專利名稱：一種抗人巨細胞病毒藥物及其在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗病毒藥物，特別是抗人巨細胞病毒藥物。
人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)在人群中感染十分普遍，對于免疫功能受損如器官移植和愛滋病患者，可引起肺炎、肝炎、胃腸炎及視網膜病等，常可危及病人的生命[Jacobson MA,Mills J.Seriouscytomegalovirus disease in the acquired immunodificiency syndrome(AIDS).Clinical findings,diagnosis,and treatment.Ann Intern Med,1988,108(4):58594]。而妊娠婦女孕早期原發(fā)HCMV感染可造成流產、早產、死胎、畸形、IUGR、智力低下及聽力損害等[Stagno S,et al.Primarycytomegalovirus infection in pregnancy:incidence,transmission to fetus,and clinical outcome.JAMA,1986,256:1904]。目前，臨床上試用于抗HCMV的藥物眾多，但療效均不理想[李紅，董永綏.人巨細胞病毒感染防治進展。國外醫(yī)學兒科學分冊，1995,22(5):231～234]。最新研制的新藥——更昔洛韋(Ganciclovir,GCV；丙氧鳥苷，DHPG)被認為是最有前途的抗HCMV化療劑，在國外已廣泛應用于器官移植和愛滋病患者HCMV感染的臨床預防和治療。但其副作用大，價格昂貴，且已有耐藥性毒株出現(xiàn)，使其臨床應用受到限制[MarkhamA & Faulds D.Ganciclovir-An update of its therapeutic use incytomegalovirus infection.Drugs,1994,48(3):455],HCMV感染也是導致器官移植失敗和愛滋病患者死亡的重要原因之一，因此抗HCMV藥物的研究已受到國際上的廣泛重視。80年代初期曾先后試用阿糖腺苷(Ara-A)、阿昔洛韋(Acyclovir.ACV)、白細胞干擾素(IFA)等防治HCMV感染，其治療效果均不理想，且毒副作用較大[Adair JC,Gold M,Bond RE.Acyclovirneurotoxicity:clinical experience and review of the literature.South MedJ,1994,87(12):1227].更昔洛韋(GCV)是最新研制的一種高效、選擇性強的廣譜抗皰疹病毒化療劑，于1982年首次合成，它由ACV衍生而來，是脫氧鳥苷的結構類似物，其作用比ACV強50～100倍，且更易吸收，對HCMV的抑制作用是至今發(fā)現(xiàn)的抗病毒藥中活性最強的藥物之一[Stratta RJ,Shaefer MS,CushingKA,et al.Successful prophylaxis of cytomegalovirus disease after primaryCMV exposure in liver transplant recipients.Transplantation,1991.51(1):90]。臨床試驗表明其治療AIDS及器官移植者繼發(fā)HCMV感染，總有效率達70％[Markham A&Faulds D.Ganciclovir-An update of itstherapeutic use in cytomegalovirus infection.Drugs,1994,48(3):455]。但目前文獻報道臨床病例數(shù)有限，其結論亦并非一致。而且GCV價格昂貴，可引起骨髓抑制、肝功異常、腎功能不全等多系統(tǒng)嚴重并發(fā)癥使某些病例被迫中止治療；還可抑制精子產生和導致婦女永久性不孕，因此該藥禁用于孕婦及哺乳期婦女[崔志平節(jié)譯?？共《舅帯袈屙f。國外醫(yī)藥——合成藥、生化藥、制劑分冊，1990,11(6):370]，其臨床研究有待深入。婦女懷孕期間，由于免疫抑制，亦是HCMV的高發(fā)人群，活動性感染率可達11.23％，其垂直傳播可對胎、嬰兒生長發(fā)育造成嚴重影響，但國內外尚無治療育齡婦女和孕婦HCMV感染的有效藥物。因此，如何對HCMV感染尤其是孕期感染進行有效的治了，是當前醫(yī)學界面臨的難題。
本發(fā)明的目的是提供一種用于治療HCMV感染，特別是孕期HCMV感染的中藥，使其具有能有效抑制HCMV引起的細胞病變和有效藥治療圍產期HCMV活動性感染，并能防止孕期HCMV感染的垂直傳播，保護胎兒免受感染，且無任何毒副反應，藥源豐富，經濟方便，安全范圍大，病人易于接受，減少低質兒的出生等優(yōu)點。
本發(fā)明提供的用于治療HCMV感染，特別是孕期HCMV感染的中藥，是以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比制成的藥劑，它可以是任何一種藥劑學上所說的劑型，其顆粒劑按以下方法制成(1)取處方中的魚腥草，加水10～15倍浸泡2小時，蒸餾5小時，收集揮發(fā)油0.5ml/kg以上，溶解于5～10倍乙醇中，密封，避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)取處方中的金銀花、大青葉、蒲公英加15倍量水浸泡45分鐘后，煎煮1.5小時，取汁，藥渣再加12倍量水煎煮1.5小時，取汁，合并煎液，靜置，過濾；濾液減壓濃縮至相對密度為1.10(60～65℃)，緩緩加入約2倍量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為65％(ml/ml)，靜置沉淀；取上清液，沉淀用少量65％乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收乙醇至無醇味、相對密度為1.05(60～65C)；加水1倍量充分攪拌，混勻，靜置沉淀完全，過濾，濾液用20％氫氧化鈉溶液調查pH值為5.0～5.5，減壓濃縮至相對密度為1.35～1.38(80～90℃)的清膏。取清膏1份，加入75～85％的乙醇，使含醇量約為15～20％，充分混勻，加糊精2.5份，天冬糖0.02份，制軟材，制顆粒，60～70℃干燥，整粒，置遠紅外烘烤箱中于60～70℃干燥4小時。
(3)將魚腥草揮發(fā)油乙醇液均勻噴入顆粒中，密閉24小時。
(4)檢驗，合格后分裝于鉛塑復合膜袋中，每袋10g。
體外實驗資料根據(jù)衛(wèi)生部藥政局93年7月頒布的《新藥臨床前研究指導原則匯編(藥學、藥理學、毒理學)》關于抗病毒試驗要求設計，采用病變抑制法進行。
(一)病毒和細胞HCMV AD169標準毒株，人胚肺成纖維細胞(HEL)。
(二)藥物本發(fā)明顆粒制劑為受試藥物，每支20ml，每毫升含生藥量1g；更昔洛韋(GCV)為陽性對照藥(購自湖北省醫(yī)學工業(yè)研究所)，粉針劑，250mg/支。(三)實驗方法1．將兩種藥物倍比稀釋，測定其在不同濃度下的抗HCMV作用。
2．設定藥物濃度(本發(fā)明顆粒4mg/ml,GCV 25ug/ml)，測定在一定藥物濃度下、不同時間的抗HCMV作用。
3．本發(fā)明藥物對HCMV晚期mRNA的抑制作用HEL感染HCMV AD169后，于加藥的不同時間提取培養(yǎng)物的總RNA，采用定量RT-PCR法測定HCMV晚期mRNA。RT-PCR試劑盒購自美國Promega公司，操作按試劑盒說明進行，其結果在激光密度掃描儀上掃描分析，以樣本的擴增條帶與陽性對照條帶的掃描峰面積比表示HCMV晚期mRNA的表達水平。
(四)結果見表1、2、3表1 本發(fā)明藥物和GCV在不同濃度下抗HCMV的結果比較本發(fā)明藥物組(mg/ml)GCV組(ug/ml) 對照組20 10 5 2.5 1.25100 50 25 12.56.25 3.125 病毒 藥物-± + ++ +++ - - ± ±～+ ++++ +++ -(注細胞病變的記錄——“-”細胞無病變，“+”25％細胞病變，“++”50％細胞病變，“+++”75％細胞病變，“++++”100％細胞病變。)表1可見本發(fā)明藥物最大無毒濃度(TD0)=20mg/ml，最小有效濃度(MTC)=5mg/ml；治療指數(shù)(TI)=4；半數(shù)有效濃度(IC50)=5mg/ml。陽性對照藥GCV的TD0=100ug/ml,MTC=12.5ug/ml,TI=8,IC50=12.5ug/ml。在TD0和MTC之間，隨著藥物濃度下降，本發(fā)明藥物與GCV抑制HCMV的作用減弱；兩者IC50與病毒對照相比，病變程度有顯著差異。表2 本發(fā)明藥物和GCV在不同感染時間抗HCMV的結果比較24 48 72 96 120144168(小時)病毒對照 -+++++++++++++本發(fā)明藥物 --++ + + ++GCV --++ + + ++表2可見，病毒對照組在感染48小時就已出現(xiàn)細胞病變(CPE)，并隨感染時間的延長不斷加重，感染168小時全部發(fā)生病變；而加藥的兩組感染后72小時才出現(xiàn)CPE，并且進展緩慢，感染168小時后CPE僅為“++”，明顯輕于病毒對照組。表3本發(fā)明藥物和GCV干預不同時間HCMV感染細胞晚期mRM的表達水平12 24 48 72 96 120(小時)病毒對照0.440.560.580.640.840.87本發(fā)明藥物 0.350.270.340.410.540.65GCV0.390.300.290.380.440.58表3可見，本發(fā)明藥物及GCV對HCMV晚期mRNA的抑制作用在感染12小時就已出現(xiàn)，在24～48小時達到高峰，此后隨感染時間的延長，晚期mRNA的水平又趨上升，但仍明顯低于病毒對照組，且兩者的抑制作用基本相似。
臨床應用資料
㈠、對象前來進行優(yōu)生咨詢的有異常孕產史的未孕婦女，及有發(fā)熱、皮疹等病毒感染全身癥狀的孕婦。
㈡、本發(fā)明藥物治療指征確診HCMV活動性感染者(外周血ELISA法檢測HCMV-IgM陽性，RT-PCR檢測HCMV晚期mRNA亦為陽性)，并已排除遺傳、內分泌、生殖道發(fā)育異常及環(huán)境因素所致既往異常妊娠，患者自愿進行治療。
㈢、用藥方法本發(fā)明藥物顆粒沖劑，口服，每日三次，連服2周為一個療程，停藥3～7天后復查。
㈣、分組自愿接受治療者列為觀察組，未接受治療者列為對照組。將兩組結果進行統(tǒng)計分析，㈤、本發(fā)明藥物顆粒療效觀察指標檢測外周血HCMV-IgM、晚期mRNA轉陰為治愈。孕婦則同時監(jiān)測整個孕期胎兒宮內發(fā)育及出生時、出生后情況，PCR技術檢測胎兒附屬物(絨毛、羊水、臍血、胎盤)及新生兒外周血和一周內尿HCMV DNA，以確定有無宮內感染。
㈥、結果1．本發(fā)明藥物治療1～2個療程，觀察組外周血HCMV-IgM、晚期mRNA轉陰率明顯高于對照組，差異有顯著性(P＜0.005)。見表4。表4 本發(fā)明藥物治療1～2個療程病例轉陰率育齡婦女①孕 婦②合 計③總例數(shù) 轉陰 ％總例數(shù) 轉陰 ％總例數(shù) 轉陰 ％觀察組41 3278.054132 78.058264 78.05對照組8 0 0.00 123 25.00203 15.00①X2=14.72 P＜0.005 ②X2=9.40 P＜0.005 ③X2=28.36 P＜0.0052.防治宮內感染的效果 宮內傳播率觀察組17.95％(7/39)、對照組65.52％(19/29)，差異具有極其顯著性(X2=15.94 P＜0.005)。觀察組感染兒異常妊娠結局42.86％(3/7)、對照組78.95％(15/19)。觀察組11例治療轉陰后再次受孕，孕期無再次感染，其中7例足月分娩，無宮內傳播，胎兒生長發(fā)育無異常。
體外抑毒實驗表明該藥能有效抑制HCMV引起的細胞病變，其作用與GCV接近；臨床療效觀察表明該藥治療圍產期HCMV活動性感染有效率達78.05％，并能防止孕期HCMV感染的垂直傳播，保護胎兒免受感染；用藥期間未見任何毒副反應。而且充分利用我國豐富的中草藥資源，經濟方便，安全范圍大，毒副作用極小，病人易接受，具有廣闊的應用前景。本發(fā)明藥物是治療孕前及孕期活動性HCMV感染的一種很有價值，很有前途，安全有效的藥物。該藥的應用對減少低質兒的出生，促進優(yōu)生工作具有重要意義。
實施例1(1)取處方中的魚腥草，加水10～15倍浸泡2小時，蒸餾5小時，收集揮發(fā)油0.5ml/kg以上，溶解于5～10倍乙醇中，密封，避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)取處方中的金銀花、大青葉、蒲公英加15倍量水浸泡45分鐘后，煎煮1.5小時，取汁，藥渣再加12倍量水煎煮1.5小時，取汁，合并煎液，靜置，過濾；濾液減壓濃縮至相對密度為1.10(60～65℃)，緩緩加入約2倍量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為65％(ml/ml)，靜置沉淀；取上清液，沉淀用少量65％乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收乙醇至無醇味、相對密度為1.05(60～65℃)；加水1倍量充分攪拌，混勻，靜置沉淀完全，過濾，濾液用20％氫氧化鈉溶液調查pH值為5.0～5.5，減壓濃縮至相對密度為1.35～1.38(80～90℃)的清膏。取清膏1份，加入75～85％的乙醇，使含醇量約為15～20％，充分混勻，加糊精2.5份，天冬糖0.02份，制軟材，制顆粒，60～70℃干燥，整粒，置遠紅外烘烤箱中于60～70℃干燥4小時。
(3)將魚腥草揮發(fā)油乙醇液均勻噴入顆粒中，密閉24小時。
(4)檢驗，合格后分裝于鉛塑復合膜袋中，每袋10g。
實施例2以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比按經典方法即常規(guī)方法制成口服液。
事實例3以金銀花、太青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比按經典方法即常規(guī)方法制成丸劑。
權利要求
1．一種抗人巨細胞病毒藥物，它是以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料，按1∶1∶1∶1的重量配比制成的藥劑。
2．根據(jù)權利要求1所述的抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于所說的藥劑是任何一種藥劑學上所說的劑型。
3．根據(jù)權利要求2所述的抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于所說的藥劑是顆粒劑。
4．根據(jù)權利要求3所述抗人巨細胞病毒藥物的制備方法，其特征在于(1)取處方中的魚腥草，加水10～15倍浸泡2小時，蒸餾5小時，收集揮發(fā)油0.5ml/kg以上，溶解于5～10倍乙醇中，密封，避光保存?zhèn)溆茫?2)取處方中的金銀花、大青葉、蒲公英加15倍量水浸泡45分鐘后，煎煮1.5小時，取汁，藥渣再加12倍量水煎煮1.5小時，取汁，合并煎液，靜置，過濾；濾液減壓濃縮至相對密度為1.10(60～65℃)，緩緩加入約2倍量乙醇，邊加邊攪拌，使含醇量為65％(ml/ml)，靜置沉淀；取上清液，沉淀用少量65％乙醇洗滌，過濾，洗液與濾液合并，減壓回收乙醇至無醇味、相對密度為1.05(60～65℃)；加水1倍量充分攪拌，混勻，靜置沉淀完全，過濾，濾液用20％氫氧化鈉溶液調查pH值為5.0～5.5，減壓濃縮至相對密度為1.35～1.38(80～90℃)的清膏。取清膏1份，加入75～85％的乙醇，使含醇量約為15～20％，充分混勻，加糊精2.5份，天冬糖0.02份，制軟材，制顆粒，60～70℃干燥，整粒，置遠紅外烘烤箱中于60～70℃干燥4小時；(3)將魚腥草揮發(fā)油乙醇液均勻噴入顆粒中，密閉，裝袋。
5．根據(jù)權利要求1、2、3、4所述抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于在制備抗人巨細胞病毒藥物中的應用。
6．根據(jù)權利要求1、2、3、4所述的抗人巨細胞病毒藥物，其特征在于在制備用于治療孕期人巨細胞病毒感染藥物中的應用。
全文摘要
一種抗人巨細胞病毒藥物,其特征在于它是以金銀花、大青葉、蒲公英、魚腥草為原料,按1:1:1:1的重量配比制成的藥劑,體外抑毒實驗表明該藥能有效抑制人巨細胞病毒引起的細胞病變,其作用與更昔洛韋(GCV)接近;臨床療效觀察表明該藥治療圍產期人巨細胞病毒活動性感染有效率達78.05%,并能防止孕期HCMV感染的垂直傳播,保護胎兒免受感染。
文檔編號A61P31/12GK1302637SQ0011430
公開日2001年7月11日 申請日期2000年1月1日 優(yōu)先權日2000年1月1日
發(fā)明者聞良珍, 邢瑋, 陳素華, 曾萬江, 鄧東銳, 凌霞珍, 李鳴真, 葉望云, 陸付耳 申請人:同濟醫(yī)科大學附屬同濟醫(yī)院