶血性等功能(文獻(xiàn)4Kohenn FE，unasekera M，Cross SS.New antiviral sterol disulfate ortho estersfrom the marine sponge Petrosia weinbergi.J.Org.Chem.1991；561322-5；文獻(xiàn)5N.Fusetani，S.Matsunaga and S.Konosu Bioactive Marine MetabolitesII Tetrahedron Letters，1981；2(21)1985-8)。目前已從海綿中分離到大約39個(gè)帶有硫酸酯官能團(tuán)的甾醇化合物，其中包括單硫酸酯甾醇化合物、二硫酸酯甾醇化合物和三硫酸酯甾醇化合物。三硫酸酯甾醇中的三個(gè)硫酸酯的構(gòu)型一般都是2β，3α，6α。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多硫酸酯甾醇化合物及其提取分離方法。
本發(fā)明技術(shù)方案如下一種多硫酸酯甾醇化合物，中文名稱為22ξ-(2-羥基乙基)-23ξ-甲基-24ξ-乙基-膽甾-2β，3α，6α-三硫酸酯化合物，英文名稱為22ξ-(2-hydroxyethyl)-23ξ-methyl-24ξ-ethyl-cholestane-2β，3α，6α-tryl-tripotassium sulfate其結(jié)構(gòu)式如下 其提取分離方法，采用柱分離技術(shù)，用溶劑進(jìn)行淋洗，與重結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合，可按如下步驟操作1)分離提純以多皺軟海綿(Halichondria rugosa Ridley & Dendy)為原料，干燥切碎，用甲醇攪拌提取，將提取物濃縮至漿狀物，然后將其分散到水中，再依有機(jī)溶劑極性從小到大依次萃?。粚O性最大的萃取液所得的萃取物經(jīng)2-3次硅膠柱層析和混合有機(jī)溶劑淋洗，得到白色粉末；2)進(jìn)行重結(jié)晶用醇和水的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶得固體物；其中分離提純中所述混合有機(jī)溶劑為低極性和高極性有機(jī)溶劑的混合，低極性有機(jī)溶劑采用氯仿，二氯甲烷或乙酸乙酯，高極性有機(jī)溶劑采用甲醇或乙醇；其中重結(jié)晶中所述溶劑醇為C1-C3醇；水和醇的體積比為5-9∶1-5。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果1.方法簡(jiǎn)便可行。本發(fā)明在分離過(guò)程中并未使用價(jià)格昂貴的高效液相色譜，而是采用混合有機(jī)溶劑進(jìn)行柱分離，尤其是采用醇和水的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，得到純度為90％以上的新化合物。
2.本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎。采用本發(fā)明提取分離工藝能夠從多皺軟海綿中首次獲得并確定了此活性化合物的結(jié)構(gòu)和生物活性。本發(fā)明化合物具有新穎的結(jié)構(gòu)特征，即帶有三個(gè)硫酸酯官能團(tuán)的甾類(lèi)化合物的八個(gè)C的支鏈具有高度的取代性，C-22，C-23，C-24，C-25都有取代，而且C-22還帶有一個(gè)-CH2CH2OH的取代基，C-25具有三取代，是現(xiàn)有技術(shù)中文獻(xiàn)所報(bào)道的幾十個(gè)硫酸甾類(lèi)化合物中所沒(méi)有的。
3.具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物是一種多硫酸酯甾醇類(lèi)化合物具有極強(qiáng)的抗HIV病毒的活性，不僅可以抗菌，抑制瘤細(xì)胞，還可以作為抗HIV病毒藥物的先導(dǎo)化合物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1所述一種多硫酸酯甾醇化合物為22ξ-(2-羥基乙基)-23ξ-甲基-24ξ-乙基-膽甾-2β，3α，6α-三硫酸酯鉀鹽化合物，英文名稱為22ξ-(2-hydroxyethyl)-23ξ-methyl-24ξ-ethyl-cholestane-2β，3α，6α-tryl-tripotassium sulfate，其結(jié)構(gòu)式如下 其提取分離方法以中國(guó)南海多皺軟海綿為原料，采用柱分離技術(shù)，用溶劑進(jìn)行淋洗，與重結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合，可按如下步驟操作1.分離提純中國(guó)南海多皺軟海綿(Halichondria rugosaRidley & Dendy)，吹干(60g)，切碎，用CH3OH于50℃攪拌提取4次，合并提取物并減壓濃縮至漿狀物，將漿狀物均勻分散于100ml水中，分別用等量的環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取3次，極性最大的萃取物正丁醇萃取物經(jīng)減壓濃縮的6g，漿狀物經(jīng)36g硅膠(青島海洋化工分廠，300-400目)柱層析(φ＝2×15cm)，依次以400ml不同比例的氯仿-甲醇(100％，80％，60％，50％，40％，30％，20％，10％，0)洗脫，純甲醇的餾分再經(jīng)一次硅膠柱(6g硅膠，青島海洋化工分廠，300-400目)柱層析(φ＝1×11cm)，用100ml氯仿-甲醇(50％，20％，0)洗脫，純甲醇部分減壓除溶劑，得到白色粉末178.3mg；2.所述白色粉末可用醇和水的溶劑進(jìn)行重結(jié)晶取20mg白色粉末用50％∶50％(體積百分比)的水和甲醇的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶，最后可得固體物10mg，純度達(dá)90％。
結(jié)構(gòu)鑒定物理常數(shù)熔點(diǎn)189-191℃；
溶解性易溶于水；光譜數(shù)據(jù)紅外光譜νmax(KBr，cm-1)3471，2956，2868，1638，1467，1379，1250，1070，968，940，883，840，732，619；核磁共振譜δ1H(D2O，TMS)ppm4.77(1H，t)，4.65(1H，t)，4.20(1H，t)，3.6(2H，t)，2.2(1H，m)，2.1(1H，m)，2.0(1H，m)，1.9(1H，m)，1.8(1H，m)，1.6(2H，m)，1.5(6H m)，1.3(6H，m)，1.1(5H，m)，1.0(6H，m)，0.93(5H，m)，0.90(12H，s)，0.7(5H，m)；δ13c(D2O，TMS)ppm40.53(C1)，77.10(C2)，77.61(C3)，26.05(C4)，46.48(C5)，81.82(C6)，38.00(C7)，36.18(C8)，56.37(C9)，38.96(C10)，21.06(C11)，42.14(C12)，45.10(C13)，58.36(C14)，30.68(C15)，26.05(C16)，58.36(C17)，14.58(C18)，15.88(C19)，36.18(C20)，21.64(C21)，36.18(C22)，24.22(C23)，46.16(C24)，36.54(C25)，29.89(C26)，29.89(C27)，29.89(C28)，40.87(C29)，64.16(C30)，17.15(C31)，23.25(C32)，16.91(C33)；高效液相色譜-質(zhì)譜HPLC-MS的碎片離子481，469，453，413，412，397，381，380；分子式的確定元素分析結(jié)果C∶H∶S為33.68∶5.03∶7.35(質(zhì)量比)；C∶H∶S為33.6∶60∶2.76(摩爾比)。推測(cè)含有三個(gè)硫原子。從元素分析的結(jié)果以及分析HPLC-MS所的的質(zhì)譜數(shù)據(jù)(見(jiàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù))，確定分子式為C33H57S3O13K3，分子量M為874。不飽和度UN＝(33*2+2-57-3)/2＝4，從IR譜中未發(fā)現(xiàn)分子中有雙鍵，以及UV譜中在大于200nm的波長(zhǎng)下都沒(méi)有紫外吸收，分子中的不飽和度是來(lái)自于四個(gè)環(huán)。
紅外3471cm-1處的峰表明有OH基的存在1250cm-1處的峰為3個(gè)三個(gè)硫酸化合物的官能團(tuán)，與文獻(xiàn)報(bào)道的三硫酸酯甾醇化合物中硫酸酯的的IR吸收完全一樣。
1HNMR、13CNMR分析13CNMR譜、DEPT譜數(shù)據(jù)獲知33個(gè)C原子其中有3個(gè)季碳，8個(gè)次甲基，3個(gè)帶有O的次甲基，對(duì)應(yīng)于1HNMR譜中4.77(1H，t)，4.65(1H，t)，4.20(1H，t)，11個(gè)亞甲基和8個(gè)甲基。又根據(jù)13CNMR譜中存在56.49ppm，58.60ppm，58.45ppm化學(xué)位移的譜峰，以及不飽和度為4，推測(cè)其為甾類(lèi)化合物。因?yàn)殓薮蓟衔镏蠧環(huán)和D環(huán)中的C-9，C-13和C-14在13CNMR譜中的化學(xué)位移值一般就在50多ppm，作為它們的特征峰。同時(shí)也說(shuō)明該化合物在C、D環(huán)上沒(méi)有特殊的取代，否則這三個(gè)的C的化學(xué)位移會(huì)發(fā)生很大的變化，因此三個(gè)硫酸酯的取代應(yīng)在A、B環(huán)上。在化學(xué)位移為3.60ppm，而且為三重峰，的出結(jié)構(gòu)片斷為-CH2CH2OH。13CNMR譜中δ為29.89處的峰很大，DEPT譜表明此為CH3，可以判斷此處的CH3的結(jié)構(gòu)為-C(CH3)3，得最終結(jié)構(gòu)。
上述結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)報(bào)道的一些硫酸酯甾類(lèi)化合物類(lèi)似，但結(jié)構(gòu)上又有獨(dú)特的地方即帶有三個(gè)硫酸酯官能團(tuán)的甾類(lèi)化合物的八個(gè)C的支鏈具有高度的取代性，C-22，C-23，C-24，C-25都有取代，而且C-22還帶有一個(gè)-CH2CH2OH的取代基，C-25具有三取代，這是文獻(xiàn)所報(bào)道的幾十個(gè)硫酸甾類(lèi)化合物所沒(méi)有的。
生理活性0.25mg/ml的本發(fā)明化合物抑制金黃色葡萄球菌與0.03mg/ml的鏈霉素的作用相同，本發(fā)明化合物相當(dāng)于90IU/mg的鏈霉素；100μg/ml的本發(fā)明化合物對(duì)HL-60人白血病腫瘤細(xì)胞抑制率可以達(dá)到84.9％，BGC-823人胃癌腫瘤細(xì)胞抑制率可以達(dá)到88.0％。
有關(guān)生物活性由于本發(fā)明所涉及的化合物為一種多硫酸酯甾醇化合物，具有極強(qiáng)的抗HIV活性，如從Pseudoaxinissa digitata Cabioch中分離的到的2個(gè)2β，3α，6α-三硫酸酯甾醇，有極強(qiáng)的抗HIV活性，其EC50分別為3和6μg/ml同時(shí)還具有抑制酶活性的作用和溶血性等功能。
實(shí)施例2與實(shí)施例1不同之處在于對(duì)所述白色粉末可用醇和水的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶取20mg所述白色粉末，采用90％∶10％的水和乙醇的混合溶劑，得固體物15mg，純度達(dá)90％。
權(quán)利要求
1.一種多硫酸酯甾醇化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下
2.一種多硫酸酯甾醇化合物的提取分離方法，其特征在于采用柱分離技術(shù)，用溶劑進(jìn)行淋洗，與重結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合，可按如下步驟操作1)分離提純以多皺軟海綿(Halichondria rugosa Ridley & Dendy)為原料，干燥切碎，用甲醇攪拌提取，將提取物濃縮至漿狀物，然后將其分散到水中，再依有機(jī)溶劑極性從小到大依次萃取；將極性最大的萃取液所得的萃取物經(jīng)2-3次硅膠柱層析和混合有機(jī)溶劑淋洗，得到白色粉末；2)進(jìn)行重結(jié)晶用醇和水的混合溶劑進(jìn)行重結(jié)晶得固體物。
3.按照權(quán)利要求2所述提取分離方法，其特征在于其中分離提純中所述混合有機(jī)溶劑為低極性和高極性有機(jī)溶劑的混合，低極性有機(jī)溶劑采用氯仿，二氯甲烷或乙酸乙酯，高極性有機(jī)溶劑采用甲醇或乙醇。
4.按照權(quán)利要求2所述提取分離方法，其特征在于其中重結(jié)晶中所述溶劑醇為C1-C3醇；水和醇的體積比為5-9∶1-5。
全文摘要
本發(fā)明涉及甾醇化合物，具體地說(shuō)是一種多硫酸酯甾醇化合物及其提取分離方法。其結(jié)構(gòu)式如右式。采用柱分離技術(shù)，用溶劑進(jìn)行淋洗，與重結(jié)晶技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行提取分離。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)新穎，方法簡(jiǎn)便可行，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07J9/00GK1502623SQ02144878
公開(kāi)日2004年6月9日 申請(qǐng)日期2002年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月20日
發(fā)明者張衛(wèi), 薛松, 袁權(quán), 虞星炬, 金美芳, 張 衛(wèi) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所