專利名稱：活細菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有干燥的停滯態(tài)微生物細胞的組合物的制備方法、所述組合物及由該組合物制備的活培養(yǎng)物。
活培養(yǎng)物的貯存是本領域中公認的難題。例如，美國專利3,897,307公開了(ⅰ)使用抗壞血酸鹽化合物和谷氨酸鹽或天冬氨酸鹽的組合物作為產(chǎn)乳酸細菌細胞的穩(wěn)定劑；(ⅱ)使用某些糖類，特別是濃度為每亳升樣品溶液25mg的肌醇，作為冰凍干燥所述細菌細胞時的低溫防護劑。
Mugnier等人(Applied and Environmental Microbiology，1985，pp108-114)公開了使用多糖凝膠與某些營養(yǎng)物(如C1-3和C6-12化合物)組合作為冰凍干燥細菌細胞的基質。我們發(fā)現(xiàn)，形成凝膠的多糖在冰凍干燥時并不收縮。
Redway等人(Cryobiology，1173-79，1974)考察了作為長期存活的冰凍干燥細菌的培養(yǎng)基的某些單糖(濃度最高為150mg/2ml樣品)和有關的化合物。
我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，如果將微生物細胞懸浮于如下所限定的某些基質中，并在某些條件下干燥，則其短期存活率提高；如果將上述干燥體系貯存起來，并在如下所限定的某些條件下再水化，則微生物細胞的長期存活率提高。
我們還進一步意外地發(fā)現(xiàn)，懸浮有微生物細胞的基質的收縮并不導致短期存活率差。
本發(fā)明的第一方面提供了一種穩(wěn)定化的干燥組合物，該組合物含有懸浮于收縮基質中的停滯態(tài)微生物細胞。
“穩(wěn)定化”是指微生物細胞的降解減少(所述降解會導致可恢復的活細胞的損失)。
“停滯態(tài)”是指細胞不進行代謝、分裂或生長(但如進行適當處理就可恢復)。
“可恢復”是指細胞處于適當條件下時(即在進行再水化和有營養(yǎng)源時)能夠生長和分裂。
“活細胞”是指細胞處于適當條件下時(即在進行再水化和有營養(yǎng)源時)能夠生長和分裂。
“收縮”是指(1)基質已發(fā)生收縮，孔隙度變小，使低分子量擴散物幾乎不能穿透基質，例如，基質在暴露于潮濕空氣中時幾乎不吸水；和/或(2)基質已經(jīng)歷了其玻璃化轉變溫度(Tg)以上的溫度，從而使其發(fā)生粘性流，導致表面積/體積比大大降低，并將細胞包封在低孔隙度的保護層中。
本發(fā)明的第二方面提供一種穩(wěn)定化干燥組合物的制備方法，所述組合物含有懸浮于基質中的停滯態(tài)微生物細胞，所述方法包括如下步驟A.將微生物細胞與含有將衍生出基質的材料的水性組合物混合；B.在能使材料發(fā)生粘性流并使基質收縮但不會過分損傷細胞的條件下對上述混合物進行干燥。
步驟B制得的組合物優(yōu)選在低于基質的Tg的溫度下貯存，即，該組合物的Tg高于其預期的貯存溫度。
因此，優(yōu)選對步驟B制得的組合物進行進一步的干燥，即所謂“二次干燥”，以提高基質的Tg，使組合物對更寬范圍的貯存條件穩(wěn)定化，即可在更高的溫度下貯存。
本發(fā)明的穩(wěn)定化干燥組合物所包含的微生物細胞優(yōu)選為細菌細胞，然而并不排除使用其他微生物細胞如真菌、酵母等的可能性。如果微生物細胞是細菌細胞，則優(yōu)選為革蘭氏陰性細菌細胞，但并不排除可以是革蘭氏陽性細菌細胞的可能性。可以提到的這類革蘭氏陰性細胞的例子有熒光假單胞菌、大腸桿菌及根際細菌等。
本發(fā)明方法的步驟A中制備的混合物中，微生物細胞的濃度為104-1013個/ml，優(yōu)選1010-1011個/ml。
本發(fā)明方法的步驟A中，與微生物細胞混合的材料是多羥基化合物，例如多元醇類，如甘露醇、肌醇、山梨醇、半乳糖醇，或優(yōu)選為碳水化合物，更為優(yōu)選的是一種糖。
如果該材料是一種糖，那么它可以是二糖、三糖、寡糖，或優(yōu)選為單糖。單糖的例子可以舉出己糖，如鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。二糖的例子可以舉出麥芽糖、乳糖、海藻糖和蔗糖等。三糖的例子可以舉出棉子糖。寡糖的例子可以舉出麥芽糖糊精。
本發(fā)明方法的步驟A中的混合物中，所用的多羥基化合物的濃度為10-1000mg/1010個細胞，優(yōu)選200-400mg/1010個細胞。對特定的多羥基化合物而言，技術人員利用簡單的實驗就能找出能制得收縮基質的多羥基化合物濃度。例如，我們發(fā)現(xiàn)肌醇的最佳濃度為約45mg/ml，它在60mg/ml以上引起大量細胞損傷，而在約25mg/ml以下則不收縮。
某些多羥基化合物在很寬的濃度范圍內都具有保護性質，而某些其他多羥基化合物則在某個臨界濃度以上具有有害作用，這個臨界濃度可能與多羥基化合物在水性介質中的溶解度有關。
現(xiàn)參照附圖進一步說明本發(fā)明，這些附圖以舉例形式說明了本發(fā)明的組合物。
附圖中


圖1以曲線圖形式說明了在從水或0.04M MgSO4中冰凍干燥時，熒光假單胞菌的存活率隨肌醇(添加物)濃度的變化?？v軸代表以ppb表示的存活率(即1E＋09＝109ppb，1E＋08＝108ppb，等等)，橫軸代表每個樣品中添加物的濃度(mg)。曲線圖上的黑方塊(■)標示硫酸鎂中的肌醇，圓圈(○)則標示水中的肌醇。
圖2-7以曲線圖形式說明了冰凍干燥的熒光假單胞菌的存活率隨一系列單糖的單糖濃度的變化?？v軸代表存活率(ppb)，以多少億表示(即1E＋0＝10億，5E－1＝5億，2E－1＝2億，等等)，橫軸代表每個樣品中的糖濃度(mg)。所示單糖有圖2半乳糖圖5 木糖圖3果糖 圖6 鼠李糖圖4葡萄糖圖7 甘露糖圖8以曲線圖形式說明了細胞死亡率(k1)隨基質Tg的變化以及Tg隨目對濕度的變化。左邊的縱軸代表k1，右邊的縱軸代表Tg(℃)，橫軸代表相對濕度(％)。曲線圖上由實線連接的黑方塊標示細胞死亡率常數(shù)(k1)，由虛線連接的菱形則標示玻璃化轉變溫度(Tg)。
在圖中，存活率以每109個原始懸浮液中的活細菌中活細菌的數(shù)目表示，即，它代表每10億個原始活細菌中存活下來的細菌數(shù)目，以ppb存活率表示，即，109ppb等于100％存活，108ppb等于10％存活，等等。
由圖1可以看出，在低肌醇濃度下，細胞存活率得以維持，而在較高濃度下，例于大于100mg/樣品(等于50mg/ml)時，細胞存活率迅速下降。
由圖2-7可以看出，某些單糖在低濃度下，例如小于10mg/樣品(等于5mg/ml)時，能保護細胞不受損傷，而在高濃度下，例如約400mg/樣品(等于130mg/ml)時，這種保護作用基本得以維持。
由圖8可以看出，如果Tg降至貯存溫度(由上部21-22℃處的橫線表示)以下，則細胞死亡率(k1)明顯提高，這說明了在貯存過程中維持玻璃態(tài)的重要性。
材料能起作用即能夠收縮又不過分損傷細胞的濃度，取決于多種因素，主要包括步驟A的懸浮液中細胞的體積份額；多羥基化合物的固有玻璃化轉變溫度；基質的玻璃化轉變溫度隨其中的水濃度的變化；以及基質在冰凍干燥過程中和冰凍干燥后所處的溫度。
應該認識到，多羥基化合物可以起如下作用(ⅰ)在低溫下作為低溫防護劑，特別是在冰凍干燥過程中防止冰顆粒造成的損傷；(ⅱ)作為液體保護劑(lyo-protectant)，防止在干燥和/或貯存過程中由于失水而造成損傷；(ⅲ)在細胞恢復過程中作為營養(yǎng)源。
用于本發(fā)明方法的微生物細胞可以在常規(guī)生長培養(yǎng)基(如營養(yǎng)培養(yǎng)液或胰胨大豆培養(yǎng)液)中培養(yǎng)，可在任何方便的生長期收集，優(yōu)選在靜止早期收集。
例如，將某一培養(yǎng)物培養(yǎng)于合適的培養(yǎng)基之內或之上，例如液體或固體平板，得到所需的細胞濃度。一般用離心法分離細胞。將細胞懸浮在含有將形成基質的材料的水性組合物中，該組合物任選含有下面提到的某些其他添加物。
優(yōu)選的是，從生長培養(yǎng)基中分離出本發(fā)明的方法中所用的微生物細胞，將其再懸浮于含多羥基化合物、合適的添加物等的溶液中，并進行干燥，但并不排除將多羥基化合物和合適的添加物加到生長培養(yǎng)基中的細胞中并干燥所得混合物的可能性。
如果重新懸浮微生物細胞，則最好重新懸浮在合適的水性介質中，例如含有多羥基化合物的MgSO4溶液或優(yōu)選為水。
本發(fā)明方法的步驟B中的干燥可通過蒸發(fā)、真空干燥、噴霧干燥、空氣干燥等來進行，優(yōu)選冰凍干燥。
如上所述，重要的是至少在干燥步驟即步驟B或任何后續(xù)步驟中達到粘性流。
步驟B中制備的干燥組合物的含水量一般低于15％w/w。
如果步驟B中的干燥包括冰凍干燥，則組合物中一般含有一種或更多種合適的添加物。可以舉出的合適添加物的例子主要有低溫防護劑，例如糖類或聚合物，如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；液體保護劑，例如糖類或聚合物，如聚乙烯醇、聚乙二醇；或優(yōu)選為抗氧劑或所謂的增效劑，如抗壞血酸鹽或谷氨酸鹽，但并不排除存在其他添加物的可能性，例如所謂的填充劑，例如結晶糖類，如甘露醇；以及滲透壓調節(jié)劑，如甜菜堿、脲/三甲胺-N-氧化物、脯氨酸、肌氨酸。
現(xiàn)參照下列實施例進一步說明本發(fā)明。
實施例1-6這些實施例說明基質中含鼠李糖的本發(fā)明組合物。
在標準培養(yǎng)基(雙強度營養(yǎng)液)中培養(yǎng)熒光假單胞菌，并在靜止早期用離心法進行收集。將細胞濃縮液再懸浮于無菌水中，并加入足量的經(jīng)高溫滅菌的鼠李糖濃溶液，得到約200個裝在容量為5ml的冰凍干燥瓶中的等份試樣，總體積為4ml，終濃度為200mg糖/2×1010個細胞。
將冰凍干燥瓶放到冰凍干燥器的控溫架上，并將架溫調至-30℃，從而使瓶中的內容物冰凍并使其溫度在2小時內降至-28℃至-30℃。抽真空并進行48小時的初步干燥。將架溫升至0℃，并令二次干燥進行24小時。將瓶溫調至室溫并在真空下密封，然后從冰凍干燥器中取出。
將各瓶于4℃下貯存于真空(實施例1)或于21℃下貯存于控濕空氣中(實施例2-6)。
將樣品在無菌水中再水化，通過在水中連續(xù)稀釋繼而在金氏(King’s)B生長培養(yǎng)基上培養(yǎng)，測定活細菌細胞數(shù)。利用最高稀釋度平板上菌落形成單位(cfu)的數(shù)目，計算出在冰凍干燥和貯存后每單位體積存活的細菌細胞數(shù)。
冰凍干燥剛剛結束后細胞存活率為3×108ppb。
由4℃下真空貯存的細菌得到的結果示于表1。
表1
ND未測CT1為不含鼠李糖的對比試驗。
從表1可以看出，鼠李糖基質的存在大大提高了細菌的存活率。
由在21℃下貯存于控濕室中的細菌得到的結果示于表2。
由表2可以看出，即使在低相對濕度下，即實施例2與CT2相比較，糖的存在也大大提高了存活率。
實施例7-10這些實施例說明基質中含鼠李糖和硫酸鎂的本發(fā)明組合物。
重復實施例1-6的步驟，但將細胞濃縮液再懸浮于0.04M硫酸鎂而非無菌水中，然后再加入鼠李糖溶液。
冰凍干燥剛剛結束后細胞存活率為5×108。
將冰凍干燥細胞于表3所示的溫度下貯存表3所示的時間。
表3
由表3可以看出，該制劑在一定范圍的溫度內能提供實質性的保護作用。
實施例11-15這些實施例說明基質中含有抗壞血酸鈉和谷氨酸鈉的本發(fā)明組合物。
重復實施例1-6的步驟，所不同的是，在再懸浮于水和鼠李糖中的細胞中加入濃抗壞血酸鈉和谷氨酸鈉水溶液。
冰凍干燥剛剛結束后細胞存活率為2×108ppb。
樣品于21℃下貯存于濕空氣中。
表4
由表4中的實施例11和12可以看出，在低于基質Tg的溫度下貯存干燥細胞，能使細胞長期穩(wěn)定。
結果表明，玻璃態(tài)的收縮基質與所含的抗氧劑組合使基質能使活細胞在較為嚴酷的環(huán)境下長期穩(wěn)定。
實施例16用離心法從培養(yǎng)基中分離出含有5×1012個活細胞的4g熒光假單胞菌細胞沉淀，將其與14g商業(yè)級麥芽糖糊精(Glucidex IT19)和1.6g抗壞血酸鈉混合，將該材料在初始為室溫下減壓干燥，其中所蒸發(fā)出的水冷凝到維持在-50℃的冰阱上。
約18小時后停止干燥，此時真空度為1毫巴左右。
樣品經(jīng)用純水再水化并在營養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)后，活細胞恢復率一般為50-90％。
該方法制得的材料以收縮無定形基質的形式存在，其玻璃化轉變溫度超過20℃(當樣品處于標準實驗室相對濕度時)。
權利要求
1.一種穩(wěn)定化干燥組合物，該組合物包含懸浮于收縮基質中的停滯態(tài)微生物細胞。
2.權利要求1的組合物，其中所述微生物細胞是細菌細胞。
3.權利要求2的組合物，其中所述細菌細胞是革蘭氏陰性細菌細胞。
4.權利要求3的組合物，其中所述革蘭氏陰性細胞是熒光假單胞菌、大腸桿菌或根際細菌。
5.一種制備穩(wěn)定化干燥組合物的方法，所述組合物含有懸浮于基質中的停滯態(tài)微生物細胞，所述方法包括如下步驟A.將微生物細胞與含有將衍生出基質的材料的水性組合物混合；B.在能使材料發(fā)生粘性流并使基質收縮但不會過分損傷細胞的條件下對上述混合物進行干燥。
6.權利要求5的方法，其中對步驟B制得的組合物進行進一步的干燥，以提高基質的玻璃化轉變溫度，使組合物對更寬范圍的貯存條件穩(wěn)定化。
7.權利要求5的方法，其中步驟A中制得的混合物中微生物細胞的濃度為104-1013個/ml。
8.權利要求7的方法，其中細胞濃度為1010-1011個/ml。
9.權利要求5的方法，其中該方法的步驟A中與微生物細胞混合的材料是多羥基化合物。
10.權利要求9的方法，其中多羥基化合物為單糖。
11.權利要求9的方法，其中步驟A的混合物中所用的多羥基化合物的濃度為10-1000mg/1010個細胞。
12.權利要求11的方法，其中多羥基化合物的濃度為200-400mg/1010個細胞。
13.按權利要求5制備的組合物，該組合物的玻璃化轉變溫度高于其預期的貯存溫度。
全文摘要
將微生物細胞穩(wěn)定化，以便以干燥組合物的形式以懸浮在收縮基質中的停滯態(tài)貯存。該組合物的制備方法是將微生物細胞如革蘭氏陰性細菌細胞(例如熒光假單胞菌)與一種含有將衍生出基質的多羥基化合物(優(yōu)選糖類)的水性組合物混合物，并在能使多羥基化合物發(fā)生粘性流并使基質收縮但不過分損傷細胞的條件下干燥上述混合物?；|的玻璃化轉變溫度最好高于組合物的貯存溫度。
文檔編號C12N11/00GK1121731SQ9419190
公開日1996年5月1日 申請日期1994年4月18日 優(yōu)先權日1993年4月28日
發(fā)明者D·K·羅德漢姆, J·B·坎特韋爾 申請人:曾尼卡有限公司