大腸癌的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
本發(fā)明涉及大腸癌的檢測(cè)方法。更詳細(xì)地，本發(fā)明涉及應(yīng)用針對(duì)樣品中的外來體(Exosome)表面的特定抗原(⑶9、⑶63、⑶147)的單克隆抗體或它們的抗體片段的用于檢測(cè)大腸癌的存在的方法、評(píng)價(jià)大腸癌的治療效果的方法、和這些方法中應(yīng)用的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]
外來體是生物體內(nèi)的體液中存在的囊泡顆粒。已知外來體表面與一般細(xì)胞表面同樣地存在各種膜蛋白質(zhì)。另外，據(jù)報(bào)告外來體從各種細(xì)胞例如免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和各種癌細(xì)胞分泌，并且注意到其作為生物體內(nèi)的細(xì)胞間通訊的媒介發(fā)揮作用并與生理現(xiàn)象相關(guān)、與癌癥等疾病相關(guān)。
[0003]例如，非專利文獻(xiàn)I報(bào)告，從卵巢癌患者的腹水和血中分離外來體，外來體在免疫系統(tǒng)細(xì)胞中攝取抑制免疫，從而腫瘤增大。外來體的檢測(cè)中，應(yīng)用CD24、ADAMlO, CD9的抗體。
[0004]另外，專利文獻(xiàn)I公開，應(yīng)用⑶9、⑶31、⑶63、⑶81、⑶82、⑶37、⑶53等作為生物體中存在的囊泡的表面標(biāo)志物進(jìn)行各種癌的診斷。非專利文獻(xiàn)2公開，HAbl8G/CD147在28種癌細(xì)胞中比正常細(xì)胞表達(dá)多，因此該蛋白質(zhì)的單克隆抗體可用作腫瘤生物標(biāo)志物。非專利文獻(xiàn)3報(bào)告，胃癌患者的血漿中存在的微囊泡中，MAGE-1和HER-2/neu的表達(dá)增加。非專利文獻(xiàn)4公開了測(cè)定血清中的CA19-9的用于癌抗原診斷的試劑盒。
[0005]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)
專利文獻(xiàn)1:W02012/115885號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)
非專利文獻(xiàn) 1:Sascha Keller, et al., Cancer Letters, 2009, 278, p73_81非專利文獻(xiàn) 2:Yu Li, et al.，Histopathology, 2009，54，p677_687非專利文南犬 3:Jaroslaw Baran, et al., Cancer Tmmunol Immunother, 2010, 59,P841-850
非專利文獻(xiàn)4:AxSYM(注冊(cè)商標(biāo))CA 19-9 Dynapack(注冊(cè)商標(biāo))插頁，ABBOTT JAPAN公司。
[0006]發(fā)明概述
發(fā)明要解決的課題
將外來體等囊泡顆粒中存在的膜蛋白質(zhì)作為生物標(biāo)志物來檢測(cè)癌是可能的。但是，由于取決于樣品的種類和應(yīng)用的抗體、靈敏度和特異性的變化大等理由，難以獲得滿意的結(jié)果，在此之前的癌的診斷中，有時(shí)為假陽性，在診斷準(zhǔn)確性方面存在問題。因此，為了通過檢測(cè)外來體準(zhǔn)確性好地檢測(cè)癌，進(jìn)一步技術(shù)開發(fā)是需要的。
[0007]本發(fā)明的課題是，提供通過測(cè)定外來體檢測(cè)大腸癌的方法、和在該方法中應(yīng)用的試劑盒。
[0008]解決課題的手段
本發(fā)明涉及以下[I]?[7]。
[0009][I]大腸癌的檢測(cè)方法，其包括下列步驟:
應(yīng)用抗CD147單克隆抗體或其片段，測(cè)定得自被測(cè)試者的體液樣品中表達(dá)CD147的外來體量，和
比較前述步驟中外來體的信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)照者中的信號(hào)強(qiáng)度，
其中，發(fā)現(xiàn)前述被測(cè)試者中的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)照者中的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)的情況作為大腸癌存在的指標(biāo)。
[0010][2]大腸癌的檢測(cè)方法，其包括下列步驟:
應(yīng)用選自抗CD9單克隆抗體和其片段、抗CD63單克隆抗體和其片段的至少I種，以及抗CD147單克隆抗體或其片段，測(cè)定得自被測(cè)試者的體液樣品中表達(dá)CD9和/或CD63以及⑶147的外來體量，和
比較前述步驟中外來體的信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)照者中的信號(hào)強(qiáng)度，
其中，發(fā)現(xiàn)前述被測(cè)試者中的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)照者中的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)的情況作為大腸癌存在的指標(biāo)。
[0011][3]大腸癌治療的評(píng)價(jià)方法，其包括下列步驟:
應(yīng)用選自抗CD9單克隆抗體和其片段、抗CD63單克隆抗體和其片段的至少I種，以及抗CD147單克隆抗體或其片段，測(cè)定得自治療后的被測(cè)試者的體液樣品中表達(dá)CD9和/或⑶63以及⑶147的外來體量，和
比較前述步驟中外來體的信號(hào)強(qiáng)度與治療前的被測(cè)試者中的信號(hào)強(qiáng)度，
所述方法包括，在發(fā)現(xiàn)治療后的信號(hào)強(qiáng)度比治療前的信號(hào)強(qiáng)度弱的情況下，將前述治療評(píng)價(jià)為具有大腸癌的治療效果的步驟。
[0012][4]用于在前述[I]?[3]中任一項(xiàng)記載的方法中使用的試劑盒，其含有抗⑶147單克隆抗體或其片段。
[0013][5]用于在前述[2]或[3]記載的方法中使用的試劑盒，其含有抗CD9單克隆抗體和/或抗CD63單克隆抗體或者它們的片段、以及抗CD147單克隆抗體或其片段。
[0014][6]外來體作為大腸癌的標(biāo)志物的應(yīng)用，所述外來體通過下列識(shí)別:選自抗CD9單克隆抗體和其片段、抗CD63單克隆抗體和其片段的至少I種，以及抗CD147單克隆抗體或其片段。
[0015][7]提供大腸癌或懷疑大腸癌的信息的方法，其特征在于，從得自被測(cè)試者的體液樣品中檢測(cè)外來體，所述外來體通過下列識(shí)別:選自抗CD9單克隆抗體和其片段、抗CD63單克隆抗體和其片段的至少I種，以及抗CD147單克隆抗體或其片段。
[0016]發(fā)明的效果
根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠通過測(cè)定外來體檢測(cè)大腸癌而不存在假陽性的擔(dān)心，由此能夠判斷大腸癌發(fā)生的有無或進(jìn)展程度。
[0017]附圖簡述
【圖1】圖1顯示應(yīng)用得自人大腸癌細(xì)胞系HCT116的外來體的蛋白質(zhì)組分析結(jié)果。
[0018]【圖2】圖2顯示通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)⑶147的結(jié)果。各泳道泳動(dòng)500ng的外來體提取液，應(yīng)用抗CD147小鼠單克隆抗體檢測(cè)。
[0019]【圖3】圖3顯示應(yīng)用ExoScreen法，在得自大腸癌細(xì)胞系的外來體中⑶147的檢測(cè)結(jié)果。生物素化抗體WD147，受體珠綴合抗體WD9。
[0020]【圖4】圖4顯示應(yīng)用ExoScreen法，在得自大腸癌患者血清的外來體中⑶147的檢測(cè)結(jié)果。生物素化抗體；⑶147，受體珠綴合抗體；⑶63 (左圖)、⑶9 (右圖)。
[0021]【圖5】圖5顯示應(yīng)用ExoScreen法，在得自大腸癌患者血清的外來體中⑶147的檢測(cè)結(jié)果。生物素化抗體WD147，受體珠綴合抗體WD9。
[0022]【圖6】圖6比較大腸癌患者血清中，得自外來體的⑶147、CEAjPCA19-9各自的檢測(cè)結(jié)果。
[0023]【圖7A】圖7A顯示以得自外來體的⑶147為指標(biāo)診斷大腸癌的情況下(圖5)的ROC分析結(jié)果。
[0024]【圖7B】圖7B顯示以CEA為指標(biāo)診斷大腸癌的情況下的ROC分析結(jié)果。
[0025]【圖7C】圖7C顯示以CA19-9為指標(biāo)診斷大腸癌的情況下的ROC分析結(jié)果。
[0026]【圖8】圖8顯示應(yīng)用ExoScreen法，得自術(shù)前和術(shù)后大腸癌患者血清的外來體中CD 147的檢測(cè)結(jié)果。各數(shù)據(jù)中央的線顯示檢測(cè)結(jié)果的中值。生物素化抗體；CD147，受體珠綴合抗體WD9。
[0027]實(shí)施本發(fā)明的方式
本發(fā)明是用于檢測(cè)被測(cè)試者中大腸癌的方法，其大的特征在于，應(yīng)用特定的單克隆抗體測(cè)定得自體液樣品中的外來體的信號(hào)，在其值比正常人的值大的情況下，判斷為具有患大腸癌的可能性。具體地，所述方法包含:應(yīng)用針對(duì)特定抗原的單克隆抗體或其片段測(cè)定得自被測(cè)試者的體液樣品中的表達(dá)該抗原的外來體量的步驟(下文也稱為步驟A)、以及比較前述步驟中外來體的信號(hào)強(qiáng)度與對(duì)照者中信號(hào)強(qiáng)度的步驟(下文也稱為步驟B)，此處，發(fā)現(xiàn)前述被測(cè)試者中的信號(hào)強(qiáng)度比對(duì)照者中的信號(hào)強(qiáng)度強(qiáng)的情況作為大腸癌存在的指標(biāo)。另夕卜，本說明書中，檢測(cè)大腸癌包含檢測(cè)大腸癌發(fā)生的有無、病態(tài)的進(jìn)展程度。
[0028]本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，通過由抗⑶9抗體和抗⑶63抗體的組合構(gòu)成的測(cè)定系統(tǒng)，在大腸癌患者血液中得到比正常人血液強(qiáng)的信號(hào)強(qiáng)度，但是，存在在正常人中也檢測(cè)到一定程度的強(qiáng)信號(hào)等問題，其作為大腸癌的診斷方法是存在問題的。但是，本發(fā)明中，根據(jù)大腸癌細(xì)胞系的蛋白質(zhì)組分析，成功地將CD147鑒定為對(duì)從惡性度高的大腸癌細(xì)胞分泌的外來體具有特異性的抗原。進(jìn)一步地，本發(fā)明人進(jìn)行深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過組合針對(duì)該CD147抗原的抗體和抗CD9抗體或者抗CD63抗體，正常人的測(cè)定值偏差少?zèng)]有檢測(cè)到假陽性，得到僅從大腸癌患者檢測(cè)到信號(hào)的良好結(jié)果，從而完成本發(fā)明。
[0029]以下說明本發(fā)明中的各步驟。
[0030]步驟A是，應(yīng)用針對(duì)特定抗原的單克