雜化納米孔及其用于檢測分析物的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開內(nèi)容涉及包括雜化（hybrid)納米孔結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和設(shè)備及其用途。
[0002] 背景
[0003] 最近，基于納米孔的分析已作為使得能夠在分析物諸如離子、核酸分子、多肽等等 的通過納米孔的轉(zhuǎn)位期間檢測并分析其的有希望的工具出現(xiàn)。納米孔通常分為三個主要的 組：（i)合成納米孔（ii)生物納米孔和（iii)生物和合成納米孔的組合。
[0004] HallAR等人[1]已通過將長DNA分子附接至蛋白將Ct溶血素插入固態(tài)納米孔。 此外，建議以可控方式調(diào)控（ratchet)DNA通過納米孔，所述可控方式例如放置在蛋白納米 孔的入口上的phi29分子馬達(dá)[2-4]以及通過操作固態(tài)納米孔壁上的電荷分布的靜電屏蔽 [5-6]〇
[0005] W011130312A1[7]描述了納米孔設(shè)備，所述納米孔設(shè)備包括固相支持體，和通過共 價鍵有效附接至通道的內(nèi)側(cè)壁表面上的區(qū)域的環(huán)狀分子。
[0006] KhoutorskyA等人[8]和W02012/160565[9]描述，SPl和其衍生物可用于在活細(xì) 胞的質(zhì)膜中產(chǎn)生親水納米通道。
[0007] Wang等人2013 [10]描述了用于確定短單鏈核酸序列的包含脂質(zhì)雙層中的SPl納 米孔的系統(tǒng)。
[0008] 參考文獻(xiàn)
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[0021] [13]W02007007325
[0022] [14]W02011/027342
[0023] 發(fā)明概述
[0024] 本發(fā)明基于一種獨特平臺的開發(fā)，所述獨特平臺使得能夠診斷和測量樣品中的化 學(xué)或生物實體（分析物）的存在、身份和量的一種或更多種。本發(fā)明的獨特平臺是基于在 設(shè)備的表面區(qū)域上制造的合成納米孔，所述設(shè)備被調(diào)整用于測量與通過納米孔的分析物相 關(guān)的參數(shù)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，納米孔裝飾有、或摻入了或包含或涂覆了環(huán)樣多肽諸如SPl多肽以 及其任何片段、肽、類似物、同源物和衍生物。環(huán)樣多肽的中心孔（穴）與納米孔軸以這樣的 方式重合和重疊，所述方式形成連接環(huán)樣多肽的開口面和納米孔的一個開口的連續(xù)通道。 包括多肽和納米孔兩者的連續(xù)通道在此稱為雜化納米孔。
[0026] 已確定了本發(fā)明的雜化納米孔顯示不同于無多肽的裸納米孔的特性。例如，如在 下文中將進一步顯示的，已表明與通過裸合成納米孔的轉(zhuǎn)位速率比較，分析物通過雜化納 米孔的轉(zhuǎn)位速率（時間）較慢。環(huán)樣結(jié)構(gòu)，例如，SPl在雜化納米孔中的存在不僅影響轉(zhuǎn)位 速率（時間），而且還影響分析物在轉(zhuǎn)位期間的構(gòu)象。還發(fā)現(xiàn)雜化納米孔選擇性轉(zhuǎn)位單一構(gòu) 象的分析物。
[0027] 因此，參數(shù)諸如通過納米孔的轉(zhuǎn)位速率和分析物構(gòu)象的控制和微調(diào)允許使得能夠 在材料通過（轉(zhuǎn)位通過）納米孔期間的優(yōu)質(zhì)瞬時分辨的靈敏平臺。
[0028] 因此，根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種雜化結(jié)構(gòu)，所述雜化結(jié)構(gòu)包括（a)固體基 材，所述固體基材具有穿過其的至少一個納米孔，和（b)至少一個環(huán)樣多肽，所述至少一個 環(huán)樣多肽位于所述至少一個納米孔的區(qū)域，所述區(qū)域選自納米孔的開口和所述納米孔的內(nèi) 部區(qū)域。
[0029] 至少一個環(huán)樣多肽與納米孔的結(jié)合不同于共價結(jié)合。在一些實施方案中，至少一 個納米孔在其開口表面處包含至少一個環(huán)樣多肽。在其他實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽 位于納米孔的內(nèi)部區(qū)域內(nèi)。
[0030] 根據(jù)本公開內(nèi)容，固體基材是一個或更多個納米孔位于其中的固體連續(xù)材料?；?材的厚度限定了納米孔結(jié)構(gòu)的長度或深度。固體基材以具有第一面或表面和相對面或第二 面或表面為特征。在第一和第二面之間的距離限定了基材的厚度和納米孔結(jié)構(gòu)的長度或深 度。
[0031] 換言之，當(dāng)提及基材的第一面和第二面時，應(yīng)提及是基材的面（頂端和/或底部） 的基材的平面表面。在一些實施方案中，第一表面或面和第二面或面可被認(rèn)為是平行的表 面或基本上平行的表面。
[0032] 納米孔從一個面到另一個面穿過基材后，基材可稱為膜。
[0033] 當(dāng)提及固體膜時，應(yīng)注意，它不包括細(xì)胞膜或雙脂層膜。在一些實施方案中，固體 基材是合成的。在一些其他實施方案中，固體基材是無機片材。在一些實施方案中，固體基 材包括選自硅、鋁、鈦、鉿、石墨烯、玻璃、石英、金剛石和特氟隆（teflon)的材料。
[0034] 在一些實施方案中，固體基材包括或是摻雜的材料，諸如摻雜的硅或摻雜的金剛 石或以上列出的任何材料的摻雜的形式。
[0035] 在一些其他實施方案中，固體基材包括或是未摻雜的材料，如以上列出的。
[0036] 在一些實施方案中，固體基材選自包括氮化硅（SiN)、二氧化硅（SiO2)、氧化鋁 (Al2O3)、氧化鈦（TiO2)、氧化鉿（HfO2)和石墨稀的至少一種的材料。
[0037] 在一些實施方案中，固體基材由氮化硅組成或包括氮化硅。
[0038] 如本文所用術(shù)語"納米孔"表示在如定義的固體基材內(nèi)存在的孔（穴、開口）。在 本公開內(nèi)容的上下文中，納米孔可視為各自具有通道（隧道）的三維表示的穿孔，有兩個開 口在固體基材的相對側(cè)處，其中兩個開口通過由高度（長度、深度）限定的內(nèi)部連接。應(yīng)注 意，在本公開內(nèi)容的上下文中，納米孔存在于固體基材內(nèi)，使得納米孔開口的一個存在于基 材的第一面，且第二開口存在于基材的第二相對面。
[0039] 納米孔的內(nèi)部從在第一表面處的一個開口（第一開口）跨越至在相對表面處的開 口（第二開口）并連接兩個開口。內(nèi)部可以是開放的內(nèi)部，允許任何介質(zhì)，例如，液體介質(zhì) 或任何材料的流通。
[0040] 納米孔的第一開口和第二開口各自以可以相似或不同的直徑為特征。當(dāng)提及納米 孔的相對面時，注意，兩個開口可認(rèn)為是基本上平行的開口或幾乎平行的開口。在一些實施 方案中，兩個開口同軸定位。
[0041] 在一些實施方案中，納米孔的每個具有多達(dá)約50nm的平均直徑；在其他實施方案 中，在約Inm至約50nm之間；在另外的實施方案中，在約Inm至約20nm之間；在一些另外的 實施方案中，在約2nm至約IOnm之間；在一些另外的實施方案中，在約3nm至約8nm之間， 且在一些其他實施方案中在約3nm至約5nm之間。
[0042] 在一些實施方案中，跨第一開口和第二開口的納米孔的內(nèi)部，具有從約5nm至約 50nm的長度；在一些其他實施方案中，從約IOnm至約40nm;在一些另外的實施方案中，從 約20nm至約35nm。
[0043] 納米孔可鉆在固體基材內(nèi)，或可選地可通過本領(lǐng)域已知的任何可用的方法來制 造。納米孔在固體基材內(nèi)的制造，可通過以下非限制性實例中的任何一個或更多個來實現(xiàn)： 反饋控制的低能量（〇. 5-5.OkeV)惰性氣體離子束雕刻，高能（200-300keV)電子束照射。納 米孔的屬性諸如例如直徑和長度，可通過本領(lǐng)域已知的方法諸如透射電子顯微術(shù)（TEM)和 /或原子力顯微術(shù)（AFM)來確定。
[0044] 固體基材可包括多個納米孔。多個納米孔可以以納米孔的陣列來排列，其中在陣 列中納米孔以組或模式排列，其中納米孔的各組或模式在選自納米孔密度、納米孔大小、納 米孔深度和納米孔結(jié)構(gòu)的至少一種參數(shù)中是相同的或不同的。例如，對于某些應(yīng)用，一組納 米孔通常可具有相同的孔徑，同時形成另一組納米孔以具有不同孔徑。在其他情況下，可形 成納米孔的每個組以包括具有不同孔徑的多個納米孔。
[0045] 根據(jù)一些實施方案，本文描述的雜化結(jié)構(gòu)可被認(rèn)為是自組裝的結(jié)構(gòu)。術(shù)語自組裝 或其任何語言的變化形式表示其中雜化納米孔結(jié)構(gòu)的組件通過可以施加或可以不施加于 該系統(tǒng)以引導(dǎo)組裝的力組裝為結(jié)構(gòu)（模式）的過程。在一些實施方案中，該過程可被認(rèn)為 是被驅(qū)動，而不需要引入外力。在一些其他實施方案中，該過程可使用施加電壓。因此，根 據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，雜化結(jié)構(gòu)可被認(rèn)為是自組裝的雜化結(jié)構(gòu)。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明采用的環(huán)樣多肽不限于特定蛋白，并可認(rèn)為是適合于具有環(huán)樣形狀的 任何蛋白/多肽，即，以圓環(huán)形狀（環(huán)樣）排列的寡聚多肽（蛋白），具有中腔（作為內(nèi)穴） 使得其中心符合納米孔的中心。還選擇環(huán)樣多肽（蛋白）以形成與納米孔開口或納米孔內(nèi) 壁的穩(wěn)定相互作用，并因此被選擇與納米孔區(qū)域（開口或內(nèi)壁）非共價地，直接地或經(jīng)由具 有使得能夠結(jié)合的官能團的連接物締合。
[0047] 環(huán)樣多肽可以具有限定環(huán)樣結(jié)構(gòu)多肽的外緣的外徑和限定內(nèi)腔（作為內(nèi)穴）的直 徑的內(nèi)徑為特征。包含內(nèi)徑的平面本文稱為X-Y平面，并因此限定多肽的平面取向。環(huán)樣 多肽還可以具有本文中稱為Z軸的高度為特征。根據(jù)本公開內(nèi)容，當(dāng)沿著X-Y平面觀察時， 環(huán)樣多肽以具有對稱結(jié)構(gòu)為特征。在一些實施方案中，環(huán)樣多肽不以具有蘑菇樣形狀而是 甜甜圈樣形狀為特征。
[0048] 在一些實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽具有約Inm至約IOnm之間的內(nèi)徑。在一些 其他實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽具有約Inm至約7nm之間的內(nèi)徑。在一些另外的實施 方案中，至少一個環(huán)樣多肽具有約3nm至約4nm之間的內(nèi)徑。
[0049] 在一些實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽具有約8nm至約18nm之間的外徑。在一些 其他實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽具有約IOnm至約15nm之間的外徑。在一些另外的實 施方案中，至少一個環(huán)樣多肽具有約Ilnm至約13nm之間的外徑。
[0050] 如本文描述的雜化結(jié)構(gòu)以具有符合或匹配納米孔直徑的至少一個環(huán)樣多肽的內(nèi) 徑為特征，并因此，當(dāng)沿著Z軸觀察時，多肽的內(nèi)徑的中心和納米孔的直徑的中心基本上處 于相同位置。
[0051] 至少一個環(huán)樣多肽在納米孔的內(nèi)部的位置由環(huán)樣多肽的外徑和納米孔的直徑之 間的平衡所決定。環(huán)樣多肽可具有大于、等于或小于納米孔的直徑的外徑（即，整個多肽的 直徑本文中稱為外緣）。在一些實施方案中，至少一個納米孔的直徑小于或等于至少一個環(huán) 樣多肽的外徑。在一些實施方案中，多肽的外徑/緣比納米孔的大，并因此，多肽不能進入 納米孔的內(nèi)部，而采用在其直徑中心同軸定向的構(gòu)象。
[0052] 在一些實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽位于納米孔的開口上。結(jié)合本公開內(nèi)容，與 多肽締合的表面（面）是膜的第一表面。這可視為至少一個環(huán)樣多肽位于納米孔的第一開 口的頂部。
[0053] 在一些實施方案中，至少一個納米孔的直徑大于至少一個環(huán)樣多肽的外徑。在一 些實施方案中，至少一個環(huán)樣多肽可位于納米孔的內(nèi)表面內(nèi)。
[0054] 可選擇環(huán)樣多肽以包含彼此相同（同）或不同（異）的數(shù)個單體亞基，一起形成 環(huán)樣結(jié)構(gòu)，例如復(fù)合物多肽。多肽可以是包括例如，以同心排列排列的單體亞基的天然同寡 聚體或異寡聚體。
[0055] 可根據(jù)本發(fā)明使用的環(huán)樣多肽可以是熱休克蛋白（HSP)。當(dāng)細(xì)胞暴露于升高的溫 度和其他應(yīng)激時，HSP的表達(dá)增加。環(huán)樣多肽可以是例如HSP60、HSP70、HSP90或嗜熱菌 蛋白酶。
[0056] 在一些實施方案中，環(huán)樣多肽是穩(wěn)定蛋白I(SPl)多肽[11-13]。
[0057] SPl的制備、結(jié)構(gòu)修飾（突變）和特性已在以下國際專利申請?zhí)栔泄_： W02002/070647[ll]、W02004/022697[12]、W02007/007325[13]和W02011/027342[14]，和 相應(yīng)美國專利申請，各自通過引用并入本文。
[0058] 本文所用的"SP1"（穩(wěn)定蛋白1)表示具有環(huán)狀，還稱為"甜甜圈樣"形狀的同十二 聚體寡聚蛋白。SPl多肽天然地定位于植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并且未在動物例如哺乳動物 (人或非人）細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。SPl具有分布在其表面上的-12個電荷單位的凈電荷。
[0059] 當(dāng)提及SPl時，它可被認(rèn)為是由可以相同的12個單體組成并因此具有149kDa的 分子量。它是非常穩(wěn)定的（Tm~109°C)并認(rèn)為是沸騰穩(wěn)定多肽，在水溶液中約95°C下處 理至少10分鐘后，具有結(jié)構(gòu)寡聚體穩(wěn)定性，如通過大小分級測定確定的。另外，SPl以變性 劑穩(wěn)定多肽為特征，在包含1:2, 000摩爾比（單體：SDS)的水溶液中處理后，具有寡聚蛋白 的結(jié)構(gòu)寡聚穩(wěn)定性，如通過大小分級測定確定的。顯示SPl多肽是參與其他蛋白的折疊和 解折疊的功能上相關(guān)的蛋白。
[0060] 在本公開內(nèi)容的上下文中，當(dāng)提及SPl時，應(yīng)認(rèn)為包括SPl及其任何片段、肽、變 體、類似物、同源物和衍生物。此外，在本公開內(nèi)容的上下文中，當(dāng)提及SPl及其任何片段、 肽、變體、類似物、同源物和衍生物時，應(yīng)該認(rèn)為還包括異十二聚體，即具有不同序列的單體 的多肽。
[0061] 應(yīng)注意，本