本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別提供了一種利用光觸媒促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素的方法。

背景技術(shù)：

蝦青素（Astaxanthin），即3,3′-二羥基-4,4 ′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素，化學(xué)分子式為C₄₀H₅₂O₄，是一種廣泛存在于自然界中的類胡蘿卜素。天然來(lái)源的蝦青素是迄今為止自然界發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)抗氧化劑，其抗氧化能力是β-胡蘿卜素的10倍，輔酶Q10的800倍，可以有效清除自由基，具有抗氧化、抑制腫瘤生成、增強(qiáng)免疫功能、抵御紫外線傷害等多種生理功效。雨生紅球藻是天然蝦青素的主要生產(chǎn)原料，在2010年獲得衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為新資源食品，正式進(jìn)入中國(guó)食品、保健品以及日化行業(yè)，具有廣泛的市場(chǎng)潛力。

雨生紅球藻是一種單細(xì)胞的綠藻，通常在光照較弱、氮磷豐富的環(huán)境中藻的存在形態(tài)為綠色營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，快速分裂生殖，細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量較低；在脅迫條件（高光照、高溫、高鹽或營(yíng)養(yǎng)鹽饑餓等）下，游動(dòng)細(xì)胞或孢子退去鞭毛，轉(zhuǎn)入不動(dòng)細(xì)胞階段，以不動(dòng)的厚壁孢子形態(tài)存在，并積累大量的蝦青素以抵御不良環(huán)境。在環(huán)境脅迫情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的合成與解毒作用之間的平衡被打破，雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)的ROS淬滅系統(tǒng)啟動(dòng)，其中蝦青素因合成過(guò)程中能夠消耗大量ROS而在細(xì)胞內(nèi)大量合成并積累。因此，ROS在藻細(xì)胞內(nèi)的積累是促進(jìn)蝦青素合成的關(guān)鍵因素。目前，雖然有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)添加外源ROS誘生劑如過(guò)氧化氫、亞甲基藍(lán)等可以一定程度促進(jìn)雨生紅球藻蝦青素的積累，但由于極易分解失效、價(jià)格高昂、無(wú)法回收利用等因素，難以應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用光觸媒促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素的方法，通過(guò)應(yīng)用光觸媒材料在光催化條件下持續(xù)產(chǎn)生活性氧的特性，從而提高雨生紅球藻蝦青素的生產(chǎn)效率。采用的技術(shù)方案如下：

一種利用光觸媒促進(jìn)雨生紅球藻積累蝦青素的方法，包括以下步驟：

a、將光觸媒材料加入到純凈水中并進(jìn)行分散，配制成濃度為1~10 g/L分散性良好的光觸媒母液，將光觸媒母液添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，配制成含有光觸媒濃度為1~100 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

b、將雨生紅球藻細(xì)胞接種到步驟a所述的含有光觸媒的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

c、將接種完成后的培養(yǎng)基置于光生物反應(yīng)器中，在光照和攪拌條件下進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)雨生紅球藻快速積累蝦青素。

優(yōu)選的，征在于：步驟a所述的光觸媒母液，其分散方法為機(jī)械攪拌、超聲波震蕩、添加分散劑中的一種。

優(yōu)選的，步驟a所述的光觸媒為納米級(jí)的二氧化鈦TiO₂、氧化鋅ZnO、二氧化鋯ZrO₂、硫化鎘CdS、三氧化鎢WO₃、三氧化二鐵Fe₂O₃、硫化鉛PbS、氧化錫SnO₂、硫化鋅ZnS、鈦酸鍶SrTiO₃、二氧化硅SiO₂、銀Ag、鉑Pt、銠Rh、鈀Pd以及復(fù)合光觸媒材料中的一種或多種。

優(yōu)選的，二氧化鈦為銳鈦型、金紅石型、板鈦型晶體結(jié)構(gòu)中的一種或多種。

優(yōu)選的，步驟b所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有碳源、氮、硫、磷和微量元素的全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、缺少其中一種或者多種營(yíng)養(yǎng)成分的營(yíng)養(yǎng)缺失培養(yǎng)基、鹽度0.1%~5%的加鹽培養(yǎng)基中的一種。

優(yōu)選的，步驟c所述的光照為每天24小時(shí)連續(xù)光照或者間斷光照，所述光照采用自然光源、人工光源中的一種或多種；所述的光照其光譜特征為紫外光、可見光、遠(yuǎn)紅外光中的一種或多種。

優(yōu)選的，人工光源為L(zhǎng)ED燈、熒光燈、紫外燈、白熾燈、鹵素?zé)?、鈉燈。

優(yōu)選的，步驟c所述的攪拌為鼓泡式攪拌、機(jī)械式攪拌、泵循環(huán)攪拌。

優(yōu)選的，鼓泡式攪拌其通入的氣體為空氣或者含有0.5%~5%（v/v）二氧化碳的混合氣體。

優(yōu)選的，步驟c所述光生物反應(yīng)器為平板式光生物反應(yīng)器、管道式光生物反應(yīng)器、柱式光生物反應(yīng)、薄膜立袋或吊袋式光生物反應(yīng)器、跑道池或圓池光生物反應(yīng)器、帶光源的發(fā)酵罐。

本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明操作簡(jiǎn)單、成本低廉，適合大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。

（2）通過(guò)在培養(yǎng)基中添加光觸媒，在一定的光照條件下，利用光觸媒光催化產(chǎn)生活性氧的特性，使雨生紅球藻積累蝦青素的效率得到顯著提高。

（3）本發(fā)明提供的方法，積累的蝦青素含量高，使用光觸媒的實(shí)驗(yàn)組蝦青素含量比不添加光觸媒的對(duì)照組提高了37.9%~60.2%。

（4）光觸媒作為催化劑，在培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)消耗，在培養(yǎng)結(jié)束后，基于光觸媒材料與雨生紅球藻細(xì)胞粒徑和比重的差異，通過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)濾或者沉降等方法可實(shí)現(xiàn)回收利用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。其他任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、結(jié)合、簡(jiǎn)化，均為等效形式，同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

（1）將主要成分為納米二氧化鈦、納米銀的復(fù)合光觸媒材料加入到純凈水中，配制的濃度為1g/L，在使用前利用超聲波震蕩，獲得分散性良好的光觸媒母液。

（2）將光觸媒母液添加到含有50mM碳酸氫鈉的BBM培養(yǎng)基中，配制成光觸媒濃度為10mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

（3）取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細(xì)胞接種到盛有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的柱式光生物反應(yīng)器內(nèi)，采用熒光燈進(jìn)行每天12小時(shí)的間斷光照培養(yǎng)，并持續(xù)通入CO₂含量為5%（v/v）的過(guò)濾空氣進(jìn)行鼓泡式攪拌。

誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，收集藻細(xì)胞并使用改良的Boussiba方法測(cè)定蝦青素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組蝦青素含量達(dá)到1.66%，相比于未添加光觸媒的空白對(duì)照組（蝦青素含量1.19%）提高了39.5%。

實(shí)施例2

（1）將銳鈦型納米二氧化鈦光觸媒材料加入到純凈水中，配制濃度為10 g/L，在使用前利用超聲波震蕩，獲得分散性良好的光觸媒母液。

（2）將光觸媒母液添加到含有100 mM醋酸鈉的BG11缺氮培養(yǎng)基中，配制成光觸媒濃度為100 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

（3）取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細(xì)胞接種到添加盛有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的透明發(fā)酵罐內(nèi)，采用LED和紫外燈的組合光源進(jìn)行每天24小時(shí)的連續(xù)光照培養(yǎng)，并利用攪拌槳和持續(xù)通入過(guò)濾空氣的方式進(jìn)行攪拌。

誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，收集藻細(xì)胞并使用改良的Boussiba方法測(cè)定蝦青素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組蝦青素含量達(dá)到3.38%，相比于未添加光觸媒的空白對(duì)照組（蝦青素含量2.11%）提高了60.2%。

實(shí)施例3

（1）將銳鈦型納米二氧化鈦光觸媒材料，加入到純凈水中，配制濃度為2g/L，在使用前利用機(jī)械攪拌，獲得分散性良好的光觸媒母液。

（2）將光觸媒母液添加到BG11缺氮培養(yǎng)基中，配制成光觸媒濃度為50 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

（3）取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細(xì)胞接種到盛有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的薄膜吊袋式光生物反應(yīng)器內(nèi)，在室外自然光條件下培養(yǎng)，并持續(xù)通入CO₂含量為2%（v/v）的過(guò)濾空氣進(jìn)行鼓泡式攪拌。

誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，收集藻細(xì)胞并使用改良的Boussiba方法測(cè)定蝦青素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組蝦青素含量達(dá)到3.24%，相比于未添加光觸媒的空白對(duì)照組（蝦青素含量2.35%）提高了37.9%。

實(shí)施例4

（1）將主要成分為納米二氧化鈦、納米氧化鋅、納米二氧化硅、納米銀復(fù)合光觸媒材料加入到純凈水中，配制濃度為7g/L，在使用前利用超聲波震蕩，獲得分散性良好的母液。

（2）將光觸媒母液添加到含有海水晶的培養(yǎng)基中，鹽度為1%，配制成光觸媒濃度為5 mg/L的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

（3）取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期的雨生紅球藻藻種，將藻細(xì)胞接種到盛有誘導(dǎo)培養(yǎng)基的管式光生物反應(yīng)器內(nèi)，在室外自然光條件下培養(yǎng)，采用隔膜泵進(jìn)行循環(huán)攪拌，并持續(xù)通入CO₂含量為1%（v/v）的過(guò)濾空氣。

誘導(dǎo)培養(yǎng)10天后，收集藻細(xì)胞并使用改良的Boussiba方法測(cè)定蝦青素含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，光觸媒誘導(dǎo)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組蝦青素含量達(dá)到3.54%，相比于未添加光觸媒的空白對(duì)照組（蝦青素含量2.29%）提高了54.6%。

蝦青素提取方法為改良的Boussiba蝦青素測(cè)定方法，具體步驟為：誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，取1mL藻液于3000~5000 r/min離心3~6 min，去上清得到誘導(dǎo)后的雨生紅球藻細(xì)胞沉淀，向其中加入4~5 mL 4~5%的KOH和25~30%的CH₃OH的混合液，于60~70℃水浴3~6 min破壞葉綠素；再次3000~5000 r/min離心3~6 min，去上清后得到處理過(guò)的雨生紅球藻細(xì)胞沉淀，向其中加入25μL冰醋酸和1 mL DMSO，于60~70℃水浴8~10 min，期間不斷搖勻，3000~5000 r/min離心3~6 min，取上清液，并重復(fù)抽提沉淀至少3次，直至沉淀發(fā)白。蝦青素DMSO抽提液用DMSO稀釋一定倍數(shù)至合適OD范圍，于492 nm下測(cè)定蝦青素含量OD₄₉₂值；單位體積雨生紅球藻蝦青素含量(C)按下列公式計(jì)算：

C (mg/L)=(4.5 × A₄₉₂ × V_a) /V_b

其中，C為蝦青素含量，A為OD值，V_a為DMSO的體積(稀釋倍數(shù)×DMSO抽提次數(shù))，V_b為藻液體積。

此外，需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書中所描述的具體實(shí)施例，其各部分名稱等可以不同，凡依本發(fā)明專利構(gòu)思所述的構(gòu)造、特征及原理所做的等效或簡(jiǎn)單變化，均包括于本發(fā)明專利的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離本發(fā)明的結(jié)構(gòu)或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。