本發(fā)明涉及醫(yī)用試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)：

大腸癌是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，也是我國(guó)發(fā)病率上升最快的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率均排在癌癥譜的前三位。原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是建立大腸癌體外研究模型，進(jìn)而研究大腸癌的有效手段，同時(shí)也是分離純化大腸癌細(xì)胞株的必要步驟，因而對(duì)于大腸癌的研究具有極為重要的意義。

但是，總體看來，對(duì)大腸癌直接進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率較低，僅為9％-30％。

現(xiàn)有技術(shù)中，影響大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)成功率的因素主要包括：

首先，腸道中細(xì)菌豐富，大腸癌標(biāo)本極易污染，需要多種抗生素及消毒劑反復(fù)處理，滅菌過程非常繁瑣，且效果難以保證。

其次，對(duì)于大腸癌標(biāo)本的處理缺乏簡(jiǎn)捷、標(biāo)準(zhǔn)的流程，組織細(xì)胞的分離與消化過程缺乏有效的方法，導(dǎo)致培養(yǎng)成功率低下。

第三，原代培養(yǎng)基的成分直接決定了成功率的高低，原代細(xì)胞培養(yǎng)基需要添加多種激素、細(xì)胞因子和其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以保證腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。傳統(tǒng)的方法要么成分不足，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；要么配方復(fù)雜，配置過程繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用方法，其能夠提高大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，從而更加適于實(shí)用。

為了達(dá)到上述第一個(gè)目的，本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包括第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑，

所述第一試劑中的有效成分包括絡(luò)合碘，其有效碘的質(zhì)量濃度為5000mg/L；

所述第二試劑中的有效成分及物質(zhì)的量濃度包括：EDTA，0.5mmol/L；NaCl，137mmol/L；KCl，2.7mmol/L；Na₂HPO₄·12H₂O，10mmol/L；K₂HPO₄，1.76mmol/L

所述第三試劑中的有效成分包括NaClO，其質(zhì)量百分含量的取值范圍為8％～12％；

所述第四試劑中的有效成分及質(zhì)量濃度包括：膠原酶I，10mg/mL；膠原酶Ⅱ，10mg/mL；膠原酶IV，5mg/L；

所述第五試劑中的有效成分及含量包括：EGF，5μg；Y27632，1.6mg；氫化可的松，250μg；霍亂毒素，4.2μg；PBS溶液：5mL；

所述第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑分別單獨(dú)封裝，其中，所述第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑的體積份數(shù)比為200mL∶200mL∶20mL∶5mL∶5mL。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

作為優(yōu)選，所述第一試劑的保存條件包括常溫、避光。

作為優(yōu)選，所述第二試劑的保存條件包括常溫。

作為優(yōu)選，所述第三試劑的保存條件包括常溫、避光。

作為優(yōu)選，所述第四試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～1.5個(gè)月。

作為優(yōu)選，所述第五試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～1.5個(gè)月。

作為優(yōu)選，所述大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還包括第一封裝容器、第二封裝容器、第三封裝容器、第四封裝容器、第五封裝容器和卡盤，

所述第一封裝容器用于封裝所述第一試劑，所述第二封裝容器用于封裝所述第二試劑，所述第三封裝容器用于封裝所述第三試劑，所述第四封裝容器用于封裝所述第四試劑，所述第五封裝容器用于封裝所述第五試劑；

所述卡盤包括卡盤本體，所述卡盤本體上至少設(shè)有第一通孔、第二通孔、第三通孔、第四通孔和第五通孔；

所述第一封裝容器能夠穿設(shè)于所述第一通孔中，所述第二封裝容器能夠穿設(shè)于所述第二通孔中，所述第三封裝容器能夠穿設(shè)于所述第三通孔中，所述第四封裝容器能夠穿設(shè)于所述第四通孔中，所述第五封裝容器能夠穿設(shè)于所述第五通孔中。

作為優(yōu)選，

所述第一封裝容器與所述第一通孔間隙配合；和/或，

所述第二封裝容器與所述第二通孔間隙配合；和/或，

所述第三封裝容器與所述第三通孔間隙配合；和/或，

所述第四封裝容器與所述第四通孔間隙配合；和/或，

所述第五封裝容器與所述第五通孔間隙配合。

作為優(yōu)選，所述第一封裝容器和/或第二封裝容器和/或第三封裝容器和/或第四封裝容器和/或第五封裝容器的底面呈圓弧狀過渡。

作為優(yōu)選，所述大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還包括包裝盒，所述包裝盒包括盒體，所述盒體的橫截面形狀與所述卡盤的形狀相適配。

作為優(yōu)選，所述包裝盒還包括上蓋，所述上蓋能夠覆蓋住所述盒體。

作為優(yōu)選，所述上蓋與所述盒體為分體式結(jié)構(gòu)。

作為優(yōu)選，所述上蓋與所述盒體之間鉸接。

作為優(yōu)選，所述盒體上設(shè)有一卡扣結(jié)構(gòu)的子端，所述上蓋上設(shè)有所述卡扣結(jié)構(gòu)的母端，所述子端與所述母端相適配。

作為優(yōu)選，所述卡盤的形狀選自矩形或者圓形。

為了達(dá)到上述第二個(gè)目的，本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法包括以下步驟：

取200mg～500mg大腸癌腫瘤組織，于超凈工作臺(tái)中將所述大腸癌腫瘤組織置入第一離心管，得到第一產(chǎn)物；

于超凈工作臺(tái)中向所述第一產(chǎn)物中加入所述第一試劑，所述第一試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第二產(chǎn)物；

于超凈工作臺(tái)吸凈所述第一離心管內(nèi)的第一試劑后，將處于所述第一離心管內(nèi)的大腸癌腫瘤組織置入第二離心管，得到第三產(chǎn)物；

向所述第三產(chǎn)物中加入所述第二試劑，所述第二試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第四產(chǎn)物；

于超凈工作臺(tái)上配置所述第三試劑的PBS稀釋液，其中，在稀釋時(shí)，所述第三試劑與PBS溶液的體積比的取值范圍為1∶(6～12)；

于超凈工作臺(tái)上取出所述第二離心管中的腫瘤組織置入到第三離心管中，并向所述第三離心管中加入10mL～25mL所述第三試劑的PBS稀釋液，混勻后得到第五產(chǎn)物；

于超凈工作臺(tái)上取出所述第三離心管中的大腸癌腫瘤組織置入到第四離心管中，向所述第四離心管中加入10mL～25mL無菌PBS緩沖液，混勻后置于搖床40-60rpm轉(zhuǎn)速下5-10分鐘，并重復(fù)此步驟；

于超凈工作臺(tái)上吸凈所述第四離心管內(nèi)的PBS緩沖液后，將大腸癌腫瘤組織置入組織凍存管中，得到第六產(chǎn)物；

應(yīng)用無菌剪刀將所述第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物；

向所述第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL所述第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育50-60分鐘，使得所述第七產(chǎn)物消化后，得到第八產(chǎn)物；

向300mL～600mL含有8％～15％(wt)胎牛血清及抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入所述第五試劑并混勻，得到孵育培養(yǎng)基；

于超凈工作臺(tái)上將所述第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，向所述培養(yǎng)皿內(nèi)加入所述孵育培養(yǎng)基，并于37℃條件下在孵箱中進(jìn)行大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法還可采用以下技術(shù)措施進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。

作為優(yōu)選，所述混勻的方法包括顛倒和/或應(yīng)用搖床。

作為優(yōu)選，于超凈工作臺(tái)上將所述第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，還包括靜置5min～10min的步驟。

作為優(yōu)選，應(yīng)用無菌剪刀將所述第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物過程中，所述第六產(chǎn)物被剪碎的標(biāo)志是所述第六產(chǎn)物為糊狀，且其中無肉眼可見的團(tuán)塊。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒在應(yīng)用過程中，應(yīng)用第一試劑進(jìn)行了一次消毒，之后，所有的操作都是在無菌的環(huán)境下進(jìn)行操作，相當(dāng)于提供了一種二步滅菌法，其不僅簡(jiǎn)化了大腸癌標(biāo)本的處理流程，還能夠減少抗生素的使用，因此，能夠基本上實(shí)現(xiàn)零污染；并且，該試劑盒在應(yīng)用過程中應(yīng)用的消化方法是向第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育40-60分鐘，使得第七產(chǎn)物消化，與單純機(jī)械分離相比，能夠減少大腸癌細(xì)胞在這一過程中的損失，并且能夠減少操作過程中的污染，并提高消化效率。此外，該試劑盒將大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)用到的第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑分別單獨(dú)封裝，在應(yīng)用過程中，無需重復(fù)配制該各試劑，因此能夠使得操作過程得到簡(jiǎn)化，從而提高大腸癌原代細(xì)胞的培養(yǎng)效率。

附圖說明

通過閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。而且在整個(gè)附圖中，用相同的參考符號(hào)表示相同的部件。在附圖中：

圖1為本發(fā)明實(shí)施例一提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的盒體結(jié)構(gòu)示意圖(圖中，各試劑未示出)；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例一提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒中應(yīng)用的卡盤的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的盒體結(jié)構(gòu)示意圖(圖中，各試劑未示出)；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒中應(yīng)用的卡盤的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例一或者實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒中應(yīng)用的第一封裝容器和/或第二封裝容器和/或第三封裝容器和/或第四封裝容器和/或第五封裝容器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例三提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法步驟流程圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用方法，其能夠提高大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的成功率，從而更加適于實(shí)用。

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效,以下結(jié)合附圖及較佳實(shí)施例，對(duì)依據(jù)本發(fā)明提出的大腸癌原代細(xì)胞試劑盒及其應(yīng)用方法，其具體實(shí)施方式、結(jié)構(gòu)、特征及其功效，詳細(xì)說明如后。在下述說明中，不同的“一實(shí)施例”或“實(shí)施例”指的不一定是同一實(shí)施例。此外，一或多個(gè)實(shí)施例中的特定特征、結(jié)構(gòu)、或特點(diǎn)可由任何合適形式組合。

本文中術(shù)語“和/或”，僅僅是一種描述關(guān)聯(lián)對(duì)象的關(guān)聯(lián)關(guān)系，表示可以存在三種關(guān)系，例如，A和/或B，具體的理解為：可以同時(shí)包含有A與B，可以單獨(dú)存在A，也可以單獨(dú)存在B，能夠具備上述三種任一種情況。

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒包括第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑。

第一試劑中的有效成分包括絡(luò)合碘，其有效碘的質(zhì)量濃度為5000mg/L；

第二試劑中的有效成分及物質(zhì)的量濃度包括：EDTA，0.5mmol/L；NaCl，137mmol/L；KCl，2.7mmol/L；Na₂HPO₄·12H₂O，10mmol/L；K₂HPO₄，1.76mmol/L

第三試劑中的有效成分包括NaClO，其質(zhì)量百分含量的取值范圍為8％～12％；

第四試劑中的有效成分及質(zhì)量濃度包括：膠原酶I，10mg/mL；膠原酶Ⅱ，10mg/mL；膠原酶IV，5mg/L；

第五試劑中的有效成分及含量包括：EGF，5μg；Y27632(廠家Abcam；貨號(hào)：ab120129；批號(hào)：GR195774-32)，1.6mg；氫化可的松，250μg；霍亂毒素，4.2μg；PBS溶液：5mL；

第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑分別單獨(dú)封裝，其中，第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑、第五試劑的體積份數(shù)比為200mL∶200mL∶20mL∶5mL∶5mL。

其中，第一試劑的保存條件包括常溫、避光。

其中，第二試劑的保存條件包括常溫。

其中，第三試劑的保存條件包括常溫、避光。

其中，第四試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～2個(gè)月。

其中，第五試劑的保存條件包括0℃～4℃溫度下保存0.5個(gè)月～2個(gè)月。

本實(shí)施例中，大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒還包括第一封裝容器(圖中未示出)、第二封裝容器(圖中未示出)、第三封裝容器(圖中未示出)、第四封裝容器(圖中未示出)、第五封裝容器(圖中未示出)和卡盤(附圖1和附圖2中標(biāo)號(hào)為101，附圖3和附圖4中標(biāo)號(hào)為201)。第一封裝容器(圖中未示出)用于封裝第一試劑，第二封裝容器(圖中未示出)用于封裝第二試劑，第三封裝容器(圖中未示出)用于封裝第三試劑，第四封裝容器(圖中未示出)用于封裝第四試劑，第五封裝容器(圖中未示出)用于封裝第五試劑。在附圖1和附圖2所示的實(shí)施例一中，卡盤101包括卡盤本體102，卡盤本體102上至少設(shè)有第一通孔103、第二通孔104、第三通孔105、第四通孔106和第五通孔107；第一封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第一通孔103中，第二封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第二通孔104中，第三封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第三通孔105中，第四封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第四通孔106中，第五封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第五通孔107中。在附圖3和附圖4所示的實(shí)施例二中，卡盤201包括卡盤本體202，卡盤本體202上至少設(shè)有第一通孔203、第二通孔204、第三通孔205、第四通孔206和第五通孔207；第一封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第一通孔203中，第二封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第二通孔204中，第三封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第三通孔205中，第四封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第四通孔206中，第五封裝容器(圖中未示出)能夠穿設(shè)于第五通孔207中。

其中，第一封裝容器(圖中未示出)與第一通孔(實(shí)施例一的103，實(shí)施例二的203)間隙配合；和/或，第二封裝容器(圖中未示出)與第二通孔(實(shí)施例一的104，實(shí)施例二的204)間隙配合；和/或，第三封裝容器(圖中未示出)與第三通孔(實(shí)施例一的105，實(shí)施例二的205)間隙配合；和/或，第四封裝容器(圖中未示出)與第四通孔(實(shí)施例一的106，實(shí)施例二的206)間隙配合；和/或，第五封裝容器(圖中未示出)與第五通孔(實(shí)施例一的107，實(shí)施例二的207)間隙配合。在這種情況下，由于各封裝容器(圖中未示出)在各通孔中的剩余活動(dòng)空間較小，能夠避免各封裝容器(圖中未示出)發(fā)生傾倒，避免各試劑的損失或者污染。

參見附圖5，第一封裝容器和/或第二封裝容器和/或第三封裝容器和/或第四封裝容器和/或第五封裝容器的底面呈圓弧狀過渡，本實(shí)施例中，標(biāo)號(hào)301概括表示各封裝容器，標(biāo)號(hào)302表示設(shè)置于各封裝容器底面的圓弧狀過渡，在這種情況下，能夠避免由于封裝容器底部的死角而導(dǎo)致的試劑中容質(zhì)的沉積，進(jìn)一步保證各封裝容器內(nèi)的各試劑均一穩(wěn)定，降低操作誤差。

其中，還包括包裝盒(實(shí)施例一中的108，實(shí)施例二中的208)，包裝盒(實(shí)施例一中的108，實(shí)施例二中的208)包括盒體(實(shí)施例一中的111，實(shí)施例二中的211)，盒體(實(shí)施例一中的111，實(shí)施例二中的211)的橫截面形狀與卡盤(實(shí)施例一中的101，實(shí)施例二中的201)的形狀相適配，在這種情況下，能夠保證卡盤(實(shí)施例一中的101，實(shí)施例二中的201)在盒體(實(shí)施例一中的109，實(shí)施例二中的209)內(nèi)與側(cè)壁(實(shí)施例一中的111，實(shí)施例二中的211)之間不發(fā)生傾斜，更進(jìn)一步避免各封裝容器(圖中未示出)發(fā)生傾倒，避免各試劑的損失或者污染。

其中，包裝盒(實(shí)施例一中的108，實(shí)施例二中的208)還包括上蓋(實(shí)施例一中的112，實(shí)施例二中的212)，上蓋(實(shí)施例一中的112，實(shí)施例二中的212)能夠覆蓋住盒體(實(shí)施例一中的109，實(shí)施例二中的209)，在這種情況下，能夠避免本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒在運(yùn)輸或者攜帶過程中，各封裝容器(圖中未示出)丟失。

其中，參見附圖3，在本發(fā)明實(shí)施例二提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒208中，作為上蓋212與盒體209之間的一種配合方式，上蓋212與盒體209之間可以為分體式結(jié)構(gòu)。在這種前提下，上蓋212與盒體209之間還可以采用螺紋連接或者嵌合配合的方式實(shí)現(xiàn)配合。

其中，參見附圖1，在本發(fā)明實(shí)施例一提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒108中，作為上蓋112與盒體109之間的又一種配合方式，上蓋112與盒體109之間鉸接。本實(shí)施例中，上蓋112與盒體109通過其側(cè)壁的其中一條邊沿116實(shí)現(xiàn)鉸接，上蓋112可以以該邊沿116為旋轉(zhuǎn)中心旋轉(zhuǎn)，實(shí)現(xiàn)上蓋112的開啟或者關(guān)閉，此時(shí)，該盒體的材質(zhì)可以為紙、塑料等材質(zhì)；有時(shí)，為了使得該鉸接更加合理，還可以在該處設(shè)置合頁(yè)等配件。

本實(shí)施例中，上蓋112的一端還設(shè)有蓋緣113，此時(shí)，當(dāng)上蓋110覆蓋住盒體109時(shí)，該蓋緣113能夠附著在盒體109的側(cè)壁111上，能夠進(jìn)一步地保證盒體109被上蓋110全面覆蓋，從而保證盒體109的封裝效果。

其中，盒體(實(shí)施例一的109，實(shí)施例二的209)上設(shè)有一卡扣結(jié)構(gòu)的子端(實(shí)施例一的114，實(shí)施例二的214)，上蓋(實(shí)施例一的110，實(shí)施例二的210)上設(shè)有卡扣結(jié)構(gòu)的母端(實(shí)施例一的115，實(shí)施例二的215)，子端(實(shí)施例一的114，實(shí)施例二的214)與母端(實(shí)施例一的115，實(shí)施例二的215)相適配。此時(shí)，能夠避免上蓋(實(shí)施例一的110，實(shí)施例二的210)從盒體(實(shí)施例一的109，實(shí)施例二的209)上丟失，進(jìn)一步降低各封裝容器(圖中未示出)丟失的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

其中，卡盤的形狀選自矩形(實(shí)施例一)或者圓形(實(shí)施例二)。

參見附圖6，本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒的應(yīng)用方法包括以下步驟：

步驟S1：取200mg～500mg大腸癌腫瘤組織，于超凈工作臺(tái)中將大腸癌腫瘤組織置入第一離心管并混勻，得到第一產(chǎn)物；

步驟S2：向第一產(chǎn)物中加入第一試劑，第一試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第二產(chǎn)物，蓋緊蓋子，室溫下置于搖床40rpm～60rpm，15min～20min；

步驟S3：于超凈工作臺(tái)吸凈第一離心管內(nèi)的第一試劑后，將處于第一離心管內(nèi)的大腸癌腫瘤組織置入第二離心管，得到第三產(chǎn)物；

步驟S4：向第三產(chǎn)物中加入第二試劑，第二試劑的加入量的取值范圍為10mL～25mL，并混勻，得到第四產(chǎn)物，蓋緊蓋子，室溫下置于搖床40rpm～60rpm，8min～10min；

步驟S5：于超凈工作臺(tái)上配置第三試劑的PBS稀釋液，其中，在稀釋時(shí)，第三試劑與PBS溶液的體積比的取值范圍為1∶(6～12)；

步驟S6：于超凈工作臺(tái)上取出第二離心管中的腫瘤組織置入到第三離心管中，并向第三離心管中加入10mL～25mL第三試劑的PBS稀釋液，混勻后得到第五產(chǎn)物，蓋緊蓋子，室溫下置于搖床40rpm～60rpm，15min～20min；

步驟S7：于超凈工作臺(tái)上取出第三離心管中的大腸癌腫瘤組織置入到第四離心管中，向第四離心管中加入10mL～25mL無菌PBS緩沖液，混勻后取出，置入第五離心管，并重復(fù)此步驟，直至使得大腸癌腫瘤組織置入到第N離心管；

步驟S8：于超凈工作臺(tái)上吸凈第N離心管內(nèi)的PBS緩沖液后，將處于第N離心管內(nèi)的大腸癌腫瘤組織置入組織凍存管中，得到第六產(chǎn)物；

步驟S9應(yīng)用無菌剪刀將第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物；

步驟S10：向第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育1h以上，使得第七產(chǎn)物消化后，得到第八產(chǎn)物；

步驟S11：向300mL～600mL含有8％～15％(wt)胎牛血清及抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入第五試劑并混勻，得到孵育培養(yǎng)基；

步驟S12：于超凈工作臺(tái)上將第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，向培養(yǎng)皿內(nèi)加入孵育培養(yǎng)基，并于37℃條件下在孵箱中進(jìn)行大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)。

其中，混勻的方法包括顛倒和/或應(yīng)用搖床。

其中，于超凈工作臺(tái)上將第八產(chǎn)物移入培養(yǎng)皿后，還包括靜置5min～10min的步驟，從而保證消化后的腫瘤組織均勻地鋪滿培養(yǎng)皿底部，增強(qiáng)大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性。

其中，應(yīng)用無菌剪刀將第六產(chǎn)物剪碎，得到第七產(chǎn)物過程中，第六產(chǎn)物被剪碎的標(biāo)志是第六產(chǎn)物為糊狀，且其中無肉眼可見的團(tuán)塊。

實(shí)施例3～22表1

實(shí)施例3～22續(xù)表1-2

實(shí)施例3～22續(xù)表1-3

本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒在應(yīng)用過程中，應(yīng)用第一試劑進(jìn)行了一次消毒，之后，所有添加試劑和處理組織的操作都是在無菌的環(huán)境下進(jìn)行，相當(dāng)于提供了一種二步滅菌法，其不僅簡(jiǎn)化了大腸癌標(biāo)本的處理流程，還能夠減少抗生素的使用，因此，能夠基本上實(shí)現(xiàn)零污染；并且，該試劑盒在應(yīng)用過程中應(yīng)用的消化方法是向第七產(chǎn)物中加入200μL～500μL第四試劑后將其置于37℃孵箱，第一次孵育1h以上，使得第七產(chǎn)物消化，與機(jī)械分離相比，能夠減少大腸癌細(xì)胞在這一過程中的損失，并且能夠減少操作過程中的污染，并提高消化效率。此外，該試劑盒將大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)用到的第一試劑、第二試劑、第三試劑、第四試劑和第五試劑分別單獨(dú)封裝，在應(yīng)用過程中，無需重復(fù)配制該各試劑，因此能夠使得操作過程得到簡(jiǎn)化，從而提高大腸癌原代細(xì)胞的培養(yǎng)效率。此外，從本發(fā)明實(shí)施例3～22的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，可知，應(yīng)用本發(fā)明提供的大腸癌原代細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒，能夠使得培養(yǎng)成功率達(dá)到50％～60％。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。