專利名稱：具有抗巨細胞病毒活性的寡核苷酸的制作方法
背景技術：
本發(fā)明涉及巨細胞病毒的侵染，更具體地說本發(fā)明涉及利用反義寡核苷酸預防及治療巨細胞病毒的感染。
巨細胞病毒屬于皰疹病毒家族，該病毒家族可感染多種動物包括人類。人類CMV(HCMV)感染人口總數(shù)的50-80％，其感染程度從具有免疫能力的成人的輕度的或無病癥的感染，到引起新生兒及免疫損傷個體(例如移植受體或艾滋病患者)的嚴重發(fā)病，對于新生兒這種感染將引起嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，對于成人常見的病癥可能是，嚴重的單核細胞增多癥、肺炎、肝炎、胃腸炎和脈絡膜視風膜炎。此病毒通過頻繁或長期性親密接觸而傳播，通常是通過母乳喂養(yǎng)或性交。(Schooley in Harrison’s Principles ofInternal Medicine (13th Ed.)(Isselbacher等人編輯)Mc Graw-Hill，Inc.，紐約，1994，第794-796頁)。
CMV具有典型皰疹病毒結(jié)構由二十面體衣殼包裹的雙鏈DNA基因組，外周由脂蛋白外膜包被。此病毒在細胞核內(nèi)復制并引起裂解及傾向性或潛在性感染。個體一旦被感染，將以潛伏期形式終生攜帶此病毒，除非感染者受T細胞調(diào)節(jié)的免疫力損傷。CMV具致癌能力，使人類細胞及非人類細胞發(fā)生變態(tài)，刺激細胞增生。
阻止CMV感染的預防措施有組織移植，血清反應陰性供體者血液的移注，或移注經(jīng)過凍融去甘油化(減少移植相關傳染)處理的血液。現(xiàn)已證明α干擾素可以防止再活化CMV綜合癥復發(fā)，并可延緩高危腎移植受體的CMV的分泌(Schooley in Harrison，s Principles of Internal Medicine(Bth Ed.)(Isselbacher等人編輯)Mcgow-Hill，Inc紐約，1994，794-796頁)。預防性非環(huán)化鳥苷是一種核苷類似物，其已被證明可以減少血清反應陰性的腎臟移植受體受CMV感染。
其它防治措施包括抗人類巨細胞病毒疫苗的研制。但疫苗不能完全防治HCMV感染或復發(fā)(EP 0277773；Elek等(1974)Lancet 11-5；Neff等(1979(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.16032-37)。US 5,273,876公開了一種由減毒的HCMV組成的疫苗，此減毒病毒具有一段HCMV復制所必需的DNA序列，及至少一個可表達抗原性多肽的外源DNA序列。
CMV治療前景還不夠樂觀，現(xiàn)已知的抗病毒藥物如核苷類似物無環(huán)鳥苷(非環(huán)式鳥苷)和ara-A(腺嘌呤阿拉伯糖苷)對HCMV活性感染無顯著療效?，F(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)環(huán)丙鳥苷(9-(1，2-二羥基-2-丙氧甲基鳥嘌呤)在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)槠淙姿嵝问胶罂梢宰鳛镃MV聚合酶的抑制物。攜帶CMV的艾滋病患者連續(xù)使用此藥物可以控制CMV侵染，但接受三個月以上治療的患者通常會引起外圍血嗜中性白細胞減少癥，并且產(chǎn)生對此藥物有抗性的毒株。
Foscarnet(磷酸基甲酸鈉)被用來治療HCMV感染(參見Azad et al.(1993)Antimicrob.Agents Chemother.371945-1954)。但對于免疫損傷患者(如AIDS)這種病癥仍會復發(fā)，另外服用此藥物要求使用輸入泵及封閉式臨床監(jiān)測，而且長期服用該藥物所帶來的的毒性及長期治療出現(xiàn)的抗病毒株限制了它的效用(參見，例如Azad等人，文獻同上)。因此，由于目前所知藥物的毒性、抗性所造成的局限性說明需要新的策略治療CMV。
最近，已經(jīng)研制了新的化學治療藥物，這些藥物能夠調(diào)節(jié)細胞內(nèi)基因及外源基因的表達。根據(jù)Waston-Crick或Hoogsteen的堿基配對原則，這些稱之為反義寡核苷酸的藥物可以結(jié)合到單鏈靶核酸分子上，一般通過這樣幾種機制破壞靶基因的功能阻止在正常轉(zhuǎn)錄、剪接、翻譯過程中所需因子的結(jié)合；激發(fā)RNaseH對mRNA的酶活性破壞；或反應基因直接結(jié)合反義寡核苷酸來破壞靶。
反義寡核苷酸已被用來抑制多種不同病毒的表達包括HIV-1，流感病毒及其它病毒，(參見Agrawal等，U.S.專利5,194,428；Pederson等，U.S.專利5,149,797；Agrawal(1992)，Trends Biotechnol.10152-158；Agrawal等，基因調(diào)節(jié)反義RNA和DNA的生物學，Erickson and Izant編輯)Raven Rress Ltd，紐約(1992)273-283頁)；Agrawal(1991)反義核酸治療癌癥和AIDS的前景，(Wickstrom編輯)Liss，紐約，145-148頁)。
反義寡聚脫氧核苷酸也被用來治療各種皰疹病毒的感染，例如，已報道的能與EBV病毒的EBNA-1基因互補的寡核苷酸可以抑制EBV的感染(U.S.專利5,242,906)。U.S.專利5,248,670公開了與I型單純皰疹病毒基因UL13，UL39，UL40互補的寡核苷酸可用來抑制病毒在培養(yǎng)的Hela細胞中的復制。
另外，反義脫氧寡核苷酸已被設計用來專門治療CMV感染。例如，與HCMV主要立即早期區(qū)(IE2)RNA互補的焦磷酸硫代寡核苷酸可以減少在培養(yǎng)的人類表皮成纖維細胞中侵染性病毒的生產(chǎn)(Azad et al.(1993)Antimicrob.Agents Chemother.37(1945-1954)，而IE2區(qū)編碼可調(diào)節(jié)病毒基因表達的蛋白。(該核苷酸序列同等對應物(即系統(tǒng)命名)來自Chee等人已發(fā)表的DNA序列數(shù)據(jù)。(Curr.Top.Microbiol.Immunol.(1990)154125-169)。
PCT/US91/05815公開了與部分CMV的mRNA互補的寡核苷酸，這些mRNA編碼IE1、IE2或DNA聚合酶(UL54)蛋白質(zhì)，還包括至少部分mRNA帽區(qū)，AUG區(qū)，保守氨基酸區(qū)，位于DNA聚合酶基因特異堿基間的CMV插入?yún)^(qū)，IE1或IE2基因的內(nèi)含子/外顯子連接區(qū)或IE2基因的核定位信號區(qū)。
當然，仍舊迫切需要治療和預防HCMV感染的新方法，特別是需要低量長期使用具療效并且不或很少產(chǎn)生細胞毒性的藥物組合物及使用這些組合物的治療方法。
另外，現(xiàn)在迫切需要其關鍵基因已突變的CMV菌株來研究該病毒的遺傳特性。但不幸的是仍未得到這類突變株因而阻礙了對于此重要病毒的遺傳性的研究。發(fā)明概述現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)某些HCMV基因至今未被公認為病毒DNA復制的必要基因，但對這些基因表達的抑制確實可抑制病毒DNA表達。此出其不意的發(fā)現(xiàn)已被應用于開發(fā)和研制本發(fā)明的合成寡核苷酸以抑制HCMV的DNA復制。在正常生理條件下，這些寡核苷酸可以與巨細胞病毒基因組特異部分雜交或與轉(zhuǎn)錄子部分雜交，由此抑制其表達。
正如本文中使用的，術語“合成寡核苷酸”包括人工合成的具有5-50、優(yōu)選15-約30個核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸單體的多聚物，單體之間被至少一個5’-3’核苷酸間鍵合連接，(人工合成即不是在細胞內(nèi)由DNA聚合酶或RNA聚合酶合成)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的合成寡核苷酸可以與至少部分的來自巨細胞病毒基因UL36，UL84，UL101x-102或UL112-113的RNA或DNA特異地雜交。至今這些特定基因并未被認定為病毒DNA復制所必需的基因。
本發(fā)明的特定實施方案中，寡核苷酸可以與以下基因的至少一部分特異地結(jié)合UL36或UL112-113的外顯子/內(nèi)含子交接片段，推測的翻譯起始區(qū)或UL101X的5’末端未轉(zhuǎn)譯區(qū)，或者UL84 RNA的推測翻譯起始區(qū)或編碼這些翻譯起始區(qū)的DNA序列。
本文中“UL101x”指UL102開放讀框上游的一個小開放讀框(ORF)。UL101x和UL102包含很可能編碼解旋酶-引物酶復合物中與引物酶有關的因子的一段區(qū)域(“UL101x-102”區(qū)域)。
本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案中，靶擊UL36的內(nèi)含子-外顯子區(qū)域的寡核苷酸(UL36I/X1，UL36I/X1A，UL36I/X1C)具有列于序列表中SEQ ID NOS1-3的核苷酸系列。在另一優(yōu)選實施方案中，靶擊UL84 5’未翻譯區(qū)的寡核苷酸(UL84a和UL85b)具有列于序列表SED ID NOS4和5的序列。在再一個優(yōu)選的實施方案中，靶擊推測的翻譯起始區(qū)的寡核苷酸(UL101Xa)具有列于SEQ ID NO6的序列。在又一個優(yōu)選的實施方案中，靶序列為UL112-113區(qū)的內(nèi)含子/外顯子交接區(qū)域的聚核苷酸序列具有SEQ ID NOS7-9的序列。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選實例中，寡核苷酸被修飾，在本文中術語“修飾的寡核苷酸”是指有至少兩個核苷酸被合成的鍵合共價連接的寡核苷酸，所謂合成的鍵合是指在一個核苷酸5’端與另一個核苷酸3’端之間的鍵是除磷酸二酯鍵之外的鍵，并且其中的5’端的磷酸核苷酸可以被許多化學基團取代，優(yōu)選的合成鍵合包括烷基膦酸酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基硫代膦酸酯，磷酰胺，亞磷酰胺，磷酸酯，氨基甲酸酯，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺，2-0-甲基，及羧甲基酯。本發(fā)明的一種優(yōu)選實例中，寡核苷酸包含至少一個位于寡核苷酸結(jié)構中任意位置的磷酸二酯，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，或亞磷酰胺鍵合或這些鍵合的組合。
“修飾的寡核苷酸”也指帶有一個修飾的堿基和/或糖的寡核苷酸，例如3’，5’-取代的寡核苷酸是一種被修飾的寡核苷酸，含有一個3’，5’均與化學基因結(jié)合的糖，其3’結(jié)合的不是羥基而5’結(jié)合的不是磷酸基。修飾的寡核苷酸還可以是加帽的。另外，分子中每個核苷的非橋式氧具有一個取代基的非氧化或部分氧化的寡核苷酸也被稱為修飾的寡核苷酸。3’和/或5’端有賦予核酸酶抗性的大取代基的寡核苷酸也稱為修飾的寡核苷酸，和/或其他一些不經(jīng)人工介入而未在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的各種結(jié)構修飾在此也稱為修飾的寡核苷酸。
在正常生理條件下本發(fā)明的寡核苷酸可以在含有CMV的DNA或RNA的細胞內(nèi)與CMV的DNA或RNA雜交。所述條件包括pH、溫度和離子狀態(tài)。
在某些方面，本發(fā)明提供了一些通過與病毒DNA、RNA部分雜交而對CMV具有抗病毒活性的寡核苷酸，以及提供了包括至少一種本發(fā)明的寡核苷酸，在一些實例中至少兩種不同的本發(fā)明的寡核苷酸，和一種藥學上可接受的載體的藥物組合物。
該藥物組合物被用于抑制，防止和/或減少HCMV在細胞內(nèi)復制的方法中，在此方法中將治療量的藥物組合物給予待保護免受感染的細胞或待治療其感染的細胞。該藥物組合物中的寡核苷酸進入細胞后，在細胞中與CMV的DNA或RNA雜交，因此抑制了CMV復制。該方法的預防性可被用在可能受到CMV感染威脅的健康個體上。它同樣可以用來防止在使用CMV的實驗室中，因疏忽而使CMV污染細胞株。該藥物組合物可以用于治療HCMV的感染的方法中，其中對受感染的哺乳動物或細胞使用該組合物。
本發(fā)明還提供了一種制備突變的DNA復制缺陷的巨細胞病毒的外遺傳(epigenetic)等同物的方法，在此方法中，與CMV的UL36，UL84，UL101x-102基因互補的寡核苷酸被施用給被CMV感染的細胞。當CMV感染發(fā)展到已與寡核苷酸雜交的基因或轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白或功能是DNA復制所必需時，產(chǎn)生了突變CMV。這種方法使得在缺少突變細胞株時也可對CMV進行遺傳學研究，而后者這種突變細胞株目前為止不能大量獲得。附圖簡述通過以下描述及參照相應附圖，可進一步理解關于本發(fā)明的前述及其它目的，及由此而帶來的各種特征，及本發(fā)明本身。


圖1是HCMV基因組的UL36-38區(qū)示意圖，顯示來自此區(qū)的轉(zhuǎn)錄物。
圖2是HCMV基因組UL84區(qū)的示意圖。
圖3是HCMV基因組UL101x-UL102(引物酶相關因子)的示意圖。
圖4是HCMV基因組UL112-113區(qū)的示意圖，顯示本發(fā)明寡核苷酸的靶區(qū)域。
圖5示出ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)結(jié)果，此實驗中細胞經(jīng)過如下處理，用與IE，UL36 I/X1，UL36c(UL36 I/X1C)UL36a(UL36 I/X1A)，NS(非特異寡核苷酸)互補的寡核苷酸預溫育細胞，再用HCMV(MOI＝0.4)侵染，溫育6天，然后對病毒UL44蛋白進行免疫染色。
圖6示出ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)結(jié)果，此實驗中細胞經(jīng)過如下處理用與E/E1/2，IE，UL36 I/X1，UL37 I/X3，UL37 I/X1，UL37 I/X2和HCV1互補的寡核苷酸預培養(yǎng)細胞，再用HCMV(MOI＝0.05)侵染，溫育5天，然后對病毒UL44蛋白進行免疫染色。
圖7示出ELISA結(jié)果，其中細胞經(jīng)過如下處理分別用與IE，UL36 I/X1，UL84a，UL101a或HCV1互補的寡核苷酸，或用pfa(膦基甲酸)預培養(yǎng)細胞，以HCMV(MOI＝0.05)侵染，溫育6天，然后對病毒UL44蛋白免疫染色。
圖8示出ELISA結(jié)果，其中細胞經(jīng)過如下處理分別用與IE，UL101a，UL84a，UL70a，UL70b或HCV1互補的寡核苷酸，或用膦基甲酸pfa預培養(yǎng)細胞，以HCMV(MOI＝0.05)侵染，溫育5天，然后對病毒UL44蛋白免疫染色。
圖9示出ELISA結(jié)果，其中細胞經(jīng)過如下處理分別用與IE，UL36 I/X1，UL36A(UL36 I/X1A)，UL36B(UL36 I/X1B，是一種不同于UL36 I/X1，I/X1A和I/X1C相對應的外顯子/內(nèi)含子交界)或NS互補的寡核苷酸，或用pfa預培養(yǎng)細胞，再以HCMV(MOI＝O.1)侵染，溫育5天，再對病毒UL44蛋白免疫染色。
圖10示出ELISA結(jié)果，其中細胞經(jīng)過如下處理分別用與IE，UL101a，UL102a，UL102b，irsla或HCV1互補的寡核苷酸或用pfa預處理細胞，以HCMV浸染(MOI＝0.05)，溫育6天，顯色反應顯示病毒UL44蛋白。
圖11示出ELISA結(jié)果，其中細胞經(jīng)過如下處理分別用與irs1b，UL84a，UL84b，UL44a，UL44b，oirla和orilb互補的寡核苷酸預培養(yǎng)細胞，以HCMV(MOI＝0.05)侵染，溫育5天，然后反應顯色顯示UL44病毒蛋白質(zhì)。
圖12為光密度計掃描Southern印跡分析的結(jié)果，示出在病毒感染(MOI＝0.1)前用不同濃度的所述的寡核苷酸處理的細胞中的HCMV復制量(以oriLyt為探針)。
圖13為光密度計掃描Southern印跡分析的結(jié)果，示出在病毒感染(MOI＝0.4)前以不同濃度的所述的寡核苷酸處理的細胞中的HCMV復制量。
圖14為光密度計掃描Northern印跡分析的結(jié)果，示出在HCMV病毒感染(MOI＝0.1)前，以不同濃度的所述的寡核苷酸處理的細胞中的病毒RNA表達量，所用探針可與UL36轉(zhuǎn)錄子雜交。優(yōu)選實施方案的詳細描述HCMV基因組由雙鏈線狀DNA組成，長度約為240000個核苷酸可編碼約200個基因。CMV基因在允許細胞內(nèi)或在可被該病毒感染的細胞內(nèi)的表達受級聯(lián)放大調(diào)控，可分為三步立即早期(IE)、早期(E)、晚期(L)。病毒在完成吸附、穿膜、脫殼后，線狀HCMV基因組環(huán)化然后通過產(chǎn)生環(huán)狀產(chǎn)物這種機制在核內(nèi)復制，其產(chǎn)生的連環(huán)體產(chǎn)物隨后被裂解，并在病毒組裝時被包裝，在病毒吸附細胞、穿膜、脫殼的1-4小時內(nèi)，IE的mRNA被合成。這些轉(zhuǎn)錄物的蛋白質(zhì)產(chǎn)物參與早期轉(zhuǎn)錄的起始。與IE蛋白質(zhì)類似，在病毒DNA合成之前，E蛋白由轉(zhuǎn)錄的mRNA編碼。在被感染的細胞中，某些E蛋白在核酸代謝和DNA合成過程中起作用，DNA合成開始后，L mRNA的轉(zhuǎn)錄量達到最大，這些mRNA編碼病毒衣殼組分、被膜蛋白和其它一些在病毒裝備、結(jié)構完整性及成熟后釋放過程中所需的蛋白質(zhì)。
HCMV含有裂解期復制的起始點，稱為oriLyt。已知在人工條件下，體外無病毒的共轉(zhuǎn)染復制實驗中，該起始點是指導DNA復制的反式元件。已證明的oriLyt-依賴型病毒的DNA復制過程必需的基因有UL54(DNA聚合酶)，UL44(聚合酶附加蛋白)，UL57(單鏈DNA結(jié)合蛋白)，UL105，UL70，UL101x-UL102(解旋酶-引物酶復合物的推定亞基)，UL36-38(調(diào)節(jié)蛋白，通用轉(zhuǎn)錄激活因子)，irsl(或稱TRS1)(調(diào)節(jié)蛋白，基因表達激活因子)，IE1/IE2(調(diào)節(jié)蛋白)，及UL84(早期暫時型核相關蛋白，功能未知)和UL112-113(早期暫時型核相關蛋白，功能未知)。上述基因在以前關于HCMV DNA復制或基因表達調(diào)控中并未提及(Pari，et al.(1993)J.Virol.672575-2582；Pari et al.(1993)J.Virol.676979-6988)。
現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)利用針對HCMV基因組某些特殊區(qū)域的寡核苷酸治療細胞的結(jié)果是抑制了HCMV DNA復制。特別是與UL36，UL84，UL101x-102及UL112-113基因的DNA或轉(zhuǎn)錄子互補的寡核苷酸可以阻止HCMV在被感染細胞中的DNA復制。這些受靶擊的基因編碼早期暫時型核相關蛋白，其中一些功能未知(UL84，UL112-113)。在共轉(zhuǎn)染-復制實驗的人工體系中，上述所有基因是那些已知為暫時互補于OriLyt-依賴型DNA復制所必須的那些基因，意想不到地發(fā)現(xiàn)UL36，UL84，UL101x-102基因?qū)τ贖CMV DHA復制也是必須的。因此本發(fā)明包括以這些基因為靶序列的寡核苷酸。在某些特殊例子中，寡核苷酸靶擊UL36的內(nèi)含子-外顯子交接區(qū)域，此區(qū)編碼的蛋白在整個感染周期中存在，是一種立即早期蛋白。UL36-38的基因組圖譜及本發(fā)明寡核苷酸靶擊的轉(zhuǎn)錄子列于圖1。這種類型(UL36 I/X1，UL36 I/X1A和UL 36 I/X1C)代表性寡核苷酸序列列于下表1及序列表SEQ ID NO1，SEQ ID NO2及SEQ IDNO3。
特異于HCMV基因組的其他區(qū)域的本發(fā)明的寡核苷酸包括與UL84，UL101x DNA或包括推測的轉(zhuǎn)譯起始點的轉(zhuǎn)錄子互補的寡核苷酸。UL84中該區(qū)可參見圖2，與UL84互補的代表性寡核苷酸(UL84a和UL84b)的序列列于表1及序列表SEQ ID NOS4和5。圖3示出UL101x-102基因座的推測的轉(zhuǎn)譯起始點區(qū)域。與UL101x轉(zhuǎn)錄物互補的代表性寡核苷酸(UL101xa)的序列列于表1及序列表SEQ ID NO6。上述寡核苷酸的效率是令人驚奇的，因為以前方法認為UL102的ORF(開放閱讀框)對于復制是必須的，并且其編碼的多肽是由UL102 ATG翻譯而來的。在此已證實與101x ATG上游互補的寡核苷酸是有效的。而與推定的UL102 ATG互補的寡核苷酸是無效的。
靶擊HCMV基因組的另一部分的本發(fā)明的寡核苷酸包括UL112-113復合物的剪接區(qū)，特別是，該區(qū)的內(nèi)含子-外顯子交界區(qū)(其示意圖見圖4)也是寡核苷酸的靶區(qū)，與該區(qū)互補的代表性寡核苷酸(UL112-113 I/X1，UL112-113 I/X2，UL112-113 I/X3)的序列列于下表1和序列表中的SEQ ID NOS7-9。
表1靶基因 寡核苷酸序列 SEQ ID NO5’-----3’UL36 I/X1 TGGGGCTTACCTTGCGAACA1UL36 I/X1AGACGTGGGGCTTACCTTGCG2UL36 I/X1CTCTTCAACGACGTGGGGCTT3UL84a GACGCGTGGCATGCTTGGTGT 4UL84b AGGTTGGGGTCGACGCGTGGC 5UL101xa GGCTGAGCGGTCATCCTCGGA 6UL112-113I/X1 CGGGACTCACCGTCGTTCTG7UL112-113I/X2 GGAGGAGAGCCTACAGACGG8UL112-113I/X3 AGTAACGCACCGTCGGTGCC9本發(fā)明的寡核苷酸由以下成分組成脫氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，2-O-甲基-核糖核苷酸，或以上的組合，其中的核苷酸之間以一核苷酸的5’端與另一核苷酸的3’端共價連接。這些寡核苷酸長度至少為6個核苷酸，優(yōu)選的長度為15-50個核苷酸，以15-30個單體最為常見。這些寡核苷酸可以用本領域內(nèi)認可的方法制備，例如可以用本領域認可的技術共價連接核苷酸，這些技術例如磷酰胺酯，H-膦酸酯化學過程或甲基磷酰胺化學過程(例如，參見Uhlmann et al.(1990)Chem.Rev.90543-584；Agrawal et al.1987 Tetrahedron.Lett.28(31)3539-3542)；Caruther etal.(1987)Meth.Enzymol.154287-313；美國專利5,149,798)，這些可以手工操作或自動化合成儀合成然后被加工(Agrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10152-158)。
本發(fā)明寡核苷酸可被多種方法修飾而不損害其與HCMV DNA或mRNA雜交的能力。例如寡核苷酸在一個核苷酸的5’端和另一個核苷酸的3’端之間的核苷酸間鍵合可以不是磷酸二酯鍵，其中5’磷酸核苷酸已被任許多個化學基團取代。例如，帶有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸可以通過本領域眾所周知的方法如甲氧基亞磷酰胺化(參見Agrawalet al.(1988)Proc Natl.Acad.Sci(USA)857079-7083)或H-膦酸酯化(參見Frochler(1986)Tethabedron Lett.275575-5578)而制備。Bergot etal所述合成方法(J.Chromatog(1992)55935-42)也可應用。其它一些化學修飾基團的例子包括烷基膦酸酯，二硫代磷酸酯，烷基硫代膦酸酯，磷酰胺，亞磷酰胺，磷酸酯，2-O-甲基，氨基甲酸酯，乙酰胺，羧甲基酯，碳酸酯和磷酸三酯。其有上述這些鍵合的寡核苷酸可以按已知方法制備(參見Agrawal and Goodchild(Tetrahedron Lett(1987)283539-3542)；Agrawal et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1988)857079-7083)；Uhlmann et al.(Chem.Rev.(1990)90534-583；Agrawal et al.(Trends Biotechnol(1992)10152-158)。
其他修飾包括寡核苷酸分子內(nèi)部或末端的修飾并且包括核苷酸分子間的磷酸酯鍵的添加物，例如膽甾型化合物或二胺化合物，并且其中在氨基與末端核糖，脫氧核糖和磷酸酯修飾之間的碳殘基數(shù)可以不同，其可以裂解或交聯(lián)到相對鏈上或與相關酶或與其他病毒基因組結(jié)合的蛋白相連。所述修飾的寡核苷酸的例子包括帶有被修飾的堿基和/或糖如用阿拉伯糖代替核糖的寡核苷酸，或帶有3’，5’均被化學基團結(jié)合(但其中3’端不是羥基，5’端不是磷酸酯基)的糖的3’，5’取代寡核苷酸。其他修飾的寡核苷酸可以是在3’和/或5’端用賦予核酸酶抗性的大取代基加帽，或每分子核苷酸有一非橋式氧取代。這些修飾可以在部分或所有的核苷酸間鍵合上。也可以在寡核苷酸的某一或兩個末端，和/或在分子內(nèi)(綜述見Agrawal et al.(1992)Trends Biotechnol.10152-158)。
為評估本發(fā)明中具體寡核苷酸的抗病毒效果，進行了ELISA實驗。簡而言之，對HCMV侵染敏感的細胞(即允許細胞)用不同濃度的列于表2A和2B的寡核苷酸進行預處理。
表2A寡核苷酶針對于UL36 I/X1 第一個I/X交界區(qū)UL36 I/X1A IE內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL36 I/X1B IE內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL36 I/X1C IE內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL37 I/X1 IE第一個內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL37 I/X2 IE第二個內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL37 I/X3 IE第三個內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL44a E聚合酶持續(xù)合成因子UL44b E聚合酶持續(xù)合成因子UL70a E解旋酶-引物酶復合物UL70b E解旋酶-引物酶復合物UL84a E推測的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)UL84b E推測的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)UL101xa 引物酶相關因子(PAF)UL102aPAFUL102bPAFUL112-113 I/X1E內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL112-113 I/X2E內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)UL112-113 I/X3E內(nèi)含子/外顯子交界區(qū)irsla IE推測的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)irslb IE推測的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)orila 復制起始點orilb 復制起始點IE(ISIS) IE2轉(zhuǎn)譯起始區(qū)表2B寡核苷酸序列 SEQ ID NOUL36 I/X 1 TGGGGCTTACCTTGCGAACA1UL36 I/X 1A GACGTGGGGCTTACCTTGCG2UL36 I/X 1B CAACGACGTGGGGCTTACCT10UL36 I/X 1C TCTTCAACGACGTGGGGCTT3UL37 I/X 1 ACCCCTGCTTACTGGTGAGA11UL37 I/X 2 GTTGTTTTTACCTGAAACCC12UL37 I/X 3 CCGAACGGCGGTTTCTCCAC13UL44a CTTGCGATCCATCCCGGACAG 14UL44b CTCCGAGAGGCGCGTCTTGC15UL70a ACGAGCGTCATCGTCGCGCCGG 16UL70b CATCGTCGCGCCGGCACGATGC 17UL84a GACGCGTGGCATGCTTGGTGT 4UL84b AGGTTGGGGTCGACGCGTGGC 5UL101xaGGCTGAGCGGTCATCCTCGGA 6UL102a GCGAAACGACATGGCCAAATC 18UL102b GCGCGTGGGTGCCATACTCTT 19UL112-113 I/X1 CGGGACTCACCGTCGTTCTG7UL112-113 I/X2 GGAGGAGAGCCTACAGACGG8UL112-113 I/X3 AGTAACGCACCGTCGGTGCC9irs1a CCGTTGCGCTGGGCCATGGG20irs1b CATGGGCGCCGGACACCTGC21ori1a AAATCATCTCTGACGTAGCG22ori1b GCTCGCTACGCTCGCTACGTC 23IE(ISIS) GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG 24以0.05-0.4不同程度的感染復數(shù)用HCMV感染細胞，溫育一段時間后，通過測定UL44的相對水平可以間接方式測定HCMV的復制。UL44是存在于感染細胞內(nèi)的DNA復制必需的一種HCMV蛋白。當HCMV復制受抑制時，檢測到UL44的水平較低。
圖5-7及圖9的結(jié)果表明，在上述實驗中，較任何其它所測試的反義寡核苷酸而言，抗UL36的反義寡核苷酸對UL44基因產(chǎn)物的產(chǎn)生抑制水平最大。如上所述，抗這種基因的寡核苷酸是與未經(jīng)剪接的UL36的RNA的內(nèi)含子-外顯子的交界區(qū)互補。此寡核苷酸的典型代表包括UL36 I/X1，其核苷酸序列列于SEQ ID NO1，UL36 I/X1A(SEQID NO2)，UL36 I/X1C(SEQ ID NO3)。
圖6顯示了類似實驗的結(jié)果，在此不僅使用了UL36 I/X1寡核苷酸，還使用了針對UL36-38區(qū)其它基因座(即UL37)的寡核苷酸。針對這些其它基因座的寡核苷酸的作用其微。
圖7(及圖8和圖11)同樣顯示了針對UL84轉(zhuǎn)錄子或其基因的寡核苷酸的抑制作用。UL84a具有的核苷酸序列列于序列表SEQ ID NO4，UL84b的核苷酸序列列于SEQ ID NO5。
圖7、8和10的實驗結(jié)果表明UL101a同樣具有抑制活性。該寡核苷酸的序列列于序列表SEQ ID NO5，并針對UL101x基因。
為確定本發(fā)明的寡核苷酸是否可以抑制HCMV的DNA合成，將細胞經(jīng)過寡核苷酸預處理后，用HCMV感染細胞，用32P-隨機引物產(chǎn)生的oriLyt(HCMV復制起始點PvuI-KpnI片段)為探針探查，制備Southern印跡。該印跡的典型放射性自顯影結(jié)果示于圖12和圖13，這些結(jié)果類似于ELISA的結(jié)果，說明用濃度低至0.08μM的與UL36 DNA或RNA互補的寡核苷酸處理的細胞，其HCMV的DNA復制可被減弱到可忽略量。針對IE2基因的寡核苷酸(SEQ ID NO24)在任何濃度，其抑制HCMV DNA復制的能力均弱于UL36寡核苷酸。進而，針對UL84和UL101x基因的本發(fā)明的寡核苷酸在某些濃度抑制HCMV DNA復制的能力強于針對IE2基因的寡核苷酸IE(Azad et al.(1993) Antimicrobial Agents and Chemother 371945-1954)。
為確定本發(fā)明的寡核苷酸對HCMV RNA轉(zhuǎn)錄的作用，做Northern印跡分析，細胞經(jīng)寡核苷酸處理，再經(jīng)HCMV(MOI＝0.1)感染(或不經(jīng)感染，或不經(jīng)處理而感染)，再提取總細胞RNA。利用可與UL36轉(zhuǎn)錄子雜交的探針探查印跡。如圖14所示在寡核苷酸濃度為0.4μM時UL36轉(zhuǎn)錄子未被檢測到，在寡核苷酸濃度為0.8μM時，急劇下降。而用IE處理的細胞在此二濃度時均可檢測到轉(zhuǎn)錄子。
上述結(jié)果證實了本發(fā)明的寡核苷酸可以被用作HCMV特異產(chǎn)物的抑制物。
通過比較用寡核苷酸處理的和未用寡核苷酸處理的細胞中新合成的DNA中3H-胸苷的摻入速率，可以確定本發(fā)明的寡核苷酸對細胞無毒害作用。換一種方法，用修飾的MTT或中性紅實驗也可以評價在抗病毒實驗條件下寡核苷酸的毒性(Azad et al.(1993)Antimicrob.Ag.and Chemother.371945-1954；Babich et al.(1991)Appl.Environ，Microbiol.572101-2103；Denzoit et al.(1986)J.Immunol.89271-277)。
通過對選定基因的選擇性反義減量調(diào)控，本發(fā)明的寡核苷酸同樣可以用作為確定基因功能并因此而確認關鍵基因(例如，DNA復制所必需的)的工具。因為HCMV有較長的繁殖周期，DNA復制發(fā)生于感染后(PI)的36小時，相對而言單純皰疹病毒(HSV)的DNA復制則發(fā)生在PI6-8小時的早期內(nèi)。與HSV相似，IE基因表達發(fā)生在感染后(PI)2小時。在IE基因表達及CMV特征性的DNA復制開始之間的長滯后期，使得選擇在HCMV關鍵基因內(nèi)突變的溫度敏感突變株極為困難。另外，HCMV只是對正常二倍體人類成纖維細胞有感染能力這一事實，使產(chǎn)生能維持病毒生長和HCMV關鍵基因表達的共轉(zhuǎn)染的細胞株變得不可能。
在反義途徑中，通過應用本發(fā)明的反義寡核苷酸，可以破壞或減量調(diào)控某一特異病毒基因或基因轉(zhuǎn)錄子。例如，阻止IE基因產(chǎn)物的合成和表達消除了IE基因產(chǎn)物的作用，這可以通過給被CMV感染的細胞使用反義寡核苷酸來達到，此寡核苷酸與UL36，UL84或UL101x CMV基因互補，它們與這些基因或轉(zhuǎn)錄子雜交，從而產(chǎn)生在關鍵基因內(nèi)有缺陷的CMV突變體的外遺傳等價物。這種“反義突變體”與野生型行為相同，但其關鍵基因的功能被削弱或嚴重地受到負調(diào)控。從這方面看，本發(fā)明的寡核苷酸可作為一種遺傳學工具來評估病毒因子及它們在被感染細胞中的作用，從而確定如何通過基因表達來調(diào)控HCMV DNA復制。
本發(fā)明的寡核苷酸同樣可做為診斷探針。因為這些寡核苷酸可以抑制病毒復制，在診斷分析中可用來確定醫(yī)療臨床和實驗樣品中是否存在HCMV。樣品與未經(jīng)處理或經(jīng)寡核苷酸預處理的細胞一同溫育，在經(jīng)過處理的細胞中HCMV的生長受到抑制而在未經(jīng)處理的細胞中則相反，這便可以確認樣品中存在HCMV。這一實驗對于檢測CMV污染及個體感染同樣有用。
本發(fā)明進一步提供了具有針對HCMV感染有抗病毒活性的治療組合物。該組合物包含至少一種本發(fā)明的寡核苷酸，及一種生理上可接受的載體。
在本文中所用的術語“生理上可接受的載體”包括各種溶劑，分散劑，包衣劑，抗病毒和抗真菌試劑，等滲和吸收延遲試劑，等等。在本領域這些用作為藥物活性物質(zhì)的介質(zhì)和試劑是眾所周知的。除了與活性成分不相容的傳統(tǒng)介質(zhì)和試劑，使用它時還需斟酌。輔助的活性成分也可被用在組合物中。
本發(fā)明的寡核苷酸同樣可以用于治療HCMV對人類的感染，該方法中，此藥物組合物可以治療有效量使用一次，也可以多次使用，每次用量低于治療有效量?？梢酝ㄟ^靜脈注射、腹膜內(nèi)注射，或由鼻腔、口腔、表皮或皮下引入機體，寡核苷酸治療HCMV的有效劑量和給藥方式可以通過慣用的實驗確定。適合注射或其他用途的藥物形式包括無菌液體溶劑或分散劑，和無菌粉末(用時制備成可注射的無菌溶劑或分散劑)。以上所有形式必須無菌，且必須在生產(chǎn)和貯存條件下保持穩(wěn)定，可以抵制微生物污染(如細菌、真菌)，載體可以是溶劑或分散劑介質(zhì)?？梢酝ㄟ^各種抗細菌和抗真菌試劑防止微生物污染，可注射藥劑的吸收的延長可以通過使用吸收延遲試劑。
本文所引的專利和科技文獻確立了本領域熟練人員可使用的知識，已頒證的美國專利、已授權的專利申請，以及在此所引其它出版物引入本文作參考。
以下實施例說明了制備和實施本發(fā)明的優(yōu)選模式，但并不意味著限制本發(fā)明范圍，因為使用其它方法可得到相似結(jié)果。實施例1、寡核苷酸的合成未修飾(磷酸二酯鍵連接)的寡聚脫氧核糖核苷酸，寡聚核糖核苷酸和DNA/RNA寡核苷酸嵌合體用一自動DNA合成儀(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，使用U.S專利5,149,789中所說的H-膦酸化學法，或用Uhlmann等人所說的標準亞磷酰胺化學法(Chem.Rev.(1990)90534-583)合成。寡核苷酸硫代磷酸酯也同樣用U.S專利5,149,789中所述的H-膦酸化方法來合成。具有至少一個非磷酸二酯鍵的核苷酸間鍵合的寡核苷酸包括在預選定的位置含有亞磷酰胺，甲基膦酸酯和/或一個2-O-甲基鍵合，其通過Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett.(1987)283539-3542)；Agrawal et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(1988)857079-7083)；和/或Uhlmann等(Chem.Rev.(1990)90534-583)所描述的程序制備。具有至少一個以下鍵合的寡核苷酸通過Uhlmann等人所述的方法(Chem.Rev.(1990)90534-583)制備，所述鍵合包括二硫代磷酸酯，氨基甲酸酯，磷酸酯，2-O-甲基，烷基膦酸酯，烷基硫代膦酸酯，磷酰胺，碳酸酯，磷酸三酯，乙酰胺，和羧甲基酯。2、測定對HCMV復制的抑制作用的ELISA(酶聯(lián)免疫吸附實驗)法通過ELISA檢測與HCMV的RNA互補的本發(fā)明的寡核苷酸(表1)和其它核酸的抗病毒活性。取自外植體的人類表皮成纖維細胞以細胞濃度為5×103/孔的條件接種到含96孔的平皿上，培養(yǎng)基為補加了10％(體積/體積)胎牛血清的Dulbeccos ModifiedEagles Medium(DMEM)(Mediatech，Washington D.C.)。接種后24小時，用Opti-MEM(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)沖洗細胞一次，然后將各種不同濃度的反義寡核苷酸加入到Opti-MEM中，細胞與寡核苷酸溫育16個小時(過夜)。然后移走培養(yǎng)基，用Opit-MEM將細胞洗三次。接著用HCMV(AD169株)(AmericanType Culture Collection，Rockville，MD；ATCC VR-538)以MOI＝0.05-0.4感染細胞。這種HCMV株可冷凍保存。在細胞被沖洗前吸附病毒1個小時，培養(yǎng)基換為含有寡核苷酸的Opti-MEM。
感染后(PI)5-6天，用100％酒精固定細胞，再與一級抗體反應，此抗體特異于基因UL44的產(chǎn)物聚合酶輔助因子，之后細胞與二級抗體反應(二級抗體為HRP-結(jié)合的羊抗鼠IgG抗體)。其在A450的OD值可由一平板閱讀器得出。3 Southern印跡分析HFF細胞以每皿2×105細胞的濃度接種到6cm的皿內(nèi)，其處理過程同上，但不同的是加入濃度只有0.4μM的寡核苷酸，5天后直接用400μl 2％SDS，10mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA從處理的6cm培養(yǎng)皿中的細胞提取細胞總DNA。胞溶產(chǎn)物被轉(zhuǎn)移到加入了200μg/ml蛋白激酶K(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的1.5ml微量離心管中，離心管于50℃溫育1小時，再向裂解液中加入40μl 3.0M乙酸鈉，再用酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提胞溶物一次。水相轉(zhuǎn)移到新離心管內(nèi)，然后用氯仿/異戊醇(24∶1)再抽提一次，之后轉(zhuǎn)移水相至另一新管內(nèi)，加入二倍體積無水乙醇，以14,000g離心沉淀DNA，再懸浮于50μl TE中(TE為10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)。用25單位的EcoRI(New England Biolabs，Beverly，MA)酶切10μl的DNA，反應體積為50μl，37℃反應4-16小時。用0.8％瓊脂糖凝膠電泳；依據(jù)廠家說明用堿式轉(zhuǎn)移方法將其轉(zhuǎn)移到Zeta-探針尼龍膜上(Bio-Rad，Richmond，CA)。用32P-隨機引物產(chǎn)生的oriLyt探針(oriLyt為HCMV的Pvul-Kpnl片段復制起始區(qū))進行雜交，其比活性約為1×109cpm/μg。于雜交爐(RobbinsScientific，(Sunnyvale，CA))中，在68℃，在10ml雜交緩沖液中用5ng探針與濾膜雜交16小時，雜交緩沖液為1.5×SSPE，7％SDS(W/V)，10％PEG(重量/體積)。用2×SSC，0.1％SDS(重量∶體積)進行雜交后的洗滌，于室溫洗2次每次15分鐘。之后，于68℃用0.1×SSC，0.1％SDS(重量∶體積)洗兩次，每次45分鐘，最后將Sorthern印跡于X-OMAT AR(Kodak，Rochester，NY)X光膠片上曝光24小時，溫度-80℃。4 Nothern印跡分析用500μl 2％SDS，200mM Tris-HCl pH7.5，1mM EDTA在6cm平皿上直接裂解處理后的細胞，胞溶物被轉(zhuǎn)移到一個1.5ml微量離心管中，加入150μl冰冷的沉淀緩沖液(42.9g乙酸鉀，11.2ml乙酸，加水至100ml)，振蕩離心管并置于冰上2分鐘，室溫離心5分鐘。上清轉(zhuǎn)移至新管中，用300μl氯仿/異戊醇(24∶1)抽提兩次。用0.65ml的冰冷異丙醇沉淀并在14,000×g下離心RNA 5分鐘，用100％甲酰胺懸浮沉淀的RNA。
取10μg(約10μl)RNA在含有6％甲醛的10％瓊脂糖凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移至Zeta-探針尼龍膜上。用針對UL36轉(zhuǎn)錄子的RNA探針(ribobrobe)(Sall-BssHll672bp探針，位于UL36轉(zhuǎn)錄子上)與濾膜雜交，在65℃下雜交16小時。雜交緩沖液為1.5×SSPE，1％SDS，50％甲酰胺，0.5％脫脂奶粉及100μg/ml變性的鮭魚精DNA。雜交后用2×SSC，0.1％SDS(重量∶體積)于65℃洗兩次，每次45分鐘。最后將Southern印跡于-80℃在X-OMAT AR(Kodak)X光膠片上曝光24小時。5細胞毒性檢測實驗在抗病毒實驗條件下，寡核苷酸的細胞毒性采用修飾的MTT或中性紅檢驗進行評估(Azad et al.(1993)Antimcrob Ag.and Chemother.371945-1954；Babich et al.1991 Appl.Environ.Microbiol.572101-2103；Denzoit et al.1986J.Immunol 89271-277)。HFF細胞按上述過程處理，做96孔的ELISA免疫實驗，包括寡核苷酸的預處理。同時進行的有不經(jīng)過病毒感染，細胞只在無菌培養(yǎng)基上模擬接種生長。在溫育末期(寡核苷酸處理后第4天)直接向每孔的培養(yǎng)基(100μl)中加入10μl MTT(5mg/ml，溶于PBS)，再將細胞溫育2小時。從每孔中除去培養(yǎng)基，將不溶的藍色formAzan產(chǎn)物溶于酸化異丙醇中。通過一個BioTex型EL312C微型平皿閱讀器確定540nm處的光密度。三次實驗的平均值以相對模擬處理細胞產(chǎn)生信號的百分數(shù)表示，將不含細胞的孔的最小背景從每次計算結(jié)果中減去。
寡核苷酸產(chǎn)生的細胞毒性也可通過比較在預處理的和未處理的細胞內(nèi)摻入的3H-胸苷量來確定。預處理的細胞是指經(jīng)過本發(fā)明的寡核苷酸預處理24小時。然后加入1μCi的3H-T(NEN/DuPont)脈沖細胞4小時(37℃)，用0.4M NaOH將細胞裂解，胞溶物放在玻璃纖維濾膜上，充分洗滌。干燥后的濾轉(zhuǎn)移到含有3ml閃爍劑的閃爍瓶中，并被計數(shù)。同等或類似物本領域的熟練人員將意識到或可能洞察出，用一般性的實驗，可以產(chǎn)生本文所述的特異物質(zhì)和所述程序的的各種同等物。這些同等物可以被認為在本發(fā)明范圍內(nèi)，而且在以下權利要求的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人格里高利·S·帕里(ii)發(fā)明名稱具有抗巨細胞病毒活性的寡核苷酸(iii)序列數(shù)目24(iv)聯(lián)系地址(A)收信人Lappin & Kusmer(B)街道200 State Street(C)城市波士頓(D)州馬薩諸塞州(E)國家美國(F)郵編02109(v)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Kerner，Ann-Louise(B)注冊號33,523(C)案號/文檔號HYZ-020PCT(ix)通訊信息(A)電話617-330-1300(B)傳真617-330-1311(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO1TGGGGCTTAC CTTGCGAACA 20(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO2GACGTGGGGC TTACCTTGCG 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO3TCTTCAACGA CGTGGGGCTT 20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈
(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO4GACGCGTGGC ATGCTTGGTG T 21(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO5AGGTTGGGGT CGACGCGTGG C 21(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO6GGCTGAGCGG TCATCCTCGG A 21(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否
(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO7CGGGACTCAC CGTCGTTCTG 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAGGAGAGC CTACAGACGG 20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO9AGTAACGCAC CGTCGGTGCC 20(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO10CAACGACGTG GGGCTTACCT 20(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO11ACCCCTGCTT ACTGGTGAGA 20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO12GTTGTTTTTA CCTGAAACCC 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO13CCGAACGGCG GTTTCTCCAC 20(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO14CTTGCGATCC ATCCCGGACA G 21(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO15CTCCGAGAGG CGCGTCTTGC 20(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO16ACGAGCGTCA TCGTCGCGCC GG 22(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度22堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA
(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO17CATCGTCGCG CCGGCACGAT GC 22(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO18GCGAAACGAC ATGGCCAAAT C 21(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO19GCGCGTGGGT GCCATACTCT T 21(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO20CCGTTGCGCT GGGCCATGGG 20(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO21CATGGGCGCC GGACACCTGC 20(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO22AAATCATCTC TGACGTAGCG20(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO23GCTCGCTACG CTCGCTACGT C21(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對
(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓樸結(jié)構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO24GCGTTTGCTC TTCTTCTTGC G 2權利要求
1.長度為15-50個核苷酸的合成寡核苷酸，它能夠與來自巨細胞病毒基因UL36，UL84，UL101x-102或UL112-113的RNA或DNA至少部分特異雜交。
2.權利要求1中所述的寡核苷酸，它是經(jīng)過修飾的。
3.權利要求2所述的修飾的寡核苷酸，含有至少一個選自于如下一組的核苷酸間鍵合硫代磷酸酯，2-O-甲基，烷基膦酸酯，或以上的組合。
4.權利要求1所述的寡核苷酸，長度為15-30個核苷酸。
5.權利要求1所述的寡核苷酸，含有至少一個脫氧核糖核苷酸。
6.權利要求1所述的寡核苷酸，含有至少一個核糖核苷酸。
7.權利要求6所述的寡核苷酸，含有至少一個核糖核苷酸。
8.權利要求1所述的寡核苷酸，針對于UL36的外顯子/內(nèi)含子交界處。
9.權利要求8所述的寡核苷酸，具有序列表的SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或SEQ ID NO3所述的核酸序列。
10.權利要求1所述的寡核苷酸，針對于UL84的推測的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)。
11.權利要求10所述的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所述的核酸序列。
12.權利要求1所述的寡核苷酸，針對于UL101x的推測的轉(zhuǎn)譯起始區(qū)。
13.權利要求12所述的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID NO6所述的核酸序列。
14.權利要求1所述的寡核苷酸，針對UL112-113外顯子/內(nèi)含子交界處。
15.權利要求14所述的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID NO7，SEQ ID NO8或SEQ ID NO9所述的核酸序列。
16.具有抗人類巨細胞病毒活性的合成的寡核苷酸，所述的抗性通過與巨細胞病毒基因UL36，UL84，UL101x-102或UL112-113的轉(zhuǎn)錄子的一部分雜交而產(chǎn)生。
17.含有權利要求1所述的寡核苷酸及一種藥物學可接受載體的藥物組合物。
18.治療或防止人類巨細胞病毒感染細胞的方法，該方法包括給細胞使用治療劑量的權利要求17所述的藥物組合物。
19.制備突變的DNA復制缺陷的巨細胞病毒的外遺傳等同物的方法，包括給被巨細胞病毒感染的細胞使用與巨細胞病毒基因UL36，UL84或UL101x-102互補的寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類長為15-50個核苷酸的合成寡核苷酸，它可至少部分與來自巨細胞病毒基因UL36、UL84、UL101x-102或者UL112-113的RNA或DNA特異雜交。同時公開了包括本發(fā)明的寡核苷酸的藥物組合物以及應用該寡核苷酸抑制巨細胞病毒感染的方法。
文檔編號C07H21/00GK1154702SQ95194344
公開日1997年7月16日 申請日期1995年5月19日 優(yōu)先權日1995年5月19日
發(fā)明者格里高利·S·帕里 申請人:海布里登公司