本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種酶法水解商陸皂苷甲制備商陸皂苷乙的方法。

背景技術(shù)：

藥用植物商陸具有逐水消腫、通利二便、解毒散結(jié)等功效，主治水腫脹滿(mǎn)、二便不通，外治癰腫瘡毒等。商陸中主要活性成分為三萜皂苷類(lèi)，又稱(chēng)為商陸總皂苷，具有祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、抗炎、抗菌及抗病毒等多種藥理作用。商陸總皂苷成分復(fù)雜，目前已從商陸中分離得到21個(gè)三萜皂苷元，均為齊墩果烷型，包括商陸酸、商陸酸-30-甲酯、美商陸皂苷元、加利果酸、商陸酸G等5種母核類(lèi)型。對(duì)于每一類(lèi)皂苷元，由于連接的糖基側(cè)鏈不同，也會(huì)造成活性上的顯著差異。現(xiàn)代研究表明許多具有活性的化合物以天然前藥——糖苷的形式存在自然界中，口服后在腸道菌的作用下，會(huì)釋放出有活性的成分。如何通過(guò)商陸中含量較高的皂苷轉(zhuǎn)化為含量較低的皂苷，以闡明其活性作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，或?qū)⒌蛢r(jià)值的皂苷轉(zhuǎn)為高價(jià)值的皂苷成分，也逐漸成為藥用植物商陸研究的熱門(mén)。

商陸皂苷乙是商陸中一種高活性的單糖苷，在商陸中含量顯著低于商陸皂苷甲，故從植物中直接抽提并不是有利的工業(yè)制備方法。而商陸皂苷甲與商陸皂苷乙的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，兩者區(qū)別在于商陸皂苷甲的C-3位葡萄糖基，因此通過(guò)水解商陸皂苷甲制備商陸皂苷乙是一種有效的途徑。

目前水解轉(zhuǎn)化糖苷類(lèi)化合物常用的方法有化學(xué)法和生物法。在商陸皂苷甲的研究中，多采用酸水解法，如專(zhuān)利CN200610104857.3中利用濃硫酸，加熱至沸反應(yīng)2-5h，對(duì)商陸總皂苷水解制得商陸總苷元。該方法雖然簡(jiǎn)單易行，但該方法也會(huì)伴隨著污染嚴(yán)重、選擇性差、產(chǎn)物純化困難等缺點(diǎn)。

利用微生物發(fā)酵法進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是一種常見(jiàn)的方法。Zhu Yuyao等利用Streptomyces griseus ATCC 13273和Aspergillus ochraceus CICC 40330兩株菌的發(fā)酵液催化商陸皂苷甲轉(zhuǎn)化，得到產(chǎn)物商陸皂苷乙、商陸皂苷元以及其他兩種副產(chǎn)物。其代謝過(guò)程包含了EsA→EsB→Phytolaccagenin，這也為商陸皂苷甲代謝產(chǎn)生商陸皂苷乙提供了有利的依據(jù)。盡管微生物發(fā)酵法反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、環(huán)境污染少，但反應(yīng)產(chǎn)物種類(lèi)多樣、成分復(fù)雜，不僅影響收率，對(duì)于純化分離也造成了更大的困難。

酶促水解反應(yīng)也是一種生物轉(zhuǎn)化的常用手段，糖苷酶可以選擇性的識(shí)別不同種類(lèi)或不同構(gòu)型的糖苷鍵，以定向地水解相應(yīng)的糖苷鍵。其主要特點(diǎn)為轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)、條件溫和易實(shí)現(xiàn)，排除了后期繁瑣的分離過(guò)程。因此通過(guò)尋找經(jīng)濟(jì)高效、專(zhuān)一穩(wěn)定的工具酶來(lái)定向地進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，獲得所需要的目標(biāo)化合物也逐漸成為現(xiàn)代研究的重要突破點(diǎn)。但目前為止，酶水解商陸皂苷甲的實(shí)例較為缺乏，主要原因是酶源的限制，通過(guò)篩選合適的工具酶和反應(yīng)條件，獲得更高含量、高活性的單糖苷或苷元仍是值得去探索的領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種通過(guò)酶促水解商陸皂苷甲制備商陸皂苷乙的方法，一種酶法水解商陸皂苷甲制備商陸皂苷乙的方法，按照以下步驟進(jìn)行：

1)以商陸皂苷甲為原料，采用一種β-葡萄糖苷酶在緩沖液中選擇性地水解，使其轉(zhuǎn)變?yōu)樯剃懺碥找?，具體方法為：

取20-50mg的商陸皂苷甲置于反應(yīng)瓶中，按照10：1：0.5的體積比依次加入緩沖液、β-葡萄糖苷酶溶液和激活劑后共孵育，以TLC法監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)行；

2)商陸皂苷乙的制備：將上述轉(zhuǎn)化液于4℃下20000g離心10min，沉淀和上清液用等倍體積乙酸乙酯處理，40-50℃減壓濃縮后溶于等體積甲醇，過(guò)制備型色譜柱即得到商陸皂苷乙。

所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液或檸檬酸緩沖液，

所述激活劑為CaCl2溶液。

所述β-葡萄糖苷酶來(lái)源于蝸牛酶固體制劑。

所述步驟1)中優(yōu)選條件為：β-葡萄糖苷酶的濃度為5-20mg/ml，底物商陸皂苷甲的濃度為2-5mM，激活劑濃度為10-20mM，所用pH值為5.5-7.0，反應(yīng)溫度為20-40℃，反應(yīng)時(shí)間為1-12h。

所述步驟2)中處理沉淀的有機(jī)溶劑為甲醇、乙酸乙酯或二氯甲烷。

上述酶處理商陸皂苷甲后，使得二糖苷選擇性的轉(zhuǎn)化為單糖苷，在優(yōu)選條件下，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98％以上。

本發(fā)明提供了一種利用工具酶高效高選擇性轉(zhuǎn)化商陸皂苷甲，制備更高應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物的方法，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到98％以上，最終收率可在90％以上。與其他方法相比，該方法轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)、條件溫和易實(shí)現(xiàn)，產(chǎn)物純度高，縮減了后期繁瑣的分離過(guò)程。

附圖說(shuō)明

圖1為不同展開(kāi)劑下商陸皂苷甲及其反應(yīng)上清的TLC,

圖2為10mg/ml的酶濃度下商陸皂苷甲1h的轉(zhuǎn)化圖,

圖3為20mg/ml的酶濃度下商陸皂苷甲1h的轉(zhuǎn)化圖,

圖4為50mg/ml的酶濃度下商陸皂苷甲1h的轉(zhuǎn)化圖,

圖5為商陸皂苷甲與制備的商陸皂苷乙。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容予以進(jìn)一步闡明，其目的僅僅為了更好理解本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

取100ml三角瓶依次加入11ml磷酸緩沖液(PH6.0)，1.4ml濃度為100mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液(使酶的終濃度為10mg/ml)，1.2ml濃度為20mM的商陸皂苷甲溶液，400ul濃度為20mM的CaCl₂溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉(zhuǎn)式搖床反應(yīng)12h，每隔1h取樣進(jìn)行TLC(如圖1所示，為不同配比的展開(kāi)劑下商陸皂苷甲及其反應(yīng)上清的TLC圖)，或HPLC分析(檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，流動(dòng)相為：乙腈(B)/純水(A)，流動(dòng)相A的比例為，0.01-8.0min，60％-50％；8.0-10.0min，50％-10％；10.0-13.0min，10％-10％；13.0-13.5min，10％-60％；13.5-17.0min，60％-60％)，商陸皂苷甲1h轉(zhuǎn)化率為82.65％，反應(yīng)12h后轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.13％以上。如圖2所示，為10mg/ml的酶濃度下商陸皂苷甲的轉(zhuǎn)化圖。

實(shí)施例2

取100ml三角瓶依次加入9.8ml磷酸緩沖液(PH6.0)，2.8ml濃度為100mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液(使酶的終濃度為20mg/ml)，1.2ml濃度為20mM的商陸皂苷甲溶液，400ul濃度為20mM的CaCl2溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉(zhuǎn)式搖床反應(yīng)12h，每隔1h取樣進(jìn)行TLC(如圖1所示，為不同配比的展開(kāi)劑下商陸皂苷甲及其反應(yīng)上清的TLC圖)，或HPLC分析(檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，流動(dòng)相為：乙腈(B)/純水(A)，流動(dòng)相A的比例為，0.01-8.0min，60％-50％；8.0-10.0min，50％-10％；10.0-13.0min，10％-10％；13.0-13.5min，10％-60％；13.5-17.0min，60％-60％)，商陸皂苷甲1h轉(zhuǎn)化率為87.89％，反應(yīng)12h后轉(zhuǎn)化率達(dá)到93％以上。如圖3所示，為20mg/ml的酶濃度下商陸皂苷甲的轉(zhuǎn)化圖。

實(shí)施例3

取100ml三角瓶依次加入5.4ml磷酸緩沖液(PH6.0)，7ml濃度為100mg/ml的β-葡萄糖苷酶溶液，1.2ml濃度為20mM的商陸皂苷甲溶液，400ul濃度為20mM的CaCl₂溶液，封閉瓶口后，于37℃下200rpm旋轉(zhuǎn)式搖床反應(yīng)12h，每隔1h取樣進(jìn)行TLC(如圖1所示，為不同配比的展開(kāi)劑下商陸皂苷甲及其反應(yīng)上清的TLC圖)，或HPLC分析(檢測(cè)波長(zhǎng)203nm，流動(dòng)相為：乙腈(B)/純水(A)，梯度為，0.01-8.0min，60％-50％A；8.0-10.0min，50％-10％A；10.0-13.0min，10％-10％A；13.0-13.5min，10％-60％A；13.5-17.0min，60％-60％A)，商陸皂苷甲1h轉(zhuǎn)化率為95.59％，反應(yīng)12h后轉(zhuǎn)化率達(dá)到98％以上。如圖4所示，為50mg/ml的酶濃度下商陸皂苷甲的轉(zhuǎn)化圖。

實(shí)施例4

按照實(shí)施例3中進(jìn)行反應(yīng)，1h后終止反應(yīng)，將反應(yīng)液在4℃下20000g離心10min，收集上清液共14ml，用等倍體積的乙酸乙酯萃取三次，沉淀也以等倍體積的乙酸乙酯溶解，40℃減壓濃縮，蒸干后溶于4ml甲醇，過(guò)制備型色譜柱即得到商陸皂苷乙，收率>93.5％，純度>98％,如圖5所示，為制備的商陸皂苷乙。