本發(fā)明屬于微藻生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種雨生紅球藻培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis Flotow)是生活在淡水中的單細(xì)胞綠藻，隸屬于綠藻門(mén)，綠藻綱，團(tuán)藻目，紅球藻科，紅球藻屬。研究表明，雨生紅球藻細(xì)胞在脅迫條件下可大量合成并積累天然蝦青素，最高可達(dá)細(xì)胞干重的3％左右，被認(rèn)為是天然蝦青素的“濃縮品”和生產(chǎn)天然蝦青素最好的生物資源。目前蝦青素在國(guó)際市場(chǎng)的價(jià)格為每千克約2500美元，全球每年約有1億美元以上的市場(chǎng)容量。因此，利用雨生紅球藻規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)天然蝦青素的研究已成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外微藻開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

然而，雨生紅球藻的生理特點(diǎn)較為特殊。一般情況下，雨生紅球藻的生長(zhǎng)周期中存在綠色游動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)期和靜止孢子期兩個(gè)階段，其中蝦青素的合成和積累主要在靜止孢子期。因而，目前雨生紅球藻多采用兩步培養(yǎng)法：首先通過(guò)三角瓶、管狀光生物反應(yīng)器、平板式光生物反應(yīng)器、中試反應(yīng)池和規(guī)?；艿莱鼗蚬艿朗焦馍锓磻?yīng)器等逐級(jí)放大培養(yǎng)，進(jìn)行雨生紅球藻的綠色階段培養(yǎng)，獲得其最大生物量；其次是紅色孢子誘導(dǎo)階段，將培養(yǎng)的雨生紅球藻綠色細(xì)胞進(jìn)行高光低氮等脅迫，誘導(dǎo)綠色細(xì)胞向靜止孢子期轉(zhuǎn)化，并逐漸合成和積累蝦青素而轉(zhuǎn)化為紅色不動(dòng)孢子。在這種培養(yǎng)模式下，雨生紅球藻細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程緩慢，且容易被其他生物污染而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，尤其在綠色游動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)階段。因而，如何提高雨生紅球藻的生長(zhǎng)速率，縮短接種后綠色游動(dòng)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯期，快速獲得較大生物量的培養(yǎng)物，是利用雨生紅球藻規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)蝦青素的關(guān)鍵步驟。

雨生紅球藻的生長(zhǎng)受多種因素限制，其中培養(yǎng)基是決定其生長(zhǎng)速率和生物量的一個(gè)非常關(guān)鍵的條件。迄今為止，針對(duì)規(guī)?；囵B(yǎng)雨生紅球藻的研究中涉及到的培養(yǎng)基種類(lèi)較多，主要有CN104745479(一種雨生紅球藻的培養(yǎng)方法)、CN105483016A(培養(yǎng)雨生紅球藻的方法及應(yīng)用)、CN 104862232A(一種適用于雨生紅球藻營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的改良培養(yǎng)基及配制方法)、CN 105567625A(一種雨生紅球藻的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)、CN 103589643 B(一種雨生紅球藻培養(yǎng)基)等。其中CN 103589643 B系發(fā)明人前期研究成果，雖然能有效提升雨生紅球藻生長(zhǎng)速率，但配方較為復(fù)雜，營(yíng)養(yǎng)成分多達(dá)20余種，且含有成分復(fù)雜的有機(jī)磷，在規(guī)?；B(yǎng)殖中不僅增加了培養(yǎng)的難度和復(fù)雜性，且不利于環(huán)境保護(hù)；CN 105567625A主要應(yīng)用于培養(yǎng)后期靜止孢子的誘導(dǎo)階段；而CN 104862232A公開(kāi)的改良培養(yǎng)基雖配置方法簡(jiǎn)便，但其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖速率有限，培養(yǎng)10天后，細(xì)胞密度從1.0×10⁶cells/ml增至約2.0×10⁶cells/ml左右，即生物量?jī)H提高1倍左右，難以滿(mǎn)足規(guī)?；囵B(yǎng)中對(duì)于快速獲得較高生物量的要求；CN105483016A基于生活污水凈化提出了利用滅菌處理后的生活污水作為雨生紅球藻的培養(yǎng)基，該方法不適合于以獲得保健品和醫(yī)藥原料的天然蝦青素為目的的雨生紅球藻培養(yǎng)，且生活污水成分復(fù)雜多變，質(zhì)量難以控制；而CN104745479采用兩步法培養(yǎng)，但兩個(gè)階段培養(yǎng)基中均需添加一定濃度的多種類(lèi)抗生素以降低污染幾率，這在規(guī)?；囵B(yǎng)中，無(wú)疑會(huì)增加生產(chǎn)成本和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種適合于大規(guī)模雨生紅球藻培養(yǎng)的培養(yǎng)基，尤其在柱狀光生物反應(yīng)器、平板式光生物反應(yīng)器、管道式光生物反應(yīng)器等各類(lèi)規(guī)模化培養(yǎng)裝置中可提高雨生紅球藻的生長(zhǎng)速率，縮短培養(yǎng)周期，快速獲得較高的生物量，提高培養(yǎng)效率。本發(fā)明中培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，原料低價(jià)易得，且配制操作方便，非常適合于規(guī)?；a(chǎn)，為利用雨生紅球藻培養(yǎng)生產(chǎn)天然蝦青素的生產(chǎn)活動(dòng)提供一種更為經(jīng)濟(jì)可靠的培養(yǎng)基配方。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種適合于大規(guī)?？焖倥囵B(yǎng)雨生紅球藻的培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含有下述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：

進(jìn)一步優(yōu)選的，每升培養(yǎng)基中含有下述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述微量元素溶液包括硼、錳、鋅、銅、鈷和鉬六種微量元素。

進(jìn)一步優(yōu)選的，每升微量元素溶液含有：

進(jìn)一步優(yōu)選的，每升微量元素溶液含有：

相對(duì)于目前已有報(bào)道的雨生紅球藻培養(yǎng)基，本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)化了無(wú)機(jī)鹽離子的組成，以NaNO₃提供的氮源為主，以低含量的Ca(NO₃)₂·4H₂O作為氮源的補(bǔ)充，更有利于促進(jìn)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)較低濃度的Ca²⁺也可有效避免傳統(tǒng)規(guī)?；囵B(yǎng)中反應(yīng)器中易結(jié)垢的弊端；該配方避免了有機(jī)氮和磷的使用，降低了培養(yǎng)過(guò)程中微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也減小了紅球藻培養(yǎng)廢水對(duì)環(huán)境造成的壓力；此外，該培養(yǎng)基也通過(guò)調(diào)整磷酸鹽的配比而提高其pH值緩沖能力，從而更有利于維持雨生紅球藻的穩(wěn)定生長(zhǎng)。

本發(fā)明還得到了一種雨生紅球藻的培養(yǎng)方法，將雨生紅球藻于規(guī)模化培養(yǎng)裝置中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中使用權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基。

進(jìn)一步優(yōu)選的，所述規(guī)模化培養(yǎng)裝置包括柱狀光生物反應(yīng)器、平板式光生物反應(yīng)器、開(kāi)放式跑道池光生物反應(yīng)器、管道式光生物反應(yīng)器等。

上述培養(yǎng)基在雨生紅球藻大規(guī)模快速培養(yǎng)的應(yīng)用時(shí)，為方便工廠化操作，將雨生紅球藻的培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分別配制成一定比例的濃縮溶液作為貯備液，使用時(shí)按照比例稀釋制成工作液即可。

本發(fā)明有益效果是：該培養(yǎng)基可促進(jìn)紅球藻細(xì)胞快速增殖，維持細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定的增長(zhǎng)并達(dá)到較高的細(xì)胞密度；培養(yǎng)周期短；同時(shí)接種后藻細(xì)胞快速進(jìn)入分裂增殖期，也有利于提高其抵御高光脅迫、病蟲(chóng)微生物破壞等能力，提高產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)的成功率。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1中利用本發(fā)明培養(yǎng)基配方在250ml三角瓶培養(yǎng)體系中培養(yǎng)雨生紅球藻的情況(與對(duì)照相比)；

圖2為實(shí)施例2中利用本發(fā)明培養(yǎng)基配方在1L柱狀光生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中培養(yǎng)雨生紅球藻的情況(與對(duì)照相比)；

圖3為實(shí)施例3中利用本發(fā)明培養(yǎng)基配方在300L平板光生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中培養(yǎng)雨生紅球藻的情況(與對(duì)照相比)；

圖4為實(shí)施例4中利用本發(fā)明培養(yǎng)基配方在2.5噸管道光生物反應(yīng)器培養(yǎng)體系中培養(yǎng)雨生紅球藻的情況(與對(duì)照相比)；

圖5為試驗(yàn)1中利用本發(fā)明培養(yǎng)基配方在各種規(guī)格培養(yǎng)體系中所培養(yǎng)雨生紅球藻細(xì)胞中蝦青素積累的情況(與對(duì)照相比)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)驗(yàn)實(shí)例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。此處所描述的具體實(shí)施方式僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：250ml三角瓶培養(yǎng)體系雨生紅球藻的培養(yǎng)

1.1培養(yǎng)基各組分儲(chǔ)備液的配制

培養(yǎng)基的配置：每升培養(yǎng)基中含有：①NaNO₃ 800mg、②KH₂PO₄ 150mg、③Na₂HPO₄·12H₂O 150mg、④MgSO₄·7H₂O 90mg、⑤Ca(NO₃)₂·4H₂O 50mg、⑥C₆H₈O₇·H₂O 10mg、⑦NaHCO₃200mg、⑧FeCl₃·6H₂O 3mg、⑨EDTA-Na₂ 5mg、⑩微量元素溶液1ml；其中，每升微量元素溶液含有：H₃BO₃ 1.73mg、MnCl₂·4H₂O 1.11mg、ZnSO₄·7H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.05mg、Co(NO₃)₂·6H₂O 0.05mg、(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.4mg。

在小規(guī)模培養(yǎng)和保種過(guò)程中，為方便操作，節(jié)約時(shí)間，并保證不同培養(yǎng)批次之間的一致性，可將本發(fā)明中培養(yǎng)基各組分按照1:1000的比例進(jìn)行濃縮，配制貯備液，4℃保存。

1.2培養(yǎng)基配制

在新鮮制備的900ml純水中，依次加入上述①-⑩儲(chǔ)備液各1ml，邊加邊充分?jǐn)嚢瑁缓蠖ㄈ葜?000ml，即得雨生紅球藻培養(yǎng)液。121℃，滅菌30分鐘，冷卻至室溫后使用。

1.3雨生紅球藻的接種、培養(yǎng)和生長(zhǎng)測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻種按照1.0×10⁴的起始密度接種于上述制備的培養(yǎng)基中，按照150ml/瓶的裝液量分裝于250ml無(wú)菌三角瓶中，置于25±1℃，光照強(qiáng)度為1500Lux、光：暗比為16:8的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔12h搖動(dòng)一次培養(yǎng)瓶，設(shè)置三個(gè)平行。每48小時(shí)在無(wú)菌操作臺(tái)中搖勻后取樣3ml，用魯哥氏染色液固定后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算生物量和比生長(zhǎng)速率。以綠藻培養(yǎng)中常用的BG11和SM培養(yǎng)基為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2：1L柱狀光生物反應(yīng)器體系雨生紅球藻的培養(yǎng)

1.1培養(yǎng)基配制

在9L新鮮制備的純水中，依次加入實(shí)施例1中1.1所列的培養(yǎng)基儲(chǔ)備液①-⑩各10ml，然后定容至10L，搖勻后，121℃，滅菌30分鐘，冷卻至室溫后使用。

1.2雨生紅球藻的接種、培養(yǎng)和生長(zhǎng)測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻種按照1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml的起始密度接入上述培養(yǎng)基中，搖勻后按照800ml/管分裝于容積為1L的柱狀光生物反應(yīng)器中，置于25±1℃，光照強(qiáng)度為2000Lux，光：暗周期為16:8的培養(yǎng)室中，以120ml/min的速率通入過(guò)濾空氣。每48小時(shí)在無(wú)菌操作臺(tái)中搖勻后取樣3ml，用魯哥氏染色液固定后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算生物量和比生長(zhǎng)速率。以藻類(lèi)培養(yǎng)中常用的BG11和SM培養(yǎng)基為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖2。

實(shí)施例3：300L平板式光生物反應(yīng)器體系雨生紅球藻的培養(yǎng)

1.1培養(yǎng)基配制

在300L平板式光生物反應(yīng)器中盛入200L新鮮制備的純水，按照實(shí)施例1的配方，依次稱(chēng)?、?⑩各組分并分別用10L新鮮制備的純水充分溶解后，再依次加入反應(yīng)器即可。

1.2雨生紅球藻的接種、培養(yǎng)和生長(zhǎng)測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻種按照1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml的起始密度接入上述反應(yīng)器中，置于25±1℃，光照強(qiáng)度為2000Lux培養(yǎng)室中連續(xù)光照培養(yǎng)，以150ml/min的速率通入過(guò)濾空氣。每48小時(shí)取樣3ml，用魯哥氏染色液固定后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算生物量和比生長(zhǎng)速率。以綠藻培養(yǎng)中常用的BG11和SM培養(yǎng)基為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖3。

實(shí)施例4：2.5噸管道式光生物反應(yīng)器體系雨生紅球藻的培養(yǎng)

1.1培養(yǎng)基配制

在有效容積為2.5噸的中試規(guī)模管道式光生物反應(yīng)器中預(yù)裝入最終培養(yǎng)體積約80％的新鮮制備的純水。按照實(shí)施例1培養(yǎng)基配方，依次稱(chēng)取①-⑩各組分，并分別用50L新鮮制備的純水充分溶解，然后依次通過(guò)壓力泵將各溶液加入到管道培養(yǎng)體系中，并保持管道內(nèi)培養(yǎng)基循環(huán)4-6小時(shí)，以充分混合各營(yíng)養(yǎng)組分。

1.2雨生紅球藻的接種、培養(yǎng)和生長(zhǎng)測(cè)定

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻種按照1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml的初始密度接入上述反應(yīng)器中，在室外自然光照條件下培養(yǎng)(調(diào)節(jié)泵流速使管道培養(yǎng)物以0.4m/s的速度循環(huán)，通氣速率50L/min)。每48小時(shí)取樣，用魯哥氏染色液固定后，于顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算生物量和比生長(zhǎng)速率。以綠藻培養(yǎng)中常用的BG11和SM培養(yǎng)基為對(duì)照組，結(jié)果見(jiàn)圖4。

試驗(yàn)1：雨生紅球藻中蝦青素含量的比較試驗(yàn)

1.1不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)體系培養(yǎng)雨生紅球藻累積蝦青素的誘導(dǎo)

為檢驗(yàn)本發(fā)明培養(yǎng)基配方對(duì)雨生紅球藻中蝦青素積累量的影響，14天培養(yǎng)結(jié)束后，從實(shí)施例1-4各培養(yǎng)體系中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)物中取300ml藻液，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，棄去上清液，收獲藻細(xì)胞，再加入新鮮制備的無(wú)氮培養(yǎng)基，即本發(fā)明培養(yǎng)基配方中不添加①和⑤號(hào)組分，而添加終濃度為40mg/L的CaCl₂·2H₂O，同時(shí)置于4500-5000Lux光照強(qiáng)度下，誘導(dǎo)蝦青素積累，顯微鏡下檢查待全部實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞中色素轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色后，停止誘導(dǎo)，離心收集藻細(xì)胞，純水洗滌細(xì)胞表面3次，將最終收獲得到的藻細(xì)胞冷凍干燥。

1.2蝦青素的提取、分析和含量計(jì)算

精確稱(chēng)取500毫克5.1中冷凍干燥的藻細(xì)胞于搪瓷碾砵中，加入液氮預(yù)凍后，用2ml提取溶劑(V_二氯甲烷：V_甲醇＝2:1)和少量石英砂碾磨提取2分鐘，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心后，含色素的上清液轉(zhuǎn)移至10ml棕色容量瓶中。重復(fù)該提取步驟2-3次，至藻體成白色為止，合并提取液并定容至10ml。采用722S型分光光度計(jì)和lcm光徑的比色杯，分別測(cè)定480、645、663nm波長(zhǎng)下色素提取液的光吸收值(OD值)。按公式計(jì)算蝦青素含量：

蝦青素量(％)＝[4.6×10^-4×(OD₄₈₀-0.638×OD₆₄₅+0.114×OD₆₆₃)×10ml]/500mg，結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5對(duì)照1和對(duì)照2所選用的培養(yǎng)物分別選取實(shí)施例1-4中對(duì)照1和對(duì)照2中的藻液。

實(shí)施例5

一種雨生紅球藻的培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含有下述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：①NaNO₃ 600mg、②KH₂PO₄ 120mg、③Na₂HPO₄·12H₂O 120mg、④MgSO₄·7H₂O 70mg、⑤Ca(NO₃)₂·4H₂O 20mg、⑥C₆H₈O₇·H₂O 5mg、⑦NaHCO₃ 150mg、⑧FeCl₃·6H₂O 2mg、⑨EDTA-Na₂ 3mg、⑩微量元素溶液1ml；其中，每升微量元素溶液含有：H₃BO₃ 1.0mg、MnCl₂·4H₂O 1.0mg、ZnSO₄·7H₂O 0.1mg、CuSO₄·5H₂O 0.01mg、Co(NO₃)₂.6H₂O 0.01mg、(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.2mg。

該配方與實(shí)施例1的配方相比，降低了各組分的含量。利用該培養(yǎng)基在管道式光生物反應(yīng)器中，經(jīng)14天培養(yǎng)結(jié)束后雨生紅球藻生物量達(dá)到48.5×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml，略低于本發(fā)明中優(yōu)選配方的最高生物量56.26×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml，高于對(duì)照組41.3×10⁴和39.7×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml。

實(shí)施例6

一種雨生紅球藻的培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基中含有下述營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：①NaNO₃ 1000mg、②KH₂PO₄ 160mg、③Na₂HPO₄·12H₂O 160mg、④MgSO₄·7H₂O 100mg、⑤Ca(NO₃)₂·4H₂O 55mg、⑥C₆H₈O₇·H₂O 15mg、⑦NaHCO₃ 220mg、⑧FeCl₃·6H₂O 6mg、⑨EDTA-Na₂ 8mg、⑩微量元素溶液2ml；其中，每升微量元素溶液含有：H₃BO₃ 2.0mg、MnCl₂·4H₂O 1.5mg、ZnSO₄·7H₂O 0.4mg、CuSO₄·5H₂O 0.15mg、Co(NO₃)₂.6H₂O 0.15mg、(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O 0.6mg。

該配方與實(shí)施例1的配方相比，提高了各組分的含量。利用該培養(yǎng)基在管道式光生物反應(yīng)器中，經(jīng)14天培養(yǎng)結(jié)束后雨生紅球藻生物量平均達(dá)到58.7×10⁴個(gè)細(xì)胞/ml。

本發(fā)明所給出的具體實(shí)施方式是為了進(jìn)一步解釋本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以?xún)?nèi)。