馴化促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是關(guān)于生物活性保健品開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及煙氣0)2馴化促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蝦青素是目前已知的自然界最強的抗氧化劑，其抗氧化性是維生素C的6000倍，維生素E的1000倍，茶多酚的200倍，葡萄籽提取物的50倍。蝦青素可以增強機體的抗衰老、消炎、抗紫外線和免疫功能，因此，被用于保健品、化妝品、食品和飼料添加劑等多種功能產(chǎn)品中。自然蝦青素來源中，雨生紅球藻的蝦青素含量最高，約占其干重的1-5 % (Minxi Wana，2014)，并且，其所含蝦青素的結(jié)構(gòu)與生物體所需蝦青素結(jié)構(gòu)一致，這是合成蝦青素和其他天然蝦青素所不能比擬的，被公認為天然蝦青素最好的生物來源，是目前投入蝦青素商業(yè)化應(yīng)用的唯一藻類。然而，雨生紅球藻生長緩慢，比生長速率約為0.15/d-0.64/d(0rOsa，2005 ；Kaewpintong, 2006 ； Imamoglu ,2010) 0緩慢的生長速率帶來其它藻類入侵、原生動物污染等多種問題，是雨生紅球藻大規(guī)模生產(chǎn)中存在的主要難題。
[0003]由于空氣中低濃度⑶2在水中的傳質(zhì)速率較低，微藻養(yǎng)殖40%的能耗用于空氣栗持續(xù)提供空氣維持微藻生長，而利用煙氣高濃度CO2養(yǎng)殖微藻，不僅可以將微藻養(yǎng)殖的能源投入降低70%(Lam et al，2012)，還可以促進微藻生長和蝦青素積累。借助平板反應(yīng)器、連續(xù)管式反應(yīng)器等，雨生紅球藻對2 %~5%高濃度⑶^^的固碳效率可達到13.55 % to49.15%,生物質(zhì)和蝦青素產(chǎn)量顯著提高(1^呢，2010;1^6，2015;6丨3111^11丨，2015;1^31^!^，2015)。以5%⑶2為碳源培養(yǎng)雨生紅球藻可將蝦青素的產(chǎn)量提高至175.7mg/l，是以醋酸鹽為碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)的2.7倍(Kang等，2005)。此外，高濃度的CO2可以代替缺氮培養(yǎng)基和醋酸鹽培養(yǎng)基誘導(dǎo)蝦青素的合成和積累，降低成本。向蒸餾水中間歇性通入純二氧化碳可促使蝦青素積累，其含量與缺氮培養(yǎng)基中蝦青素含量相近(Imamoglu，2009)。但是，在燃煤電廠煙氣的高濃度(12?15% )C02條件下，雨生紅球藻生長會受到抑制。Cheng等人(2016)利用高濃度CO2培養(yǎng)雨生紅球藻核誘變突變藻株發(fā)現(xiàn)，當⑶2濃度由空氣提高至6%，生物生產(chǎn)力提高了82%。但是，當⑶2濃度提高至10%以上時，雨生紅球藻的生長受到抑制。Yin等人(2015)將20%CO2通入生物膜反應(yīng)器中培養(yǎng)雨生紅球藻發(fā)現(xiàn)其生物量比1.5%CO2降低了 15 %，蝦青素含量降低了40%，將直接導(dǎo)致工業(yè)生產(chǎn)時間的延長和生產(chǎn)效益的降低，所以，如何利用燃煤電廠煙氣CO2提高雨生紅球藻的生長速率和蝦青素產(chǎn)量仍是一個技術(shù)難題，如果能有所突破將對提高蝦青素生產(chǎn)效率和降低生產(chǎn)成本具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種利用燃煤電廠煙氣CO2馴化提高雨生紅球藻生長速率和蝦青素含量的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的解決方案是:
[0005]提供煙氣0)2馴化促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累的方法，燃煤電廠煙氣中含有12?15%的高體積濃度C02，所述煙氣0)2馴化促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累的方法具體包括下述步驟:
[0006](I)按10?20%的接種量將雨生紅球藻液體接種到400ml液體BG-1l培養(yǎng)基中，然后將接種后的培養(yǎng)基置于光合反應(yīng)器中，再向光合反應(yīng)器中通入體積濃度為6%的高濃度CO2氣體，在氣體流量為60ml/min、光照強度為3000?3500Lux、溫度25?28°C的條件下，培養(yǎng)4?6天；
[0007]然后，將上述以體積濃度為6%的⑶2培養(yǎng)后的藻株，以10?20%的接種量轉(zhuǎn)接入新的液體BG-1I培養(yǎng)基中，然后通入體積濃度為10 %的高濃度CO2氣體，在氣體流量為60ml/min、光照強度為3000?3500Lux、溫度25?28°C的條件下，培養(yǎng)4?6天；
[0008](2)取步驟(I)中在以體積濃度為1 %的CO2氣體中培養(yǎng)4?6天后的藻液，以1?20%的接種量轉(zhuǎn)接入新的液體BG-1I培養(yǎng)基中，然后將接種后的培養(yǎng)基置于光合反應(yīng)器中，再向光合反應(yīng)器中通入C02體積濃度為12?15%的燃煤電廠煙氣，在氣體流量為60ml/min、光照強度為3000?3500LUX、溫度為25?28 °C的條件下，連續(xù)培養(yǎng)5?10代，即獲得在燃煤電廠煙氣條件下快速生長的目標藻株；
[0009 ] (3)取對數(shù)生長期的目標藻株，以1?20 %的接種量接種到400ml液體BG-11培養(yǎng)基中，然后將接種后的培養(yǎng)基置于光合反應(yīng)器中，再向光合反應(yīng)器中通入CO2體積濃度為12?15%的燃煤電廠煙氣促進藻株生長，在氣體流量為60ml/min、光照強度3000?3500Lux、溫度為25?28°C的條件下，培養(yǎng)目標藻株7?10天，能通過測量藻細胞個數(shù)計算生長速率；
[0010](4)將步驟(3)培養(yǎng)結(jié)束后的目標藻株，置于高光照強度7500?lOOOOLux下繼續(xù)培養(yǎng)，并持續(xù)通入CO2體積濃度為12?15%的燃煤電廠煙氣脅迫提高藻株中的蝦青素含量，培養(yǎng)條件為:氣體流量為120ml/min、培養(yǎng)溫度為25?28°C，培養(yǎng)10?15天后，將藻液離心和冷凍干燥后，即得到雨生紅球藻干藻粉，能測量評價雨生紅球藻粉的生物質(zhì)干重和蝦青素含量。
[0011]在本發(fā)明中，所述光合反應(yīng)器采用容積為600ml的圓柱光合反應(yīng)器。
[0012]在本發(fā)明中，所述液體BG-1l培養(yǎng)基的成分組成為:1.5g/L NaN03、0.2g/L Na2C03、0.075g/L MgS04.7H20、0.4g/L K2HP04、0.036g/L CaCl2.2H20、2.2 X 10—4g/L ZnSO4.7H20、1.8X10—3g/L MnCl2.4H20、2.1X10—5g/L NaMoOh0.8 X 10—5g/L C11SO4.5H20、2.8X10-3g/L H3BO3、0.001g/L EDTA、0.006g/L檸檬酸。
[0013]在本發(fā)明中，所述步驟(3)中，生長速率的測定計算方法為:
[OOM]每隔24h取2mL藻液，向藻液中加入0.2mL魯哥試劑，震蕩搖勾，制片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，利用血球計數(shù)板計數(shù)，計算藻細胞數(shù)N(個/mL)再利用公式μ= (InN2-1n Ni)/(t2-)計算細胞平均生長速率，作為生長速率；
[0015]其中，μ為細胞平均生長速率為第&天時的藻細胞數(shù)(個/mL)，N2為第t2天時的藻細胞數(shù)(個/mL)。
[0016]在本發(fā)明中，所述步驟(4)中，生物質(zhì)干重M(g/L)的測定方法為:
[0017]取1mL藻液以SOOOrmp離心10分鐘，去上清液，用蒸餾水沖洗獲得的藻泥兩次，再將藻泥離心脫水后置于_70°C下冷凍24小時后，放入低溫真空干燥儀中干燥24小時，對所得藻粉稱重并計算生物質(zhì)干重M(g/L)。
[0018]在本發(fā)明中，所述步驟(4)中，蝦青素含量的測定方法采用高效液相色譜法(HPLC)。具體為:取1mL藻液，8000rmp離心10分鐘，去除上清液，將藻泥置于-70°C冷凍24小時后，放入低溫真空干燥儀中干燥24小時;將冷凍干燥所得的藻粉置于15ml分散機試管中，加入5mL甲醇-二氯甲烷混合溶液(25:75，v/v)，在5500rmp均質(zhì)研磨萃取2分鐘，所得混合液在SOOOrmp離心5分鐘，取上清液，反復(fù)萃取至藻渣無色;將反復(fù)萃取后留存的含有蝦青素的上清液混合，并用甲醇-二氯甲燒混合溶液定容至25mL；取5mL混合液，加入ImL 0.05mol/LNaOH-甲醇溶液，于室溫、暗光、氮氣環(huán)境下進行皂化反應(yīng)(至少8小時)；反應(yīng)產(chǎn)物用氮吹儀定容至5mL，用0.45μπι濾膜過濾，濾液用于高效液相色譜(HPLC)測定蝦青素含量;HPLC工作條件如下:流動相為A水、B甲醇、C異丙醇、D乙腈，洗脫梯度為:Omin，20 % A、50 % B、30 % D;511^11，20%厶、50%8、30%0;1511^11，60%8、10%(:、30%0;流速為11111/11^11;取47611111波長下的蝦青素吸收峰面積，依據(jù)蝦青素含量與峰面積對應(yīng)的標準曲線計算蝦青素濃度Dast(mg/L);則干藻粉中好青素含量的計算方法如下:(^(11^/^)=0331；(11^/1)/]\^/1)，其中1(8/1)為藻液烘干后的生物質(zhì)干重。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0020]本發(fā)明采用燃煤電廠煙氣高濃度(12?15%)0)2馴化雨生紅球藻，顯著提高了生長速率和蝦青素產(chǎn)量，其生長速率比空氣條件下提高了47 %，蝦青素含量提高了 25%。這是由于利用煙氣高濃度C02使雨生紅球藻的光合作用關(guān)鍵固碳酶Rubisco表達上調(diào)，促進了卡爾文循環(huán)和光合生長效率;光捕獲葉綠素a/b結(jié)合蛋白的表達量上升，提高了光能利用效率;葉綠素合成效率提高，ATP合成酶表達上調(diào)，從而提高了生長速率。本發(fā)明在蝦青素合成階段，煙氣高濃度CO2為油脂合成提供了充足的碳源，為蝦青素酯化和存儲提供了有利條件。
【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實施方式】