0106] 8)半胱氨酸（C)、甲硫氨酸（M)。
[0107] 更具體地，氨基酸"取代"可以是用具有相似結構和/或化學性質的另一個氨基 酸代替一個氨基酸的結果，即，保守的氨基酸代替。氨基酸取代可基于參與的殘基的極性、 電荷、溶解性、疏水性、親水性、和/或兩親性質中的相似性來做出。例如，非極性"疏水性" 氨基酸選自由以下組成的組：纈氨酸（V)、異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、甲硫氨酸（M)、苯丙氨 酸（F)、色氨酸（W)、半胱氨酸（C)、丙氨酸（A)、酪氨酸（Y)、組氨酸（H)、蘇氨酸（T)、絲氨酸 (S)、脯氨酸（P)、甘氨酸（G)、精氨酸（R)和賴氨酸（K);"極性"氨基酸選自由以下組成的 組：精氨酸（R)、賴氨酸（K)、天冬氨酸（D)、谷氨酸（E)、天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q);"帶正 電荷的"氨基酸選自由以下組成的組：精氨酸（R)、賴氨酸（K)和組氨酸（H);且其中"酸性" 氨基酸選自由以下組成的組：天冬氨酸（D)、天冬酰胺（N)、谷氨酸（E)和谷氨酰胺（Q)。
[0108] 根據(jù)本發(fā)明的多肽的任何一個，例如由SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、 5￡〇10勵：4、5￡〇10勵：5、5￡〇10勵：6、5￡〇10勵：7、5￡〇10勵：15或5￡〇10勵：17表 示的多肽的任何一個的指定的序列的衍生物可在它們的大小方面變化并可包括全長多肽 或其任何片段。在某些實施方案中，多肽可以包含一個或更多個氨基酸殘基替代物。如本 文定義的"氨基酸殘基替代物"是用于制備肽的重要功能結構域的模擬物的氨基酸殘基或 肽。
[0109] 氨基酸替代物的實例包括但不限于：氨基酸的化學修飾形式和衍生物、天然存在 的氨基酸的立體異構體和修飾形式、非蛋白氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶促修飾的氨基 酸等。實例還包括肽的二聚體或多聚體。氨基酸替代物還可包括在氨基酸的側鏈部分所做 的任何修改。因此，這包括天然存在的氨基酸中存在的側鏈部分、修飾的天然存在的氨基酸 中的側鏈部分，所述修飾的天然存在的氨基酸諸如糖基化氨基酸。它還包括天然存在的蛋 白氨基酸的立體異構體和修飾形式、非蛋白氨基酸、翻譯后修飾的氨基酸、酶促合成的氨基 酸、衍生的氨基酸、設計為模擬氨基酸的構建體或結構等中的側鏈部分。
[0110] 應理解，本發(fā)明還包括任何肽、其任何替代物、其任何鹽、堿、酯或酰胺、其任何對 映體、立體異構體或非對映異構體，或其任何組合或混合物。藥學上可接受的鹽包括本發(fā)明 的化合物中存在的酸性基團或堿性基團的鹽。藥學上可接受的酸加成鹽包括，但不限于，鹽 酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽，異煙酸鹽、乙酸 鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬 來酸鹽、龍膽酸鹽（gentisinate)、延胡索酸鹽、葡糖酸鹽、葡糖醛酸鹽（glucaronate)、糖 酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、谷氨酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽和雙羥 萘酸鹽（即，1，1'-亞甲基-雙-(2-羥基-3-萘甲酸鹽））鹽。本發(fā)明的某些化合物可與各 種氨基酸形成藥學上可接受的鹽。合適的堿性鹽包括，但不限于，鋁、鈣、鋰、鎂、鉀、鈉、鋅和 二乙醇胺鹽。
[0111] 應注意，本發(fā)明還包括模擬本發(fā)明的多肽，即SPl及其任何片段或肽的任何模擬 肽化合物。當提及模擬肽時，意思是模擬特定天然肽的構象和期望的特征但避免不期望的 特征例如柔性和鍵斷裂的化合物。從化學角度來看，模擬肽可具有不含任何肽鍵的結構； 然而，由于其化學性質而不是由于化學結構，該化合物是模擬肽。模擬肽（肽和非肽基類似 物）可具有改進的性能（例如，減少的蛋白水解、增加的保留或增加的生物利用度）。應注 意，模擬肽可具有或可不具有相似的二維化學結構，但共享共同的三維結構特征和幾何形 狀。每個模擬肽還可具有一個或更多個獨特的另外的結合元件。
[0112] 如本文定義的雜化納米孔結構可通過包括以下的過程來制備：在允許在所述至少 一個納米孔的輪緣開口處或所述至少一個納米孔的內(nèi)部區(qū)域中放置所述至少一個環(huán)樣多 肽的條件下，使具有穿過其的至少一個納米孔的固體基材與至少一個環(huán)樣多肽接觸。
[0113] 在一些實施方案中，雜化結構通過自組裝而形成。在一些實施方案中，雜化結構的 形成通過施加電壓來驅動。
[0114] 如本文以下的實施例2中以及具體地在圖2A中所示，SPl向固體基材中的添加導 致了將SPl捕獲在納米孔輪緣上，如由明顯的三個峰所示的。此外，如圖2B至2D中所示， 發(fā)現(xiàn)了SPl的布置在基本上與納米孔平面方向平行的方向。發(fā)現(xiàn)了SPl在納米孔中的捕獲 (涂覆）是可逆的并取決于所施加的極性。
[0115] 如實施例2中具體地在圖2G和2H中另外所示的，SPl在納米孔中的捕獲可受到 SPl特性的影響。例如，發(fā)現(xiàn)了SPl的不同衍生物具有不同的捕獲行為。具體地，在SPl突 變體SiSPl中，需要較低電壓以在納米孔中捕獲多肽。
[0116] 雜化結構可以是設備（例如電子設備）的一部分。電子設備可以包括測量單元。
[0117] 因此，在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種設備，所述設備包括（i)如本文定義 的雜化結構和（ii)測量單元。
[0118] 根據(jù)一些實施方案，將雜化結構放置在設備內(nèi)，使得它可分離兩個室。兩個室可單 獨地保持在適當?shù)奈恢?。在一些實施方案中，并如本文以下所述，兩個室可僅通過電解質溶 液電力地連接。如本文所述的室可通過本領域已知的適合于這樣的目的的任何常規(guī)材料來 制備。非限制性實例包括聚二甲基硅氧烷（PDMS)、塑料、特氟隆和任何已知的絕緣固體材 料。在一些實施方案中，室包含電解質溶液。
[0119] 本文描述的設備可包括一組至少兩個電極構成的電極組件。在一些實施方案中， 每個室配備了電極或電極組件。在一些實施方案中，電極是Ag/AgCl電極。
[0120] 如上指出，至少一個環(huán)樣多肽并不限于任何多肽且可以是例如SP1，如本文所定 義。在一些實施方案中，配置設備使得兩個分隔的室的一個的底部面向（與之連接，觸及） 第一表面（具有SP1)并包含第一表面中的納米孔的開口。在一些實施方案中，這稱為順式 室（或順式容器）。
[0121] 在一些實施方案中，面向第一表面的室具有在約Inm至IOnm之間的開口；在一些 其他實施方案中，在約2nm至約5nm之間；在一些另外的實施方案中，在約3nm至約4nm之 間。開口在雜化結構的頂部，使得它覆蓋納米孔直徑。室中的開口可呈任何形狀，例如漏斗 形孔。室中的開口可與雜化納米孔通過本領域任何已知的方法，例如通過光學顯微鏡對準。
[0122] 在一些其他實施方案中，兩個分隔的室的一個的頂部面向（與之連接，觸及）第二 相對面并包含納米孔在第二表面中的開口。在一些實施方案中，這稱為反式室（或反式容 器）。
[0123] 在一些實施方案中，且特別當室填充有電解質溶液時，可允許溶液經(jīng)由納米孔的 內(nèi)部從第一開口流動至第二開口通過納米孔。因此，兩個單獨的室以液體或氣體連通。
[0124] 在一些實施方案中，設備包括使得能夠改變樣品溶液的微流體系統(tǒng)。在一些實施 方案中，設備包括冷卻-加熱系統(tǒng)，以控制設備的溫度。設備中使用的這些系統(tǒng)和任何另外 的系統(tǒng)可手動或由計算機控制。在一些又其他實施方案中，且為了減少可能的噪聲，設備可 放置在法拉第籠內(nèi)且甚至在隔振臺的頂部。
[0125] 根據(jù)本公開內(nèi)容的設備包括測量單元。測量單元適于測量通過納米孔的離子電 流。在一些實施方案中，離子電流由相同單元產(chǎn)生并測量。在一些其他實施方案中，需要不 同單元生成并測量電流。在一些實施方案中，單元可以是電壓源、膜片鉗系統(tǒng)。在一些實施 方案中，產(chǎn)生和/或測量單元可以進一步配備有放大器和/或低通濾波器和/或數(shù)字化儀。
[0126] 在一些實施方案中，測量單元包括計算機可讀系統(tǒng)。
[0127] 當樣品放置在接近納米孔或可選地在順式室中且條件是允許樣品通過納米孔時， 包括該結構的雜化結構和設備可用于分析樣品。本文確定了本文描述的雜化納米孔監(jiān)測分 析物轉位的靈敏度和特異性。
[0128] 通常且如本文所示，當施加電壓至雜化納米孔且鄰近納米孔或在順式室中無分析 物存在時，可測量表示開放孔電流的穩(wěn)定離子電流。
[0129] 當接近納米孔或向接近納米孔的順式室中加入分析物時，分析物可通過納米孔到 納米孔（膜）的另一側，有時可以是反式室。此外，分析物可接近納米孔的一個開口存在。 當分析物接近（即不在內(nèi)部）或在納米孔內(nèi)（在內(nèi)部）存在時（本文以下還稱為監(jiān)測步 驟），納米孔中的離子流的部分被改變，引起離子電流中的可檢測變化。變化可以是電流的 增加或電流的阻塞。這個信號（瞬時）可取決于不同的參數(shù)，例如納米孔、電解質溶液、和 通過分子的性質。因此，雜化納米孔提供了用于樣品分析的基本工具。
[0130] 因此，本公開內(nèi)容根據(jù)它的另外的方面提供了用于分析樣品中的至少一種分析物 的方法，包括：(a)將包含至少一種分析物或疑似包含至少一種分析物的樣品應用在雜化 結構上，其中雜化結構如本文定義。根據(jù)本公開內(nèi)容多肽是SPl多肽。下一步驟（b)包括 允許樣品流動通過納米孔。在隨后的步驟（c)中，進行確定以下的至少一種：（i)樣品中分 析物的存在或不存在、（ii)樣品中分析物的身份、和（iii)樣品中分析物的濃度。
[0131] 根據(jù)本文描述的方法，包含至少一種分析物或疑似包含至少一種分析物的樣品可 與SPl混合，并然后施加到固體納米孔。
[0132] 方法可還包括監(jiān)測與納米孔相關的至少一種可測量的參數(shù)，所述可測量的參數(shù)可 尤其指示分析物通過孔并因此允許確定步驟（c)。
[0133] 在一些實施方案中，至少一種可測量的參數(shù)是化學或物理參數(shù)。在一些另外的實 施方案中且如本文以下詳述，至少一種可測量的參數(shù)是光學參數(shù)。在一些實施方案中，可測 量的參數(shù)是電信號。
[0134] 當分析物接近或在雜化納米孔中時，可獲得數(shù)種可測量的參數(shù)。在一些實施方案 中，可檢測到電流（或電流值）的變化。
[0135] 如本文所使用，"電流值的變化"可通過將觀察到的電流與在較早時間點下例如在 樣品不存在時測量的電流比較，并確定兩次測量之間的值的比率來確定（測量）。電流的變 化可以是電流的阻塞或增加。在一些實施方案中，可觀察到電流中的阻塞（下降）并例如， 隨后與在先的測量結果比較。
[0136] 在一些實施方案中，電流的變化可表示為，開放納米孔電流、開放通道電流的分數(shù) 或百分比，1/1〇,其中I是阻塞電流且Io是開放通道電流（例如，在未檢測到分析物的情況 下）。在一些實施方案中，如以上指出的電流阻塞可指示分析物存在于接近雜化納米孔的區(qū) 域或在納米孔結構內(nèi)，例如在通過雜化納米孔通道期間。
[0137] 在一些實施方案中，電流的變化可定義為具有可測量的持續(xù)時間的事件。電流的 變化的持續(xù)時間或可測量的或觀察到的或檢測到的事件的持續(xù)時間，是指在其間電流中的 變化發(fā)生的時間段。在一些實施方案中，變化（事件）的測量的時間可反映如本文定義的 樣品或分析物通過雜化結構的轉位時間（通過）。
[0138] 在一些實施方案中，在其間電流的變化發(fā)生的時間段，可確定為當觀察到第一電 流變化（增加或阻塞）的時間點與當捕獲或進一步改變了變化的稍后時間點之間的時間 差。在一些實施方案中，測量時間段直到觀察到電流中阻塞或增加的進一步變化。這通常 可經(jīng)設置超過基線噪聲水平的閾值確定。
[0139] 在一些實施方案中，變化的持續(xù)時間可擬合為高斯函數(shù)。在一些實施方案中，變化 的持續(xù)時間可擬合為指數(shù)與時間常數(shù)。
[0140] 在一些其他實施方案中，事件由瞬時峰值（指示可測量的電流中一種或更多種變 化）表示。在一些其他實施方案中，可確定電流的變化事件的頻率。
[0141] 在一些實施方案中，如本文所述的事件積分可通過計算離子電流經(jīng)事件的持續(xù)時 間的積分來確定。
[0142] 在一些實施方案中，至少一種可測量參數(shù)是以下的至少一種：（i)電流的變化、和 (ii)電流的變化的持續(xù)時間以及其任何組合。
[0143] 當提及電流時，應注意，包括與固體膜的表面平行的方向上的電流；或垂直于表面 的隧道效應電流。
[0144] 在一些實施方案中，至少一種參數(shù)可通過目測手動地或通過自動化工具或兩者的 任何組合來確定。在一些實施方案中，可使用包括計算分析例如通過應用適當?shù)乃惴ǖ淖?動化工具。
[0145] 在一些實施方案中，至少一種測量的參數(shù)可用于獲得與至少一種參數(shù)相關的至少 一個數(shù)據(jù)值。
[0146] 在一些實施方案中，該方法包括將至少一種可測量的參數(shù)和/或至少一個數(shù)據(jù)值 與預定的標準對應參數(shù)和/或對應數(shù)據(jù)值比較。這可通過參考已知的測量或實驗來完成， 其中在應用待測試的樣品之前沒有進行測量。
[0147] 在一些其他實施方案中，該方法包括將至少一種可測量的參數(shù)和/或至少一個數(shù) 據(jù)值與在應用樣品前在樣品的不存在下的對照研究中獲得的相應參數(shù)和/或相應數(shù)據(jù)值 比較。
[0148] 如本文所用的術語"比較"指樣品中獲得的至少一種可測量參數(shù)和/或至少一個 數(shù)據(jù)值的任何檢查，如貫穿本文詳細說明的，以發(fā)現(xiàn)至少兩個不同樣品之間的相似性或差 異。應注意，根據(jù)本發(fā)明的比較包括使用基于計算機的方法的可能性。
[0149] 本文公開的本方法還包括在應用待測試的樣品至雜化結構之前進行的步驟。在一 些實施方案中，該方法還包括用電解質溶液填充兩個分隔的室，順式室和反式室。在一些實 施方案中，溶液是標準的溶液，例如包含IMKClTE(10mMtris和ImMEDTA在pH7. 4)的 緩沖溶液。在一些其他實施方案中，在用電解質溶液填充室之后，進行納米孔的初始測試， 例如，諸如，納米孔導電率測試。在一些另外的實施方案中，這些初始測量可用于確定與納 米孔相關的至少一種可測量的參數(shù)，以可能地確定在樣品的不存在下獲得的數(shù)據(jù)值。在一 些另外的實施方案中，施加電壓至電極，且納米孔的電流在樣品的不存在下確定，以獲得開 放通道電流（本文中還稱為開放納米孔電流）。
[0150] 結合本公開內(nèi)容，將樣品應用在雜化納米孔上。樣品的應用可以是通過本領域已 知的任何方法，例如，澆注、注射等等，使得樣品能夠接近和物理接觸納米孔的一個開口。
[0151] 在一些實施方案中，將樣品應用在雜化納米孔上，如此將樣品應用至包含SPl多 肽的納米孔的開口。在一些具體的實施方案中，將樣品應用在雜化納米孔在膜的第一表面 內(nèi)的第一開口上。
[0152] 在一些實施方案中，將包含SPl的樣品應用在納米孔（沒有SPl或具有部分SPl 的涂層）上。在一些具體的實施方案中，將樣品應用在納米孔在膜的第一表面內(nèi)的第一開 口上。
[0153] 然后允許樣品通過納米孔。在本公開內(nèi)容的上下文中，樣品通過納米孔使得能夠 測量與納米孔相關的至少一種可測量的參數(shù)。在一些實施方案中，至少一種可測量的參數(shù) 可以是至少一種物理或化學性