本發(fā)明屬于微藻檢測(cè)的生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種快速測(cè)定雨生紅球藻孢子破壁率的方法。

背景技術(shù)：

蝦青素（Astaxanthin），化學(xué)名稱(chēng)為3,3'-二羥基-β,β-胡蘿卜素-4,4'-二酮，分子式為C40H52O4，是一種酮式類(lèi)胡蘿卜素，其天然產(chǎn)物多數(shù)以酯的形式存在，具有非水溶性和親脂性，易溶于二硫化碳、丙酮、苯和氯仿等有機(jī)溶劑。雨生紅球藻是世界上公認(rèn)的最富含蝦青素的原料，其蝦青素含量可達(dá)細(xì)胞干重的5%以上，是天然抗氧化劑的濃縮品。此外，雨生紅球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、多糖、維生素、微量元素和天然色素等營(yíng)養(yǎng)成分，而在全球備受矚目，其價(jià)值被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、健康食品，是目前科學(xué)界發(fā)現(xiàn)的繼螺旋藻、小球藻之后，新一代藻類(lèi)食品。根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品安全法》和《新資源食品管理辦法》的規(guī)定，2010年衛(wèi)生部批準(zhǔn)雨生紅球藻為新資源食品（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部第17號(hào)公告），允許作為普通食品生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)，同時(shí)可作為提取天然蝦青素的原料。

雨生紅球藻 （Haematococcus pluvialis ) 屬于團(tuán)藻目，紅球藻科，是一種廣泛存在的淡水單細(xì)胞綠藻。雨生紅球藻通常為有兩根鞭毛可以自行游動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞(vegetative)，細(xì)胞周?chē)型该鞫嗵穷?lèi)的凝膠狀的柔軟細(xì)胞壁。當(dāng)它處在不利環(huán)境時(shí)（如強(qiáng)紫外線,或營(yíng)養(yǎng)缺乏、溫度變化等），細(xì)胞受到環(huán)境脅迫形成厚壁孢子（Cyst）并大量累積蝦青素，形成對(duì)自我機(jī)體的保護(hù)。（Boussiba et aL 1992）。含有蝦青素的雨生紅球藻的厚壁孢子具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，若直接利用，其生物有效利用率低，且堅(jiān)韌的細(xì)胞壁會(huì)阻礙有機(jī)溶劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)提取蝦青素[5]。因此在無(wú)論是直接食用，或者提取蝦青素前必須對(duì)孢子態(tài)細(xì)胞進(jìn)行破壁處理，破壞雨生紅球藻的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)蝦青素的提取和生物利用率。雨生紅球藻的破壁率是雨生紅球藻產(chǎn)品生物利用率的一個(gè)重要指標(biāo)；也是作為工業(yè)化提取蝦青素的重要生產(chǎn)指標(biāo)。目前，我國(guó)雨生紅球藻行業(yè)是一個(gè)新興的行業(yè)，尚無(wú)完善的檢測(cè)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。建立完善和有效的檢測(cè)方法，是促進(jìn)雨生紅球藻行業(yè)發(fā)展的基本要求。

雨生紅球藻的破壁的原因有兩種：（1）培養(yǎng)過(guò)程中由于物理、化學(xué)、生物污染等問(wèn)題導(dǎo)致的雨生紅球藻破壁，其結(jié)果為紅球藻細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)的蝦青素含量下降，并在一段時(shí)間內(nèi)完全降解，此類(lèi)細(xì)胞破壞的紅球藻沒(méi)有市場(chǎng)價(jià)值；（2）為了提取、加工雨生紅球藻產(chǎn)品而設(shè)計(jì)的主動(dòng)破壁工藝生產(chǎn)的破壁雨生紅球藻細(xì)胞，此類(lèi)工藝短暫停留后經(jīng)過(guò)后加工處理，蝦青素保留完整不損耗，是目前破壁雨生紅球藻細(xì)胞的主要價(jià)值所在。

目前，雨生紅球藻的破壁率測(cè)定方法包括：1、細(xì)胞計(jì)數(shù)法：利用“平板計(jì)數(shù)框”在顯微鏡下對(duì)破壁前后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，再根據(jù)公式計(jì)算破壁率：R=（細(xì)胞總數(shù)-破壁后剩余細(xì)胞數(shù)）/細(xì)胞總數(shù)；由于是人工計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)單位較小且須在顯微鏡下進(jìn)行，此法容易造成巨大誤差，難于用作定量分析使用。2、專(zhuān)利《雨生紅球藻孢子破壁率的測(cè)定方法》（公開(kāi)號(hào)CN 101609039 A）中公開(kāi)了一種溶劑法測(cè)定方法：此方法原理主要是利用了二氯甲烷-正己烷混合溶液和二甲基亞砜（DMSO）溶液對(duì)雨生紅球藻破壁和未破壁細(xì)胞中的蝦青素溶解度不同，從而進(jìn)行2次測(cè)定進(jìn)行結(jié)果比較計(jì)算雨生紅球藻的破壁率；但存在以下問(wèn)題：（1）上述專(zhuān)利的原理主要在于二甲基亞砜能提取出未破壁的雨生紅球藻中的蝦青素，其方法需要建立在準(zhǔn)確測(cè)定蝦青素的含量的基礎(chǔ)上；但實(shí)際應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，二氯甲烷、正己烷、二甲基亞砜雖然都屬于親酯性有機(jī)溶劑，能夠穿透未破壁的雨生紅球藻孢子胞壁進(jìn)入細(xì)胞，但細(xì)胞內(nèi)的天然蝦青素90%以上卻以酯化形式存在（約70%的單酯、25%的雙酯及5%的單體），酯化分子較大，而完整孢子壁厚而堅(jiān)固，其內(nèi)部的蝦青素難以全部通過(guò)細(xì)胞壁被萃取出來(lái)，因此，上述專(zhuān)利方法在70℃下不能完全提取完整紅球藻細(xì)胞中的蝦青素，容易造成較大誤差；（2）二甲基亞砜提取效率受雨生紅球藻質(zhì)量干擾較大，對(duì)于不同批次生產(chǎn)的雨生紅球藻其測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，難以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)質(zhì)量檢測(cè)的可靠性；（3）雨生紅球藻細(xì)胞中除蝦青素外，還含有大量的葉綠素、黃色素等雜質(zhì)，容易被二甲基亞砜等溶劑提取，而其測(cè)定時(shí)的吸光度與蝦青素吸光度接近，其測(cè)定結(jié)果容易受到這些雜質(zhì)的干擾造成測(cè)定誤差；（4）上述專(zhuān)利采用了兩種溶劑（二氯甲烷-正己烷混合溶液和二甲基亞砜），這兩種溶劑對(duì)于蝦青素的吸收波長(zhǎng)有差異，但都以相同DMSO為對(duì)照在530nm測(cè)定的吸光度不匹配，易導(dǎo)致最終計(jì)算破壁率的誤差，不利于質(zhì)量控制過(guò)程的準(zhǔn)確性和有效性；（5）有機(jī)溶劑能使天然蝦青素異構(gòu)化降解，而且在堿性條件下，易發(fā)生不可逆的變性；（6）正己烷-二氯甲烷屬于非極性與水互不溶，如果樣品原料中含水量高，就無(wú)法與樣品充分接觸，無(wú)法萃取出色素。而實(shí)際破壁加工過(guò)程含有大量水分，若干燥處理后再分析，增加處理成本，且散失了實(shí)時(shí)質(zhì)量控制的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定、易操作的雨生紅球藻孢子破壁率的檢測(cè)方法，本方法能夠定量有效地反映雨生紅球藻產(chǎn)品在生產(chǎn)、加工、銷(xiāo)售過(guò)程中的破壁效率，尤其為雨生紅球藻制品提供了質(zhì)量控制和監(jiān)控的可靠的技術(shù)檢測(cè)方法。

本發(fā)明的原理是：丙酮在常溫常壓下可以完全萃取雨生紅球藻破壁孢子中的蝦青素，而不能萃取出完整的紅球藻孢子中的蝦青素，用紫外分光光度計(jì)（最大吸收波長(zhǎng)475nm）測(cè)定雨生紅球藻蝦青素的含量，丙酮在未完全破壁雨生紅球藻孢子中萃取出的蝦青素含量和雨生紅球藻中總蝦青素含量的比值，即為雨生紅球藻孢子的破壁率。根據(jù)蝦青素含量的計(jì)算公式，破壁率的計(jì)算為2個(gè)蝦青素含量公式相除，實(shí)際操作中不需要計(jì)算蝦青素的含量，只需要計(jì)算測(cè)定蝦青素的吸光度，計(jì)算其比值即可。

一種快速測(cè)定雨生紅球藻孢子破壁率的方法，其步驟是：包括丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)1），對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)2）兩個(gè)測(cè)量步驟，和一個(gè)計(jì)算步驟；其特征在于：

A、丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度：

雨生紅球藻樣品包括鮮藻、藻漿、藻粉及含藻漿或藻粉的雨生紅球藻制品（如藻片、膠囊等），丙酮的分析純≥99.5%；

精確稱(chēng)取定量雨生紅球藻樣品置于100ml容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使蝦青素充分析出，將上述溶液轉(zhuǎn)移至離心管，用3500-5000rpm離心2-5分鐘，使溶液和藻渣分離，取離心后上清液5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（即稀釋20倍），用紫外分光光度計(jì)（1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液）測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度A1；

B、對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度：

雨生紅球藻樣品包括鮮藻、藻漿、藻粉及含藻漿或藻粉的紅球藻制品（如藻片、膠囊等），丙酮的分析純≥99.5%；

精確稱(chēng)取定量雨生紅球藻樣品（上述相同樣品）置于試管分散機(jī)中，加入少量丙酮（2-5ml），5000-10000rpm研磨5分鐘（或組織勻漿機(jī)10000-15000轉(zhuǎn)勻漿5分鐘或充分研磨），將分散試管內(nèi)的混合樣品轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用丙酮將附著的色素完全洗脫直至無(wú)色，并將全部液體轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使蝦青素充分析出，將上述溶液轉(zhuǎn)移至離心管，用3500-5000rpm鐘離心2-5分鐘，使溶液和藻渣分離，取離心后上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（稀釋20倍），用紫外分光光度計(jì)（1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液）測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度A2；

C、計(jì)算孢子破壁率：

丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)1）和對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)2）的比例，即孢子破壁率，用公式計(jì)算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%。

進(jìn)一步的，本發(fā)明方法中所述的雨生紅球藻樣品包括鮮藻、藻漿、藻粉及含藻漿或藻粉的紅球藻制品（如藻片、膠囊）。

進(jìn)一步的，本發(fā)明方法中所述的丙酮的分析純≥99.5%。

進(jìn)一步的，本發(fā)明方法中所述的分析純≥99.5%的丙酮試劑可替換為紫外吸收光譜分析常用的有機(jī)溶劑，如：甲醇、乙醇、己烷、四氯化碳、石油醚、二硫化碳、氯仿、二甲基亞砜中的一種或多種。

進(jìn)一步的，本發(fā)明方法中所述的對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%是指：將已知樣品研磨后隨機(jī)取出一份在顯微鏡下觀察是否達(dá)到100%破壁效果，如果未達(dá)到，繼續(xù)研磨，直至100%完全破壁為止。

進(jìn)一步的，本發(fā)明方法中使所述的已知樣品破壁率達(dá)到100%的方法為包括研磨、組織勻漿、高壓均質(zhì)、球磨、試管分散在內(nèi)的物理方法。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下效果和有點(diǎn)：

（1）本發(fā)明采取通過(guò)研磨紅球藻孢子全部破壁后再測(cè)量的方法，可以避免細(xì)胞中的蝦青素不完全被溶出的問(wèn)題；

（2）本發(fā)明方法操作過(guò)程處于常溫常壓狀態(tài)，不需加熱，與對(duì)比專(zhuān)利文件中需要水浴加熱比減少了操作步驟；

（3）本發(fā)明方法采用單一溶劑，對(duì)照試劑也為相同溶劑，該溶劑簡(jiǎn)單易得，最重要的是提高了儀器檢測(cè)的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性；

（4）本發(fā)明方法采用了物理輔助手段，將未破壁的細(xì)胞物理進(jìn)行100%破壁，保證了計(jì)算基數(shù)（總蝦青素）的準(zhǔn)確性，大大提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性；

（5）本發(fā)明方法不涉及高效液相色譜法（HPLC），免除了蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，既降低分析測(cè)試成本，又減少了每次測(cè)試需要制作標(biāo)準(zhǔn)品的步驟，從而提高了效率；

（6）本發(fā)明方法操作僅須三個(gè)步驟，操作簡(jiǎn)單、計(jì)算簡(jiǎn)便（不需要算出蝦青素的實(shí)際含量，僅需將2個(gè)樣品吸光度A1和A2相除得到對(duì)應(yīng)的比例結(jié)果）、高效快捷（全過(guò)程約15-20分鐘），非常適合雨生紅球藻制品生產(chǎn)加工過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控和質(zhì)量控制。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。在此，本發(fā)明的示意性實(shí)施方式及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

本發(fā)明所述雨生紅球藻樣品可選用鮮藻、藻漿、藻粉及含藻漿或藻粉的紅球藻制品（如藻片、膠囊等），以下具體以鮮藻漿為例，進(jìn)一步說(shuō)明快速測(cè)定雨生紅球藻孢子破壁率的方法。其步驟是：

A、丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）使用天平精確稱(chēng)取0.1g雨生紅球藻樣品置于100ml容量瓶中，

2）加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使蝦青素充分析出，

3）將上述溶液轉(zhuǎn)移至離心管，在離心機(jī)中用3500rpm離心3分鐘，使溶液和藻渣分離，

4）取離心后上清液5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量品，用丙酮定容至100ml（即稀釋20倍），

5）用紫外分光光度計(jì)（1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液）測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度A1；

B、對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）精確稱(chēng)取0.1g雨生紅球藻樣品（上述相同樣品）置于試管分散機(jī)中，

2）加入少量丙酮（2-5ml），5000rpm研磨5分鐘，將分散試管內(nèi)的混合樣品轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用丙酮將附著的色素完全洗脫直至無(wú)色，并全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，

3）加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使蝦青素充分析出，

4）將上述溶液轉(zhuǎn)移至離心管，用3500rpm鐘離心3分鐘，使溶液和藻渣分離，

5）取離心后上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量品，丙酮定容至100ml（稀釋20倍），

6）用紫外分光光度計(jì)（1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液）測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度A2；

C、計(jì)算孢子破壁率：

丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)1）和對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)2）的比例，即孢子破壁率。用公式計(jì)算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%。

由于本發(fā)明方法所述的分析純≥99.5%的丙酮試劑可替換為紫外吸收光譜分析常用的有機(jī)溶劑，如：甲醇、乙醇、己烷、四氯化碳、石油醚、二硫化碳、氯仿、二甲基亞砜；其操作原理和步驟以及測(cè)定效果與丙酮完全相同，故以下實(shí)施例僅以丙酮為試劑具體說(shuō)明。

實(shí)施例1（破壁雨生紅球藻漿），

范圍：常用在雨生紅球藻破壁加工過(guò)程中破壁率的檢測(cè)和質(zhì)量控制，

樣品來(lái)源：培養(yǎng)成熟的雨生紅球藻孢子細(xì)胞（含蝦青素）經(jīng)過(guò)濾、脫水后，用乙醇調(diào)整藻漿濃度至10-15%，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)（GEA Ariete NS2006，Italy）壓力600bar細(xì)胞破壁，得到破壁雨生紅球藻漿；

A、丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）天平精確稱(chēng)取樣品藻漿0.105g、0.102g和0.101g（3個(gè)平行樣品），分別置于100ml容量瓶中，2）在三個(gè)容量瓶中，分別加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取10分鐘，充分振蕩使蝦青素充分析出，提取過(guò)程間隔2-3分鐘充分搖勻，3）將上述三個(gè)溶液分別移至三個(gè)離心管，用離心機(jī)5000rpm離心3分鐘，4）用移液槍?zhuān)ɑ蛭埽┤‰x心后上清液5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，用丙酮定容至100ml，5）用紫外分光光度計(jì)，1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液，測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度；分別為0.561,0.567,0.574，平均吸光度值A(chǔ)1為0.567；

B、對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）天平精確稱(chēng)取樣品藻漿0.102g、0.103g和0.100g（3個(gè)平行樣品），分別置于分散試管中，2）向試管中分別加入丙酮2ml，5000rpm研磨5分鐘，將試管內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用丙酮將附著于試管內(nèi)的色素完全洗脫直至無(wú)色，并全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，3）加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取10分鐘，充分振蕩使蝦青素充分析出，提取過(guò)程間隔2-3分鐘充分搖勻，4）將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至3個(gè)離心管，用離心機(jī)5000rpm離心3分鐘，5）用移液槍?zhuān)ɑ蛭埽┤‰x心后上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，丙酮定容至100ml（稀釋20倍），6）用紫外分光光度計(jì)，1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液，測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度，分別為0.650,0.641,0.669，平均吸光度值A(chǔ)2為0.653；

C、計(jì)算孢子破壁率：

丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)1）和對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)2）的比例，即孢子破壁率。用公式計(jì)算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%，則雨生紅球藻漿的雨生紅球孢子破壁率為86.83%。

實(shí)施例2 （破壁雨生紅球藻粉），

范圍：常用在破壁雨生紅球藻粉質(zhì)量檢驗(yàn)，是破壁雨生紅球藻粉產(chǎn)品的質(zhì)量指標(biāo)，

樣品來(lái)源：培養(yǎng)成熟的雨生紅球藻孢子細(xì)胞（含蝦青素）經(jīng)過(guò)濾、脫水后，用乙醇調(diào)整藻漿濃度至10-15%，經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)（GEA Ariete NS2006，Italy）壓力1200bar細(xì)胞破壁，得到破壁雨生紅球藻漿；破壁藻漿經(jīng)過(guò)烘箱干燥（噴霧、滾筒、微波、凍干等干燥方法，不同的干燥方法加工的產(chǎn)品，萃取時(shí)間不同約5-15分鐘）脫水后，得到水分含量≤10%的破壁雨生紅球藻粉；

A、丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）天平精確稱(chēng)取樣品藻粉0.102g、0.101g（2個(gè)平行樣品），分別置于100ml容量瓶中，2）在2個(gè)容量瓶中，分別加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使藻粉分散，并使蝦青素充分析出，提取過(guò)程間隔2-3分鐘搖勻，3）將上述2個(gè)溶液分別移至2個(gè)離心管，用離心機(jī)3500rpm離心3分鐘，4）用移液槍?zhuān)ɑ蛭埽┤‰x心后上清液5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，用丙酮定容至100ml，5）用紫外分光光度計(jì)，1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液，測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度；分別為0.457，0.434，平均吸光度值A(chǔ)1為0.446；

B、對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）天平精確稱(chēng)取樣品藻粉0.101g和0.103g（2個(gè)平行樣品），分別置于分散試管中，2）向試管中分別加入丙酮5ml，8000rpm研磨5分鐘，將試管內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用丙酮將附著于試管內(nèi)的色素完全洗脫直至無(wú)色，并全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，3）加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使藻粉分散，并使蝦青素充分析出，提取過(guò)程間隔2-3分鐘充分搖勻，4）將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至3個(gè)離心管，用離心機(jī)3500rpm離心3分鐘，5）用移液槍?zhuān)ɑ蛭埽┤‰x心后上清5ml轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶，丙酮定容至100ml（稀釋20倍），6）用紫外分光光度計(jì)，1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液，測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度，分別為0.57,8，0.591，平均吸光度值A(chǔ)2為0.585；

C、計(jì)算孢子破壁率

丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)1）和對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)2）的比例，即孢子破壁率。用公式計(jì)算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%，則雨生紅球藻粉的雨生紅球孢子破壁率為76.22%。

實(shí)施例3（雨生紅球藻片），

范圍：常用在以破壁雨生紅球藻粉為原料制成片劑產(chǎn)品的質(zhì)量檢驗(yàn)和鑒定，

樣品來(lái)源：以經(jīng)細(xì)胞破壁、干燥后的破壁雨生紅球藻粉為原料，經(jīng)研磨、過(guò)篩、配料、混合、壓片、包裝等工藝制成得到雨生紅球藻片。本次使用的藻片規(guī)格0.5g/片，蝦青素含量為0.6%；

補(bǔ)充說(shuō)明：不同廠家生產(chǎn)的雨生紅球藻片中蝦青素的含量不同，因此在使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度時(shí)，應(yīng)根據(jù)藻片中所含蝦青素的濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)，如果該測(cè)定的吸光值大于1.25那么需要對(duì)該溶液進(jìn)行適量稀釋?zhuān)蛊湮庵到橛?.4-0.8之間為宜，以保證測(cè)量的準(zhǔn)確性；

A、丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）取成品藻片4片，分為2片一組對(duì)照，天平分別稱(chēng)量記錄重量為1.015g和1.022g，2）稱(chēng)重后的藻片分次放入研缽中搗成小塊（目的在于破壞片劑包衣，讓內(nèi)容物裸露出來(lái)即可，不需要磨碎），將2組碎片分別置于2個(gè)100ml容量瓶中，3）在容量瓶中分別加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-15分鐘，充分振蕩使碎片溶解，并蝦青素充分析出，提取過(guò)程間隔2-3分鐘搖勻，4）將上述溶液移至離心管，用離心機(jī)5000rpm離心5分鐘，4）用移液槍?zhuān)ɑ蛭埽┓謩e取離心后上清液2ml轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶，用丙酮定容至10ml（稀釋5倍），5）用紫外分光光度計(jì)，1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液，測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度，吸光度值A(chǔ)1為0.518和0.533，平均吸光度值為0.526；

B、對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度：

丙酮的分析純≥99.5%，

1）取成品藻片2片天平精確稱(chēng)量記錄重量為1.035g和1.026，2）稱(chēng)重后的藻片放入研缽中充分研磨粉碎至細(xì)粉，置于分散試管中，3）向試管中加入丙酮5ml，7000rpm研磨5分鐘，將試管內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用丙酮將附著于試管內(nèi)的色素完全洗脫直至無(wú)色，并全部轉(zhuǎn)移到容量瓶中，4）加入丙酮100ml定容至刻度，在室溫（20-25℃）下萃取5-10分鐘，充分振蕩使粉末分散，并使蝦青素充分析出至粉末無(wú)色，提取過(guò)程間隔2-3分鐘充分搖勻，5）將上述溶液分別轉(zhuǎn)移至離心管，用離心機(jī)5000rpm離心5分鐘，6）用移液槍?zhuān)ɑ蛭埽┤‰x心后上清2ml轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶，丙酮定容至10ml（稀釋5倍），6）用紫外分光光度計(jì)，1cm光徑比色杯，以丙酮為空白對(duì)照溶液，測(cè)量475nm波長(zhǎng)光吸光度，分別為0.613和0.596，平均吸光度值A(chǔ)2為0.605；

C、計(jì)算孢子破壁率：

丙酮提取、測(cè)定已知樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)1）和對(duì)已知樣品研磨、勻漿使其破壁率達(dá)到100%后用丙酮提取、測(cè)定100%破壁樣品的蝦青素吸光度（吸光值A(chǔ)2）的比例，即孢子破壁率。用公式計(jì)算孢子破壁率（A）：A = A1/A2×100%，則雨生紅球藻片中的雨生紅球孢子破壁率為86.93%。

以上所述的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述為本發(fā)明的具體實(shí)施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改，等同替換，改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。