免疫檢測(cè)的制作方法
【專利說(shuō)明】免疫檢測(cè)
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)和/或定量抗原特異性免疫球蛋白的免疫檢測(cè)領(lǐng)域，更具體地涉 及用于過(guò)敏病癥或疾病的診斷的免疫檢測(cè)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 過(guò)敏疾病在過(guò)去的數(shù)十年內(nèi)流行增加，在世界的較發(fā)達(dá)地區(qū)流行增加最顯著。過(guò) 敏反應(yīng)是對(duì)在環(huán)境中通常無(wú)害的物質(zhì)的免疫應(yīng)答。機(jī)體識(shí)別物質(zhì)作為威脅并針對(duì)其產(chǎn)生不 適當(dāng)?shù)姆糯蟮姆磻?yīng)。引起反應(yīng)的物質(zhì)稱為過(guò)敏原，并且這些可以包括如花粉、塵螨、動(dòng)物皮 肩、霉菌孢子、膠乳、藥物、昆蟲(chóng)毒液，和食物如堅(jiān)果和蛋的物質(zhì)。
[0004] 過(guò)敏反應(yīng)是重要的健康問(wèn)題，并導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失，因此，關(guān)鍵是正確的診斷和治 療。
[0005] 患有過(guò)敏反應(yīng)的個(gè)體呈現(xiàn)各種疾病的臨床癥狀。這些包括：呼吸癥狀（如打噴嚏、 氣喘和急性支氣管痙攣）、心血管癥狀（如低血壓）、皮膚癥狀（如腫脹和蕁麻疹）、胃腸道 癥狀（例如，嘔吐和腹瀉）或全身癥狀（包括全身性過(guò)敏反應(yīng)）。常見(jiàn)的過(guò)敏紊亂包括哮 喘、濕疹和枯草熱。一旦在初級(jí)保健情況中的患者呈現(xiàn)涉及刺激和炎癥的癥狀，則臨床醫(yī)生 通常進(jìn)行另外的測(cè)試以確定哪種過(guò)敏原引起過(guò)敏反應(yīng)。結(jié)合臨床癥狀和針對(duì)一種或多種過(guò) 敏原的免疫球蛋白的出現(xiàn)得到過(guò)敏反應(yīng)的診斷。
[0006] 為了對(duì)過(guò)敏反應(yīng)作出診斷，臨床醫(yī)生可以使用皮膚點(diǎn)刺測(cè)試（skin-pricktest)。 使用微量的疑似過(guò)敏原點(diǎn)刺皮膚以觀察是否有反應(yīng)。如果有，圍繞點(diǎn)刺的皮膚將腫脹并變 紅和發(fā)癢，這是針對(duì)該過(guò)敏原的免疫應(yīng)答的典型標(biāo)志。然而，由于皮膚點(diǎn)刺測(cè)試最明顯的是 可令人不適，并且全面測(cè)試涉及大面積皮膚，因此，皮膚點(diǎn)刺測(cè)試不總是理想的。此外，如果 個(gè)體具有對(duì)任意過(guò)敏原的危及生命的反應(yīng)，那么不建議進(jìn)行這些測(cè)試。如果個(gè)體服用了抗 組胺藥或三環(huán)類抗抑郁藥，那么皮膚點(diǎn)刺測(cè)試可能是不可靠的。
[0007] 給定物質(zhì)的抗原性可以源自該物質(zhì)內(nèi)的許多單一抗原?？乖煞郑?成分"）可 以是蛋白質(zhì)、多糖或能夠刺激免疫應(yīng)答的含有表位的任何其他實(shí)體。例如，如果物質(zhì)是塵螨 (屋塵螨（Dermatophagoidespteronyssinus)，則其含有維持有機(jī)體生命的所有分子，但其 還含有由抗原成分如Derp1和Derp2組成的過(guò)敏原部分。特別地，Derp1和Derp2 是天然塵螨提取物的主要過(guò)敏原成分。一般地，在給定提取物中的過(guò)敏原分子的部分越少， 基于提取物的檢測(cè)的靈敏度就越低。
[0008] 免疫球蛋白E(IgE)是在過(guò)敏疾病中起到主要作用的一類抗體。IgE結(jié)合到過(guò)敏原 并觸發(fā)可以導(dǎo)致炎癥的來(lái)自肥大細(xì)胞的物質(zhì)的釋放。在易感人群中，B細(xì)胞在應(yīng)答初次暴 露于過(guò)敏原時(shí)產(chǎn)生過(guò)敏原特異性IgE。該IgE隨后在血液中循環(huán)；結(jié)合到肥大細(xì)胞，并且在 隨后暴露于相同過(guò)敏原時(shí)，可以開(kāi)始級(jí)聯(lián)的過(guò)敏反應(yīng)。因此，特定的IgE成為已確定的針對(duì) 過(guò)敏疾病的標(biāo)志物。
[0009] 免疫檢測(cè)可用于檢測(cè)對(duì)特定過(guò)敏原具有特異性的IgE水平。這些是評(píng)價(jià)在敏化受 試者中的各種過(guò)敏原特異性IgE抗體的存在以及可能對(duì)其定量的最重要的血液試驗(yàn)。
[0010] 免疫檢測(cè)是用于檢測(cè)在給定樣品中的抗原或特定的抗原特異性抗體的存在的方 法。通過(guò)在特定抗原上孵育樣品可以實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)合于抗原特異性抗體的抗原（即，免疫復(fù)合 物）的檢測(cè)。隨后，抗原特異性抗體的存在可以使用各種技術(shù)可視化。一般地，免疫檢測(cè) 需要將抗原固定在固體支持物上。免疫檢測(cè)的類型包括ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)）和 RAST(放射過(guò)敏原吸附檢測(cè)，包括來(lái)自PhadiaAB的基于熒光的ImmunoCAP?檢測(cè)形式）。
[0011] 由于體外過(guò)敏反應(yīng)診斷免疫檢測(cè)僅需要提供血液樣品，其對(duì)于個(gè)體而言更方 便，因此其用作皮膚試驗(yàn)的供選擇的方案。然而，已在報(bào)導(dǎo)（Bernstein等人，Allergy Diagnostictesting:anupdatedpracticeparameter.Part2.AnnAllergyAsthma Immunol2008Mar;100(3suppl)S66-S121)中發(fā)現(xiàn)，血液試驗(yàn)的靈敏度比皮膚試驗(yàn)低高達(dá) 25-30 %〇
[0012]目前的針對(duì)具有可能的過(guò)敏反應(yīng)的個(gè)體的血液試驗(yàn)的臨床實(shí)踐是針對(duì)樣品，如血 液中的結(jié)合于物質(zhì)的免疫球蛋白的存在進(jìn)行廣泛測(cè)試。所述物質(zhì)是過(guò)敏原或抗原物質(zhì)，如 花生、狗皮肩或樺樹(shù)花粉。其可以作為物質(zhì)的天然提取物，或從天然提取物中分離的成分出 現(xiàn)在免疫檢測(cè)中，但兩者絕不平行出現(xiàn)。這樣的檢測(cè)有助于臨床醫(yī)生做出"對(duì)花生過(guò)敏"或 "對(duì)樺樹(shù)花粉過(guò)敏"的決定，但沒(méi)有另外的信息。此外，每例過(guò)敏患者具有獨(dú)特的過(guò)敏原特異 性IgE譜（profile)。如果僅使用單個(gè)成分，當(dāng)特定抗原成分可能被遺漏或尚未確定時(shí)，過(guò) 敏反應(yīng)會(huì)被遺漏。由于大多數(shù)物質(zhì)含有至少一種抗原成分，因此過(guò)敏反應(yīng)是復(fù)雜的。事實(shí) 上，已知抗原成分之間的一些交叉反應(yīng)性。例如，已知來(lái)自樺樹(shù)花粉的過(guò)敏原BetV1和來(lái) 自花生的過(guò)敏原Arah8是可交叉反應(yīng)的，并且對(duì)這些之一具有特異性的免疫球蛋白也可 以結(jié)合于另一個(gè)。
[0013] 僅在有限的情況下使個(gè)體經(jīng)受第二次血液試驗(yàn)，該第二次血液試驗(yàn)試圖分析個(gè)體 具有的免疫球蛋白所針對(duì)的物質(zhì)的成分。這可能是關(guān)鍵的，由于某些成分特異性免疫球蛋 白的存在可以表明對(duì)物質(zhì)的潛在的過(guò)敏反應(yīng)，而其他不能。例如，吃花生（含有Arah8) 的具有針對(duì)BetV1的IgE抗體的樺樹(shù)花粉過(guò)敏患者可以由于交叉反應(yīng)抗體的存在而不是 過(guò)敏反應(yīng)而經(jīng)歷口腔發(fā)癢（口腔癥狀）。
[0014] 本發(fā)明試圖改善針對(duì)過(guò)敏反應(yīng)的免疫檢測(cè)的靈敏度和質(zhì)量，實(shí)際上是針對(duì)任何物 質(zhì)的免疫檢測(cè)。其提供用于在試驗(yàn)樣品中定量具體免疫球蛋白水平的更靈敏的免疫檢測(cè)。 在改善免疫檢測(cè)的靈敏度和質(zhì)量時(shí)，在試驗(yàn)樣品中的具體免疫球蛋白的檢測(cè)限也得到改 善。此外，個(gè)體可以接受更特異性的診斷，其實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床癥狀的精確管理。
[0015] 發(fā)明概沐
[0016] 本發(fā)明的目的是提供一種改進(jìn)的免疫檢測(cè)，其具有提高的靈敏度和質(zhì)量。具體地， 本發(fā)明是一種檢測(cè)和/或定量物質(zhì)特異性免疫球蛋白水平的方法。本發(fā)明還涉及能夠?qū)崿F(xiàn) 這樣的檢測(cè)和定量的系統(tǒng)。該方法可以用于診斷在個(gè)體中對(duì)過(guò)敏原或過(guò)敏反應(yīng)的敏化，特 別是當(dāng)考慮到患者的癥狀時(shí)。
[0017] 更具體地，本發(fā)明的目的是提供改進(jìn)的免疫檢測(cè)，其提供更靈敏的診斷工具并且 其可以甚至有利地直接用于初級(jí)保健情況中。
[0018] 這些目的是通過(guò)新穎地提供每種關(guān)注的物質(zhì)的多種形式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。例如，關(guān)注的 物質(zhì)可以源自花生。如果需要，可以包括一種以上物質(zhì)，從而以多種形式提供每種測(cè)試的物 質(zhì)。例如，物質(zhì)作為天然提取物提供，并且一種或多種抗原成分源自該物質(zhì)。作為實(shí)例，這 可以是作為一種形式的花生的天然提取物和抗原成分Arahl、Arah2和Arah5。如果 使用固體支持物，則這些離散的物質(zhì)形式分別地固定在固體支持物上。因此，在免疫測(cè)定中 分別評(píng)估每種形式，并由每種形式獲得不同的結(jié)果。因此，對(duì)于每種測(cè)試的物質(zhì)，多種形式 產(chǎn)生多種結(jié)果。在有關(guān)花生的實(shí)例中，將獲得4種各自的結(jié)果，針對(duì)天然提取物有一種和針 對(duì)每種成分各有一種。當(dāng)分析結(jié)果時(shí)，可以組合一種或多種物質(zhì)形式，例如，可以總結(jié)兩種 或多種抗原成分的結(jié)果。由這些結(jié)果可以定量樣品中的物質(zhì)特異性免疫球蛋白的水平。如 果個(gè)體具有結(jié)合于測(cè)試的物質(zhì)的特異性免疫球蛋白，則這些結(jié)果的分析系統(tǒng)使得臨床醫(yī)生 更精確地評(píng)估。對(duì)于存在于方法中的單個(gè)抗原成分（或多個(gè)抗原成分），結(jié)果將顯示抗原成 分特異性免疫球蛋白的存在和/或水平。
[0019] 重要的是要注意，只有當(dāng)足量的物質(zhì)特異性免疫球蛋白和所述物質(zhì)兩者均存在于 檢測(cè)中時(shí)，才可以確定體外診斷試驗(yàn)的陽(yáng)性。具體地，如果檢測(cè)中存在物質(zhì)的不足或低質(zhì) 量，則物質(zhì)特異性免疫球蛋白將不能充分結(jié)合于所述物質(zhì)，這導(dǎo)致差的檢測(cè)性能（例如，低 靈敏度）。
[0020] 因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了：
[0021] -種用于檢測(cè)樣品中物質(zhì)特異性免疫球蛋白的存在或不存在的方法，所述方法包 括使所述樣品與多種形式的所述物質(zhì)基本上同時(shí)接觸，并測(cè)定是否形成免疫復(fù)合物，其中 至少一種形式是天然提取物。
[0022] 優(yōu)選的是，至少一種形式是抗原成分或抗原成分的組合。
[0023] 優(yōu)選的是，所述方法可以用于定量樣品中物質(zhì)特異性免疫球蛋白的水平。進(jìn)一步 優(yōu)選的是，所述方法可以供選擇地或另外地用于定量抗原成分特異性免疫球蛋白的水平。 因此，本發(fā)明的方法可以包括定量物質(zhì)和/或抗原成分特異性免疫球蛋白的水平的一個(gè)或 多個(gè)步驟。
[0024] 在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的方面，所述方法可以用于實(shí)現(xiàn)個(gè)體中過(guò)敏反應(yīng)的診斷。 個(gè)體提供用于該方法中的樣品。因此，本發(fā)明的方法可以包括測(cè)定個(gè)體的敏化狀態(tài)的一個(gè) 或多個(gè)步驟。供選擇地或另外地，該方法可以用于測(cè)定個(gè)體的物質(zhì)特異性或抗原成分特異 性免疫球蛋白的狀態(tài)。
[0025] 如本文所使用，敏化是指患者之前已經(jīng)暴露于物質(zhì)，并且免疫球蛋白已經(jīng)針對(duì)該 物質(zhì)升高。進(jìn)一步暴露可以導(dǎo)致如先前所討論的過(guò)敏癥狀。
[0026] 在第二個(gè)方面，提供了用于定量樣品中物質(zhì)特異性免疫球蛋白水平的方法，所述 方法包括使所述樣品與多種形式的所述物質(zhì)接觸，并測(cè)定所述免疫球蛋白對(duì)所述物質(zhì)形式 的反應(yīng)性水平，其中至少一種形式是天然提取物。
[0027] 在第三個(gè)方面，提供了用于提高物質(zhì)的結(jié)合能力的方法，其包括選擇性去除一種 或多種成分。優(yōu)選的是，將所述物質(zhì)制備成天然提取物。結(jié)合能力涉及物質(zhì)特異性結(jié)合元 件如免疫球蛋白結(jié)合于物質(zhì)的能力。所述物質(zhì)（本文描述為改性的或貧化的物質(zhì)）可以用 于本發(fā)明的任何方法、陣列或試劑盒中。
[0028] 在第四個(gè)方面，提供了陣列，其包括設(shè)在離散位置處的多種形式的物質(zhì)，其中至少 一種形式是所述物質(zhì)的天然提取物。所述陣列可以用于本發(fā)明的任何方法或試劑盒中。
[0029] 優(yōu)選的是，至少一種抗原成分或抗原成分的組合作為所述物質(zhì)的形式提供。因此， 1種或多種形式可以是抗原成分或抗原成分混合物。
[0030] 在第五個(gè)方面，提供了試劑盒，其包括：陣列，其包括上述的在離散位置處提供的 多種形式的物質(zhì)；和一種或多種檢測(cè)結(jié)合劑。
[0031] 在第六個(gè)方面，提供了測(cè)定個(gè)體的物質(zhì)特異性免疫球蛋白狀態(tài)的方法，其包括使 來(lái)自所述個(gè)體的樣品與多種形式的所述物質(zhì)基本上同時(shí)接觸，其中至少一種形式是天然提 取物，并測(cè)定是否形成免疫復(fù)合物。
[0032] 在第七個(gè)方面，提供了用于診斷個(gè)體中對(duì)物質(zhì)的過(guò)敏反應(yīng)的方法，所述方法包括 使來(lái)自所述個(gè)體的樣品與多種形式的物質(zhì)基本上同時(shí)接觸，其中至少一種形式是天然提取 物，并且具有一種或多種形式的免疫復(fù)合物的存在表明存在對(duì)該物質(zhì)的敏化和/或過(guò)敏反 應(yīng)。
[0033] 附圖簡(jiǎn)沐
[0034] 圖1 :圖1顯示來(lái)自實(shí)施例1的結(jié)果。其為顯示過(guò)敏原特異性免疫球蛋白（IgE) 濃度（分類得分中的反應(yīng)性）對(duì)塵螨提取物（天然提取物）、Derp1和Derp2 (兩種成 分）的平均熒光信號(hào)的條形圖。
[0035] 圖2是顯示來(lái)自實(shí)施例1的結(jié)果的另外