專利名稱：T細胞測定的制作方法
t細;i包測定
本發(fā)明涉及新T細胞測定方法，具體而言是其中通過除去調(diào)節(jié)T細胞 以增加對測試抗原的T細胞應答。本發(fā)明還涉及新測定法，其中為優(yōu)化檢 測T細胞應答，改變與抗原或其他樣品孵育時間安排。具體而言，本發(fā)明 涉及用蛋白質(zhì)樣品的T細胞測定，其中使用多時間點測量T細胞增殖或細 胞因子釋放，實現(xiàn)T細胞表位的優(yōu)化檢測。此外，本發(fā)明涉及為優(yōu)化檢測 T細胞表位，改變抗原與抗原遞呈細胞(APC)或T細胞或APC和T細胞 二者孵育時間安排的T細胞測定。本發(fā)明尤其涉及用免疫調(diào)節(jié)性或毒性樣 品的T細胞測定，所述樣品直接影響APC、 T細胞，或者APC和T細胞 二者。本發(fā)明特別用于測量對人類接觸的藥物、變應原、刺激物或其他物 質(zhì)的人類T細胞應答。
T細胞測定提供了用于測量對抗原和其他樣品的T細胞應答的有效方 法，尤其在人類中。這種測定被認為是"體外，，測定，其中血樣從供體中取 出并處理，使得血細胞原代培養(yǎng)物直接用于這種測定。對于肽和蛋白質(zhì)樣 品，體外人類T細胞測定已經(jīng)用于檢測人類T細胞表位，其有幾個目的， 包括評估這種樣品在人類中的潛在免疫原性(Jones等，J. /M/^/eraw C^oA:/恥i^^., 24巻(2004) p560- 572)，確定蛋白質(zhì)序列中T細胞表位然后 包含入疫苗，和確定蛋白質(zhì)序列中T細胞表位然后除去以避免免疫原性 (Jones等，《/./wtez/erow Cytoh力ei e&， 24巻(2004) p560誦572,和Jones等，丄 77 raw6. 巻3 (2005) pl-10)。當前的T細胞測定方法廣泛包括了 ，
在測量T細胞應答前用APC和T細胞混合物孵育肽或蛋白質(zhì)樣品，或者 在測量T細胞應答前用APC孵育肽或蛋白質(zhì)樣品然后加入T細胞。在這 兩種測定中，使用多個血樣單獨平行測試每個單獨的肽或蛋白質(zhì)樣品，然 后通常在單一時間點測量T細胞應答。通常通過引入脈沖的放射性標記如 氚化胸腺嘧啶(3HTdR)到增殖性T細胞("T細胞增殖")，或者通過從激活的T細胞釋放細胞因子例如IL-2 ("細胞因子釋放")，測量T細胞應答。
檢測T細胞表位的當前T細胞測定方法受限于下述因素的一個或兩 者低靈敏度和/或由免疫調(diào)節(jié)性或毒性樣品的干擾，所述樣品抑制、刺激 或以其他方式改變APC、 T細胞或者APC和T細胞二者。像這樣，當前T 細胞測定方法可能不^r測在某些肽和蛋白質(zhì)樣品中的一些或全部T細胞表 位，并可能不適用于測量對免疫調(diào)節(jié)性或毒性樣品的T細胞應答，所述樣 品包括肽和蛋白質(zhì)樣品、含有有機分子的非蛋白質(zhì)樣品、和蛋白質(zhì)和非蛋 白質(zhì)樣品的制劑，其中所述制劑本身可以具有免疫調(diào)節(jié)性或毒性。
關于靈敏度，體外T細胞測定低靈敏度的主要原因可能與測定混合物 中因子有關，所述因子(包含細胞類型或測定培養(yǎng)物中因子)降低了對測 試抗原的T細胞應答，或由測試抗原或測試樣品本身引起。體外T細胞測 定低靈敏度的進一步原因可能與對肽或蛋白質(zhì)樣品中T細胞表位的T細胞 應答的動力學有關，其中個體T細胞表位可在不同時間誘導T細胞應答。 對于其中使用單一時間點的T細胞增殖，加入某種樣品后的T細胞增殖， 可能一方面在最初時快速，然后在加入脈沖》文射性標記時下降，以致沒有 明顯增殖反應被檢測。另一方面，T細胞增殖在加入某種其他樣品后可能 在最初時(在加入脈沖放射性標記時)緩慢，使得沒有明顯增殖反應被檢 測，即使接下來的增殖變得明顯。對于其中使用單一時間點的細胞因子釋 放，加入某種樣品后的細胞因子產(chǎn)生，可能一方面在最初時快速，但這些 細胞因子可能接下來被測定混合物中的細胞消耗，使得在單一測定時間點 沒有明顯細胞因子可檢測得到。另一方面，細胞因子釋放可最初時緩慢， 使得在單一測定時間點沒有明顯增殖反應檢測得到，即使接下來的細胞因 子釋放變得明顯。增殖或細胞因子釋放的動力學可被一系列因素影響，例 如在不同血樣間T細胞應答中的同種異型差異、APC攝取和處理的效率和 動力學、APC中肽或蛋白質(zhì)樣品的蛋白水解效率、肽或蛋白質(zhì)樣品中T細 胞表位的強度和頻率、T細胞表位對特定II類MHC同種異型的親和力、 T細胞受體對肽-II類MHC復合物識別效率、共刺激細胞表面分子的頻率 和濃度、共刺激細胞因子的濃度、測定混合物中其他細胞例如008+T細 胞或抑制性T細胞的刺激、記憶T細胞的存在和一些樣品(例如小肽)直
6接加載到APC表面表達的II類MHC分子上的能力。
關于免疫調(diào)節(jié)性或毒性樣品對T細胞測定的干擾，這類樣品可直接結(jié) 合APC、 T細胞或APC和T細胞二者或被APC、 T細胞或APC和T細胞 二者吸收。這類樣品能負-或正_調(diào)節(jié)APC和/或T細胞的正常免疫功能， 使得檢測不到針對樣品的T細胞表位或T細胞應答。另一個T細胞測定被 免疫調(diào)節(jié)性樣品千擾的原因是通過對APC、 T細胞或APC和T細胞二者 的毒性作用。T細胞測定被免疫調(diào)節(jié)性樣品干擾的其他原因包括正-或負 -調(diào)節(jié)APC或T細胞亞型，例如正-調(diào)節(jié)CD8+ T細胞或抑制性T細胞。
為有效開發(fā)T細胞測定在一定范圍的應用(尤其關于人類藥物)，需 要用于優(yōu)化檢測T細胞表位的更靈敏的T細胞測定方法，并且也需要可用 于免疫調(diào)節(jié)性或毒性樣品的T細胞測定。
本發(fā)明是部分基于，從T細胞測定混合物中除去調(diào)節(jié)T細胞會導致針 對測試抗原的輔助性T細胞應答明顯增加的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供了用 于優(yōu)化檢測T細胞表位的新T細胞測定方法，其中抑制性T細胞從培養(yǎng)物 中除去導致針對測試抗原的T細胞應答增加。此外，本發(fā)明提供了用于優(yōu) 化才全測調(diào)節(jié)T細胞和/或APC的蛋白質(zhì)或?qū)細胞和/或APC有毒性效應 的蛋白質(zhì)的免疫原性的新T細胞測定方法。本發(fā)明還可用于檢測非蛋白質(zhì) 化合物，所述化合物可直接通過T細胞受體、或者通過共價結(jié)合到蛋白質(zhì)、 或者通過直接結(jié)合到被II類MHC分子結(jié)合的肽、或者通過直接結(jié)合到II 類MHC分子來刺激T細胞。具體而言，本發(fā)明提供了其中在測量針對測 試抗原的應答前，從培養(yǎng)物除去了通常負-調(diào)節(jié)效應T細胞應答的調(diào)節(jié)T 細胞的方法。此外，本發(fā)明提供了用多時間點測量的方法，其中與抗原或 其他樣品孵育后檢測T細胞應答的時間點被優(yōu)化。
本發(fā)明第一方面提供了測量針對測試物質(zhì)的輔助性T細胞應答的方 法，包括下列步驟
(a) 從獲自生物體的樣品中分離抗原遞呈細胞(APC )和T細胞；
(b) 從所分離細胞中排除調(diào)節(jié)T細胞；
(c) 使所述APC和在(b)中獲得的排除了調(diào)節(jié)T細胞的細胞與所述測試物質(zhì)一起孵育；以及
(d)測定對所述測試物質(zhì)的T細胞應答。
APC和T細胞通常從血樣中獲得。然而，不同來源的T細胞和/或APC 能被用于本發(fā)明，包括來源于扁桃體、派伊爾氏淋巴集結(jié)、腫瘤和細胞系 的那些。在一個優(yōu)選實施方案中，所述方法的執(zhí)行使用了人類外周血單核 細胞(PBMC)。
本文使用的術(shù)語"排除"是指除去一些調(diào)節(jié)T細胞。這可通過物理去除 細胞或通過抑制或調(diào)節(jié)T細胞的作用來進行。因此降低了耙標T細胞活性。 優(yōu)選75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 97%、 98%或99%的耙標T細胞活 性通過排除處理除去。
本領域技術(shù)人員應理解，作為本發(fā)明部分， 一定范圍的用于排除或靶 向調(diào)節(jié)T細胞的方法可用作通過CD25 hi排除調(diào)節(jié)T細胞的替代方法。也 應理解本發(fā)明也包括調(diào)節(jié)T細胞測定中調(diào)節(jié)T細胞的效應的方法。對于排 除或靶向，調(diào)節(jié)T細胞表面表達的分子可結(jié)合或替代CD25用于排除這些 細胞。這種分子可包括但不限于GITR、 CTLA-4、 CD103、 CC趨化因子 受體4、 CD62L和CD45RA，并且也可包括表面結(jié)合的細胞因子或細胞因 子例如IL-10和TGFP的表面形式。排除可通過幾種方法實現(xiàn)，所述方法 包括結(jié)合到特異性抗體以將調(diào)節(jié)T細胞吸附到固相或引起這種調(diào)節(jié)T細胞 的破壞或抑制，或另外從其他T細胞中分離調(diào)節(jié)T細胞用于T細胞測定。 對于調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)T細胞分泌的分子可被防止這種分泌或可在分泌后被阻斷 /抑制/破壞。這種分子可包括細胞因子例如IL-IO、 IL-4、 IL-5和TGF|3， 并且這種分子可用結(jié)合到這種分子上的有機或者無機分子(例如抗體或可 溶受體)，或者通過抑制性核酸例如siRNA、反義寡核苦酸或者遞送入調(diào) 節(jié)T細胞或在這種細胞中誘導的其他核酸阻斷。以打破這些細胞的抑制功 能的方式，調(diào)節(jié)T細胞活性的調(diào)節(jié)也可通過靶向調(diào)節(jié)T細胞上的受體或其 他表面分子來實現(xiàn)，所述受體或其他表面分子包括但不限于GITR、 CTLA-4、 CD103、 CC趨化因子受體4、 CD62L和CD45RA。這種功能抑 制可例如，通過具有激動劑功能或可阻斷配基-靶標相互作用使得調(diào)節(jié)T 細胞沒有除去但卻無法實施功能的特異性抗體實現(xiàn)。調(diào)節(jié)T細胞活性的調(diào)節(jié)也可通過，阻斷調(diào)節(jié)T細胞分泌分子的靶標受 體，或通過阻斷由這種分泌分子激活或負-調(diào)節(jié)的途徑實現(xiàn)。同樣對于調(diào)節(jié)，
調(diào)節(jié)T細胞可被直接抑制，例如通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子(例如foxp3)或阻斷 與調(diào)節(jié)T細胞相關的其他功能或途徑。這種抑制或阻斷可通過有機或無機 分子、或通過抑制性核酸例如siRNA、反義寡核苷酸或遞送入調(diào)節(jié)T細胞 或在這種細胞中誘導的其他核酸實現(xiàn)。在其中有機、無機或核酸分子用于 抑制調(diào)節(jié)T細胞作用或以其他方式調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)T細胞，其中的所述分子本身 干擾T細胞測定的所有情況下，這種分子優(yōu)選從這種測定中除去或被修飾 到不千擾這種測定的形式。例如，用于除去調(diào)節(jié)T細胞分泌分子的特異性 抗體或蛋白質(zhì)，在T細胞測定前被選擇性除去或者以不干擾T細胞測定的 特定形式使用。例如對于人類T細胞測定，人類形式的抗體或蛋白質(zhì)被用 于避免針對自身抗體或蛋白質(zhì)的T細胞應答。
使用不調(diào)節(jié)T細胞和/或APC的測試抗原(通常是蛋白質(zhì)或肽而且也 可是非蛋白質(zhì)化合物)的本發(fā)明T細胞測定的主要步驟如下
(1) 從人類血樣中分離PBMC
(2) 可選擇地除去CD8 + T細胞
(3) 排除CD25h"T細胞
(4) 培養(yǎng)物與一種或多種濃度的測試抗原孵育，并且在一個或多個時 間點測試T細胞增殖和/或細胞因子釋放
本發(fā)明T細胞測定(其中測試抗原調(diào)節(jié)T細胞和/或APC)的主要步 驟如下
(1) 從人類血樣中分離PBMC
(2) 分離APC,通常通過粘著至塑料，使用細胞因子誘導分化APC并 將測試抗原加入到APC
(3) 將通過預先排除CD25hl+T細胞和可選擇的CD8 + T細胞處理的自 體PBMC與APC混合
(4) 培養(yǎng)物與一種或多種濃度的測試抗原孵育，并且在一個或多個時間點測試T細胞增殖和/或細胞因子釋放
當測試物質(zhì)是對APC或T細胞不具有免疫調(diào)節(jié)性或毒性的肽或蛋白 質(zhì)樣品或非蛋白質(zhì)樣品時，血液能用作CD4'T細胞和APC (以單核細胞 和樹突狀細胞形式)的來源。通常選擇最能代表世界上種群或被研究種群 中表達的HLA-DR同種異型的數(shù)量和頻率的一組供體。在所述組中表達的 同種異型通常是全部主要HLA-DR等位基因(單個同種異型在世界種群中 表達的頻率〉5% )被良好表達的種群中表達的同種異型的〉80%?？蛇x擇地， 在所述組中表達的同種異型被選擇為過表達或包括HLA同種異型，所述 同種異型^皮認為與在研究的一種特殊疾病相關。在本發(fā)明一個優(yōu)選實施方 案中，PBMC通過密度梯度分級分離從血樣制備，并且隨后排除了 CD8 + T細胞和CD25hiT細胞，使得剩余的PBMC主要包括CD4 + T細胞(~ 70%) 和APC (單核細胞10-20%和樹突狀細胞1-3%)。排除了 CD8 + CD25h4々 PBMC在細胞培養(yǎng)中建立，并且加入一種或多種肽或蛋白質(zhì)樣品或非蛋白 質(zhì)樣品并孵育培養(yǎng)物。
測量T細胞應答能在一個固定時間點或者在多個時間點進行。這些時 間點通過測量針對相似樣品或最佳物質(zhì)的T細胞應答動力學可預先確定。
用于測定的最佳條件能通過使用最佳物質(zhì)確定。本文使用的"最佳物 質(zhì)"是已知為誘導T細胞應答的化合物，例如單個免疫調(diào)節(jié)性/毒性的肽/全 蛋白，其具有與被測試樣品相似的大小和結(jié)構(gòu)或具有與測試物質(zhì)相似性 質(zhì)。對于肽或蛋白質(zhì)樣品或非蛋白質(zhì)樣品，具有與被測試樣品相似的大小 和結(jié)構(gòu)的一種或多種肽(通常長度為9-40個氨基酸)或全蛋白或非蛋白 質(zhì)化合物，能被用作最佳物質(zhì)。測定最佳物質(zhì)，結(jié)果用于確定典型T細胞 應答的動力學。例如，在不同時間點測量T細胞應答，最通常是在加入樣 品后的第4-9天間，使用一系列不同的可選擇的測定的一種或多種。一 旦建立了針對最佳物質(zhì)的T細胞應答動力學，能確定一組測定時間點用于 隨后測試樣品。以這種方式，能以一個或多個合適時間點測定針對測試樣 品的T細胞應答?？蛇x擇地或另外地，二種或多種濃度用于建立針對最佳 物質(zhì)的T細胞應答動力學，并且隨后樣品能在這些濃度下測試。
使用許多不同測定，例如通過引入脈沖3HTdR (或被增殖性T細胞吸
10收的其他^:射性、熒光或化學發(fā)光化合物)的T細胞增殖、細胞因子如IL-2 或IFNTy的釋放、mRNA的轉(zhuǎn)錄改變增加的激活標記mRNA (activation marker mRNA)的轉(zhuǎn)錄、Ca2+流(Ca2+flux)和表型標記尤其是活化T細 胞標記的改變，能測定T細胞應答。通常，對于肽或蛋白質(zhì)樣品，通過在 加入樣品后第5、 6、 7和8天引入脈沖3HTdR,或通過測量加入樣品后8 天細胞因子釋放(特別是IL-2)(或通過3HTdR引入和細胞因子釋^:測量 二者)，測量T細胞應答。作為一個供選方案，尤其對于具有高度重疊序 列的肽(例如含有12個氨基酸重疊的蛋白質(zhì)序列中的15mer)，能使用引 入脈沖3HTdR和/或在單一時間點(通常加入測試肽后第7天)測量細胞 因子釋ii。郵匕連重疊月大(adjacent overlapping peptide)傾向于含有T細月包 表位，它們一起增加了 T細胞表位檢測的靈敏度。
當肽或蛋白質(zhì)樣品對于APC或T細胞具有免疫調(diào)節(jié)性或毒性時，要 處理從生物體獲得的樣品并且從其他細胞分離APC。這通常通過塑料粘著 實施，并且然后肽或蛋白質(zhì)樣品與這些APC—起孵育。APC能與細胞因 子例如白細胞介素4、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、肺瘤壞死因子a和 誘導成熟APC表型的白細胞介素la —起孵育。在使用預分級分離APC的 標準T細胞測定中的樣品通常需要樣品APC孵育時間達到48小時。優(yōu) 選地，通過在菌種生長培養(yǎng)基中孵育達到4天產(chǎn)生半成熟APC，所述培養(yǎng) 基含有白細胞介素4和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子。然后把包含免疫調(diào) 節(jié)性或毒性樣品的樣品加入到半成熟APC中并且孵育短暫時間。取決于樣 品的毒性或免疫調(diào)節(jié)功能，與半成熟APC的孵育時間可為3到10小時。 樣品APC孵育后，接下來通過重復沖洗半成熟APC除去外源性樣品。 通過與促炎刺激物例如腫瘤壞死因子或白細胞介素1或CD40配基或脂多 糖的一起孵育然后產(chǎn)生了成熟樣品脈沖APC (mature sample pulsed APC )。 加入自體T細胞，通常是由上述PBMC制備的排除了 CD4 + CD8-CD25hl 的T細胞，到成熟樣品-脈沖APC。排除CD4 + CD8 — CD25h'的T細胞與 成熟樣品脈沖APC以一系列進一步孵育時間點一起孵育。如上描述的最佳 物質(zhì)能用于以不同的APC孵育時間點和/或不同的T細胞孵育時間點建立 應答的動力學。用最佳物質(zhì)獲得的結(jié)果能用于確定一組用于后續(xù)測試樣品 的APC孵育和/或T細胞孵育時間點。以這種方式，能以一個或多個測定時間點檢測針對測試樣品的T細胞應答?？蛇x擇地或另外地，二種或多種 濃度用于建立針對最佳物質(zhì)的T細胞應答動力學，并且隨后樣品能在這些 濃度下測定。
當被測試的樣品是非蛋白質(zhì)物質(zhì)時，取決于非蛋白質(zhì)樣品是否對
APC、 T細胞或二者是免疫調(diào)節(jié)性或毒性，能使用上述方法中(即，對于 具有或不具有免疫調(diào)節(jié)性或毒性性質(zhì)的肽或蛋白質(zhì)樣品的方法)任一種。
對于免疫調(diào)節(jié)APC、 T細胞或二者的蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)樣品， 一個可 選擇的附加步驟是直接測試例如T細胞活化或APC分化的表型標志物的 正-或負-調(diào)節(jié)。T細胞活化典型標志物包括CD69、 CD25、 CTLA4和 GITR表達的變化，以及測量細胞內(nèi)Ca2+流。用以評估APC分化的通常 表型標志物包括II類MHC、 CD80和CD86，它們都在成熟APC上高度表 達。這些附加步驟能提供針對測試樣品的T細胞應答的動力學信息，該信 息協(xié)助確定為優(yōu)化4全測針對測試樣品的T細胞應答的測定時間點。
本發(fā)明的新體外T細胞測定方法有一系列應用，尤其關于人類使用的 藥物。對于有前景作為藥物應用的蛋白質(zhì)，本發(fā)明的T細胞測定通過^r測 蛋白質(zhì)序列的重疊肽能用于鑒定蛋白質(zhì)序列內(nèi)的T細胞表位。這種T細胞 表位的部位和強度則能用于評估所述蛋白質(zhì)在人類中的潛在免疫原性?？?選擇地，在用于人類前通過蛋白質(zhì)序列突變能隨后除去蛋白質(zhì)內(nèi)的T細胞 表位。某些蛋白質(zhì)內(nèi)T細胞表位通過本發(fā)明方法也可被鑒定，并且隨后通 過將T細胞表位序列(或其變體)加入蛋白質(zhì)疫苗中或者加入到作為疫苗 部分的其他組分，合并到疫苗中。
本發(fā)明的新T細胞測定能用于評估一系列類型分子的潛在免疫原性， 所述分子包括肽、蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)，所述非蛋白質(zhì)包括有機分子、脂質(zhì)、 碳水化合物或主要由二個或多個不同部分組成的分子，包括共扼物、混合 物和制劑。本發(fā)明的T細胞測定在藥物的研究、開發(fā)、制造和臨床試驗中 有廣泛應用。在研究方面例如，針對不同活性分子類似物的T細胞應答能 用于評估在人體中這些類似物的潛在免疫原性。這種T細胞應答因此能用 作選擇先導藥物(lead pharmaceutical)用于進一步開發(fā)的標準。在開發(fā)方 面例如，針對相同分子不同制劑的T細胞應答能被測定用于評估在人體中這些制劑的潛在免疫原性。這種T細胞應答因此能用作選擇最佳制劑用于 臨床試驗的標準。在制造方面例如，針對相同分子的制造批的T細胞應答 能一皮測定用于評估這些批的潛在免疫原性，并且也可評估批間分子中的任
何變化。這種T細胞應答能用作制造的質(zhì)量測試。在臨床試驗方面例如， 用患者血液能測定T細胞應答為了例如評估正在進行試驗的藥物的免疫原 性。本發(fā)明的T細胞測定也能被用于臨床試驗以測定任何針對藥物的T細 胞應答的MHC限制。
作為供選方案用于檢測T細胞表位，本發(fā)明的T細胞測定方法能用于 評估針對優(yōu)選用于人類的藥物的潛在不良反應。這些不良反應包括超敏反 應、變態(tài)反應、刺i敫、免疫抑制、超免疫刺〗敫(hyperimmune stimulation) 和注射部位反應。本發(fā)明的T細胞測定方法也能用于評估針對非藥物治療 (如移植)、環(huán)境物質(zhì)(如草花粉變應原)、糧食、化妝品和一系列工業(yè)生 產(chǎn)試劑(例如去污劑和酶)的潛在不良反應。
本領域技術(shù)人員應理解本發(fā)明T細胞測定方法中一系列改變能被使 用，而且這些改變是在本發(fā)明范圍內(nèi)，例如通過在分析T細胞應答中使用 多個測定時間點。例如，應理解在所述范圍內(nèi)有一系列本領域已知的用于 分析T細胞應答的不同方法，包括例如測定關于T細胞應答單個步驟的 MHC-肽結(jié)合(MHC-peptide binding)方法。作為供選方案分級分離如上 所述的T細胞和APC,可分級分離其他細胞用于本發(fā)明T細胞測定。T細 胞測定能用富集了朗格漢斯細胞的APC、不同的巨噬細胞亞型或APC的 不同亞型，和/或使用或富集T細胞不同亞型執(zhí)行。也應理解細胞因子能加 入到(或從中除去)本發(fā)明T細胞測定的測定混合物中，例如為了提高靈 敏度或負-或正-調(diào)節(jié)特異性APC或T細胞。T細胞測定的不同形式能被 用于本發(fā)明中，例如回憶測定形式(recall assay formats),其中T細胞用 APC預處理遞呈蛋白質(zhì)或肽而接觸了抗原，并且然后用相同或相關的蛋白 質(zhì)或肽再次免疫。
提供下列的實施例用于說明本發(fā)明，這些實施例不應理解為限制本發(fā) 明的范圍。
實施例1:排除CD25+T細胞對T細胞應答的影響外周血單核細胞是從獲自國家輸血服務中心(National Blood Transfusion Service) (Addenbrooke's醫(yī)院，Cambridge, UK)的i"建康it區(qū)供 體的血沉棕黃層中分離的，并且經(jīng)過Addenbrooke's醫(yī)院當?shù)匮芯總惱砦?員會(Addenbrooke's Hospital Local Research Ethics Committee )批準。PBMC 通過Ficoll (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK)密度離心從血沉棕黃層中 分離，并且寸吏用CD8+ RossetteSepTM (StemCell Technologies, Vancouver, Canada)排除CD8 + T細胞。通過使用基于Allset SSP-PCR的組織分型試 劑盒(Dynal, Wirral, UK)鑒定HLA-DR單體型，以及測定針對對照抗原 鑰孔威血藍素(KLH) (Pierce， Cramlington, UK)、破傷風類毒素(Aventis Pasteur, Lyon, France)和來自于流感HA (C32， aa 307-319)的對照肽表位的 T細胞應答，來表征供體。
CD25hl T細胞排除使用Miltenyi Biotech (Guildford, UK)的抗-CD25 微珠，使用廠商的標準方案和磁體實現(xiàn)。解凍每個供體10個小管，用30ml 2%滅活人血清/ PBS (Autogen Bioclear, Calne, Wiltshire, UK)重懸細胞。 5xl07細胞轉(zhuǎn)移到3 x 15ml管中，剩余細胞保持為全PBMC?？?CD25微 珠稀釋混合物用300W珠+ 4200jil分離緩沖液(0.5%人血清/2mM EDTA/PBS)制成。離心15ml管并且用500^1微珠稀釋混合物重懸。然后管 在上柱分離前在4。C保持5、 10或20分鐘。柱的裝備是通過將柱放置在 被支架支撐在其上的磁體中，加入2ml分離緩沖液到柱中并允許它滴出。 與珠孵育后加入10ml分離緩沖液，管以1500rpm離心7分鐘。然后用500^1 分離緩沖液重懸細胞并且加入到柱中，接著用分離緩沖液2 x lml沖洗。 柱流出液被收集于15ml管并含有排除了 CD25hl T細胞的部分。這些細胞 在計lt前以1500 rpm懸沉7分鐘并重懸于3ml AIMV培養(yǎng)基(Invitrogen, Paisley, UK)。
對細胞進行CD4和CD25染色，細胞數(shù)量用FACS檢測。每個細胞種 群的5-10 xl()5細胞放入U形底96孔板(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)中的一孔。所述板以1200 rpm懸沉4分鐘。棄去上清液，用50 ^抗體稀釋液重懸細胞。抗體稀釋液由在FACS緩沖液(P/。人血清/0.01% 疊氮化鈉/PBS)中1/50稀釋的FITC標記的抗-CD4抗體(R&D Systems,Minneapolis, USA) + 1/25稀釋的PE標記的抗-CD25抗體(R&D Systems, Minneapolis, USA)組成。對照孔也不染色、用同種型對照染色或用標記抗 體單染色。
在黑暗中板在水上孵育30分鐘。然后板以1200rpm懸沉4分鐘。棄 去上清液，細胞用200^1 FACS緩沖液重懸。這個過程重復二次，然后將 細胞轉(zhuǎn)移到FACS管。細胞通過FACS Calibur (Becton Dickinson, Oxford, UK),收集數(shù)據(jù)并基于大小、粒度和熒光標記進行分析。
增殖測定進行如下。全部的CD8 + T細胞排除的PBMC和CD8 + CD25hi 排除的PBMC以每孔2 x 105加入到lOOpl AIMV中。使用平底96孔板， 每個測試條件制定三個重復培養(yǎng)物。對于每種肽加入lOOpl到細胞培養(yǎng)物 中以得到5一終濃度。以lmCi/ml 3HTdR(GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK)脈沖各孔18小時前，細胞與肽和蛋白質(zhì)抗原一起孵育7天。
對于增殖測定，使用等于或大于2 (SI22)的刺激指數(shù)閾值，其中誘 導大于這個闊值的增殖應答的肽被認為是陽性的(虛線)。使用單向非配 對斯氏t檢驗(Student's Ttest)分析所有數(shù)據(jù)以確定變差系數(shù)(CV)、標 準偏差(SD )和顯著性(/ <0.05)。顯示SI22的所有應答與未處理培養(yǎng)基對 照相比有顯著差異(p〈0.05)。
結(jié)果顯示在

圖1中，圖1代表了在來自三個人類供體(475、 440和 462)的PBMC中針對一系列邊界(borderline)或弱T細胞表位(肽1 (PGQTATITCSGHALG) 、 2 (GDKFVSWYQQGSGQS) 、 6 (IKPEAPGCDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY) 、 9
(QSISNWL麗YQQKPG) 、 13 (KGLEWLVVIWSDGSS) 、 17 CAASGFTFSSFGMSWV) 、 20
(DTAVYYCAAAGVRAEDGRVRTLPSEYTFWGQGTQV) 和 24 (HQSLVIKLMPNITLL))，以及針對 一 對強T細胞表位(肽25 (PKYRNMQPLNSLKIAT)和26 (TVFYNIPPMPL)),和針對KLH抗原的T 細胞增殖應答。這個結(jié)果顯示在排除CD25hiT細胞后對于所有肽的T細胞 應答的增強。排除CD25hiT細胞后10或20分鐘測定得到對于所有肽的最 強應答。這些結(jié)果說明在排除CD25hiT細胞后極大增強T細胞應答，這在
15肽例如肽1和2的例子中，允許檢測之前評為邊界或T細胞應答陰性的肽 中的T細胞表位。
實施例2 -時程肽(Timecourse Peptide ) T細胞測定
來源于人類sTNFRl序列的野生型(WT)和T細i包表位排除肽(分 別是HLRHCLSCSKCRKEM和HARHCLSCSKCRKEM)被合成(P印scan Systems, Leystad, Netherlands),并使用實施例1的方法測試，其中排除了 CD8 + CD25hlT細胞的PBMC用于與來源于sTNFR-1的肷對比刺激來自20 個健康供體的T細胞應答的能力。通過加入lml含有2-4xl06/ml CD8+ CD25 hi T細胞排除的PBMC的AIMV培養(yǎng)基到24孔板(Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany)的每一孑L來建立大汆匕i咅養(yǎng)(bulk culture )。通過 加入lml IO^iM肽到每一個大批培養(yǎng)中(每個大批培養(yǎng)2ml,終濃度5pM) 使每種肽針對每個供體單獨測試。至于對比，為未處理和陽性(KLH)對 照建立額外的大批培養(yǎng)。在第6-9天除去大批培養(yǎng)中復制樣品(T胚細胞 的)，在圓底96孔板中評估增殖。數(shù)據(jù)用來評估在刺激后的第6、 7、 8 和9天針對每種肽T細胞應答的強度和動力學。此外，與TNFR1肽一起 培養(yǎng)8天后用IL-2 Elispot測定法來測定用于時程增殖測定的相同20個 健康供體的IL-2產(chǎn)生。Elispot板用70%乙醇預濕潤然后用IL-2捕獲抗 體(capture antibody) (R&D Systems, Minneapolis, USA) 4。C過夜包4皮。 用PBS (Invitrogen, Paisley, UK)洗板2次然后用1% BSA/PBS在室溫下 封閉2小時。在以每孔4xl()S細胞加入CD8 + CD25hl T細胞排除的PBMC 和終濃度是5pM的測試樣品前用PBS洗板。以37°C/ 5% C02 7天后，板 進行顯影。先用水然后用PBS沖洗后加入內(nèi)含IL-2檢測抗體(R&D Systems, Minneapolis, USA)的PBS/1% BSA, 37°C 2小時。用PBS進一步 沖洗后加入鏈霉抗生物素-AP (R&D systems, Minneapolis, USA)1.5小時， 再次洗板然后加入BCIP/NBT發(fā)色團(R&D systems, Minneapolis, USA) 30 分鐘。用水洗板，千燥后使用Immunospot Elispot分析儀、軟件版本3 (Cleveland, Ohio, USA)分析斑點數(shù)。
對于T細胞增殖和IL-2 Elispot測定，超過SI閾值2 (虛線)并且與 本底(*)有顯著(/ <0.05)差異的應答被認為是陽性。圖2中顯示結(jié)果指示在相同的3個人類供體(3 、 8和11)中，在增殖和IL - 2 Elispot測定二者中 WT肽產(chǎn)生應答，指示這種肽含有T細胞表位。增殖時程指示，對于這3 個供體，加入肽后7天檢測到最大增殖應答，并且每種情況下，如果增殖 應答在加入肽后8或9天時間點測量，則作為T細胞表位WT TNFR1肽會 被評為陰性。這些結(jié)果也顯示通過增殖和IL - 2 Elispot測量的T細胞應答 之間強相關性。
實施例3 -時程全蛋白T細胞測定
野生型(WT)和突變型T細胞表位排除的人類sTNFRl蛋白質(zhì)制備 為WO/2004/113387中描述的人類Fc融和蛋白，所述表位排除的蛋白含有 突變I10Q、 T20R、 H23P、 L56A、 L108T、 L110H和L149D。增殖和IL-2 Elispot測定如實施例2進行，除了加入lml sTNFRl蛋白質(zhì)到終濃度10 嗎/ml。圖3中顯示數(shù)據(jù)指示，對于增殖測定，在供體13和17中檢測到對 WT但不對突變型T細胞表位排除蛋白質(zhì)的顯著T細胞應答。在第8和9 天觀察到最大應答并且在第6天供體13或17都沒有顯示任何顯著應答。 對于IL - 2 Elispot測定，供體13和17 二者對WT但不對突變型表位排除 蛋白質(zhì)的T細胞應答再次陽性。此外，在這個測定中供體4對于WT蛋白 質(zhì)產(chǎn)生顯著應答。如實施例2—樣，結(jié)果進一步說明時程測定在檢測T細 胞應答中的功用，所述T細胞應答在這種情況下針對全蛋白。如實施例2 一樣，結(jié)果顯示通過增殖和IL - 2 Elispot測量的T細胞應答之間好的相關 性。
實施例4 -時程免疫調(diào)節(jié)蛋白T細胞測定
該實施例說明了本發(fā)明用于測量對免疫調(diào)節(jié)蛋白、人干擾素(3的T細 胞應答的情況，已知人干擾素|3正調(diào)節(jié)樹突狀細胞的抑制性分子，例如 HLA-G (Mitsdoerffer M等 /臉畫麵畫/. 2005 159:155-64)和B7-1H (Schreiner B等Wewra/wwm"o/. 2004 155:172-82)。為測試存在于IFNp序 列中的線性T細胞表位是否能在體外刺激T細胞，發(fā)展了用于把抗原載入 單核細胞衍生的樹突狀細胞中的修改方法，其中對于樹突狀細胞(DC)和 CD4+T細胞二者IFN卩的生物效應降到最低。
通過粘著到組織培養(yǎng)塑料，單核細胞從PBMC中分離(>90% CD14+)并在24孔板內(nèi)在具有5%熱滅活人AB血清(Autogen Bioclear, Calne, Wiltshire, UK)的AIM V培養(yǎng)基(生長培養(yǎng)基)中以近似每孔lx106 (24 孔板)的密度培養(yǎng)。單核細胞在含有人IL-4 (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)和GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)的生長培養(yǎng)基中孵育3 天。在第3天，44 pg/ml Betaferon (干擾素(3畫lb) (Schering AG, Berlin, Germany)加入到0.5ml的測試緩沖液加3%熱滅活人AB血清和25mM(終 濃度)HEPES pH8中。含有50嗎/ml KLH或沒有抗原(未處理細胞)的對 照孔在1ml PBS+0.01% Tween 20加3%熱滅活人AB血清(標準緩沖液)中 孵育。DC沖洗6次除去外源性IFN卩后，DC與抗原一起孵育6小時。然 后用含有TNFa (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)、 GM-CSF和IL-4的生長 培養(yǎng)基重懸細胞過夜。
在第4天，通過從PBMC (Dynal人CD4+陰性分離試劑盒(Dynal Human CD4+ Negative Isolation Kit) , Wirral, UK)中陰性選擇分離自體 CD8+ CD25 hi排除的CD4+T細胞，然后以每孔1 x 105加入到增殖和Elispot 板二者的DC中。Elispot板在顯影(如實施例2 )前要孵育6天，在通過 加入3HTdR (以lpCi/孔脈沖6小時)測量增殖前增殖板孵育7天。
如實施例2 —樣，選擇刺激指數(shù)^2的經(jīng)驗閾值用于增殖和Elipsot測 定，其中大于這個閾值的應答被認為陽性。此外也進行了統(tǒng)計學分析以確 定所述應答與未治療對照(*)是否具有顯著(p<0.05)差異。確定測定內(nèi) 變差程度的另外分析包括變差系數(shù)(CV)。
顯示在圖4中的結(jié)果指示，在29個供體中的4個中對于增殖測定以 及29個供體中的相同4個中對于IL - 2 Elispot測定的顯著T細胞應答。 這個數(shù)據(jù)顯示即使對于免疫調(diào)節(jié)蛋白，T細胞應答能被重復指示。
實施例5 -時程小分子T細胞測定
對比卡馬西平(Novartis Pharmaceuticals UK)和N-乙酰亞氨基芪 (N隱acetyl iminostilbene )(才艮才居Ying等《/ow/7 fif/ 爿〃ergy <3"<i C//w/ca/ /wm朋o/ogy 2006; 118:233-241合成的卡馬西平類似物)在一組健康供體中 刺激T細胞應答能力。根據(jù)實施例2的方法，二種化合物都以對于每個供 體單獨大批培養(yǎng)中25ng/ml被測試。簡要來說，使用在24孔板的每一孔中2-4xl06CD8+ CD25 hl T細胞排除的PBMC建立大批培養(yǎng)。在第5 - 8天從 大批培養(yǎng)中除去復制樣品(T胚細胞的)，在96孔板中評估增殖。數(shù)據(jù)用 來評估針對每種化合物T細胞應答的強度和動力學。
如實施例2—樣，S^2被用作陽性應答的閾值，并且使用參數(shù)和非參 數(shù)統(tǒng)計分析進一步分析數(shù)據(jù)以確定變差系數(shù)(CV)、標準偏差(SD)和顯 著性(/ <0.05)。任何給定的化合物被認為具有免疫原性，只要應答是統(tǒng)計學 上顯著的(pO.05)且SI^2。
結(jié)果顯示，當使用時程T細胞測定方法測試一系列濃度時，卡馬西平 代謝產(chǎn)物N-乙酰亞氨基芪與卡馬西平(已知為患者遲發(fā)型過敏反應的有效 誘導物)相比刺激較少的供體。顯然，使用單一時間點T細胞測定在大量 T細胞應答中是檢測不到的。實際上針對卡馬西平的大部分T細胞應答在 第5天被誘導，僅有一個額外應答在第6和7天檢測到。使用單一時間點 T細胞測定在第6、 7或8天評估對N-乙?；涂R西平的T細胞應答， 將不能區(qū)分這兩種化合物之間任何水平的免疫原性。
權(quán)利要求
1. 一種用于測量對測試物質(zhì)的輔助性T細胞應答的方法，其包括下列步驟(a)從獲自生物體的樣品中分離抗原遞呈細胞(APC)和T細胞；(b)從所分離的細胞中排除調(diào)節(jié)T細胞；(c)使所述APC和在(b)中獲得的排除了調(diào)節(jié)T細胞的細胞與所述測試物質(zhì)一起孵育；以及(d)測定對所述測試物質(zhì)的T細胞應答。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法還包括(ai)從其他細胞分離抗原遞呈細胞(APC);并且步驟(c)包括在 隨后加入排除了調(diào)節(jié)T細胞的細胞前，使所迷測試物質(zhì)與所分離的APC 一起孵育。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述APC在加入所述測試物質(zhì) 前用細胞因子處理。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3所述的方法，其中所述APC和T細胞來自于 外周血單核細胞(PBMC)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其中所述APC和T細胞 是人類的。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其中所述調(diào)節(jié)T細胞排 除了 CD25hi+T細胞。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的方法，其中所述T細胞排除了 CD8+T妾田月包。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其中所述T細胞應答通 過測量T細胞增殖、細胞因子釋放、T細胞轉(zhuǎn)錄變化和/或與T細胞活化關 聯(lián)的其他標志物的任何一個或多個來測定。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中T細胞增殖通過氖化胸腺嘧啶 的攝取來測量。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中細胞因子釋放通過IL-2和/或 IFNy的釋放來測量。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1至IO任一項所述的方法，其中所述T細胞應答 在孵育過程中超過一個的時間點測定。
12. 根據(jù)權(quán)利要求2至11任一項所述的方法，其中在添加所述排除了 T細胞的細胞前，使所述APC與所述測試物質(zhì)一起孵育超過一個時長。
13. 根據(jù)權(quán)利要求l-12所述的方法，其中所述測試物質(zhì)以多于一種濃 度測定。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的方法，其中測定最佳物質(zhì)以 確定用于測定所述測試物質(zhì)的最佳時間和/或濃度。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的方法，其中所述測試物質(zhì)是 蛋白質(zhì)。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的方法，其中所述測試物質(zhì)是肽。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至13任一項所述的方法，其中所述測試物質(zhì)是 非蛋白質(zhì)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述測試物質(zhì)是有機分子、 脂質(zhì)、^碳水化合物或主要由兩個或多個部分組成的分子，包括共軛物、混 合物和制劑。
19. 根椐權(quán)利要求1至16任一項所述的方法，其中所迷測試物質(zhì)具 有對T細胞和/或APC的免疫調(diào)節(jié)性或毒性。
20. 根據(jù)權(quán)利要求4至13任一項所述的方法，其中使用了表達的HLA 同種異型代表了世界上種群或被研究種群表達的>80 %的供體PBMC。
21. 根據(jù)權(quán)利要求4至13任一項所述的方法，其中供體PBMC用于 代表與被研究疾病關聯(lián)的特定HLA同種異型。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1至15任一項所述的方法，其中測試了蛋白質(zhì)序列的重疊肽，以鑒定所述蛋白質(zhì)序列中的T細胞表位。
23. 根據(jù)權(quán)利要求15至18任一項所述的方法，其中單獨測試了一系 列分子以評估相對免疫原性。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中使用相對T細胞應答作為選 擇用于進一步開發(fā)的先導藥物的基礎。
25. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法，其中分析測試物質(zhì) 以評估潛在免疫原性。
26. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法，其中分析測試物質(zhì) 的不同制劑以評估相對免疫原性。
27. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法，其中分析測試物質(zhì) 的不同制造批以評估潛在免疫原性。
28. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項所述的方法，其中使用患者血液
29. 根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項所述的方法鑒定蛋白質(zhì)序列中T 細胞表位的用途。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的方法評估測試物質(zhì)免疫原 性的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新T細胞測定方法，具體而言是其中通過除去調(diào)節(jié)T細胞以增加對測試抗原的T細胞應答。描述了其中為優(yōu)化檢測T細胞應答，改變與抗原或其他樣品孵育時間安排的新測定法。本發(fā)明特別用于測量對藥物、變應原、刺激物或其他物質(zhì)的人類T細胞應答。
文檔編號G01N33/50GK101427135SQ200780014169
公開日2009年5月6日 申請日期2007年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月2日
發(fā)明者勞拉·戴維斯, 弗朗西斯·J·卡爾, 艾麗森·魯斯特, 馬修·貝克 申請人:安迪拓普有限公司