本發(fā)明涉及膠原蛋白的技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種牦牛膠原蛋白的制備方法。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是生物高分子，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的功能性蛋白，占蛋白質(zhì)總量的25％～30％，某些生物體甚至高達(dá)80％以上。膠原蛋白因具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物活性，因此在食品、醫(yī)藥、組織工程、化妝品等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用。比如中國傳統(tǒng)的膠原保健品“阿膠”，主要是以驢皮為原料(其實(shí)就是驢皮中所含膠原蛋白)，具有較高的滋補(bǔ)保健作用，有中藥三寶之一的美譽(yù)。

現(xiàn)有技術(shù)中，以牦牛為原料來制取膠原蛋白的方法較為復(fù)雜。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明一方面在于提供一種牦牛膠原蛋白的制備方法，該制備方法較為簡單。

一種牦牛膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)將牦牛組織粉碎；

(2)將經(jīng)步驟(1)的牦牛組織進(jìn)行酶解，得到組織液；

(3)從所述組織液中分離中膠原蛋白液；

(4)將所述膠原蛋白液層析，得到膠原蛋白固體。

進(jìn)一步地，所述牦牛組織選自牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮和牦牛骨中的一種或至少二種。

進(jìn)一步地，所述粉碎采用組織粉碎機(jī)，組織粉碎機(jī)的轉(zhuǎn)速為3000～5000rpm，粉碎的溫度為-10～0℃，粉碎的時(shí)間為5～15min。

進(jìn)一步地，所述酶解所采用的蛋白酶選自胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶中的一種或至少二種。

進(jìn)一步地，所述酶解的溫度為-10～0℃。

進(jìn)一步地，所述從所述組織液中分離中膠原蛋白液的方式為離心。

進(jìn)一步地，所述離心的轉(zhuǎn)速為11000～13000rpm，離心的時(shí)間為1～10min。

進(jìn)一步地，層析的壓力為0.08～0.12MPa，層析的溫度為-10～0℃

進(jìn)一步地，所述層析之后還包括干燥，所述干燥采用冷凍干燥。

進(jìn)一步地，所述干燥的溫度為-70～-60℃。

進(jìn)一步地，所述層析之后還包括干燥，所述干燥的溫度為-70～60℃。

本發(fā)明的牦牛膠原蛋白的制備方法，首先將牦牛組織粉碎，接著酶解，再從酶解得到的組織液中分離而后純化，得到膠原蛋白固體，由此使得本發(fā)明的制備方法較為簡單。

具體實(shí)施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

如本文所用，術(shù)語：

“一個(gè)”、“一種”和“所述”可交換使用并指一個(gè)或多個(gè)。

“和/或”用于表示所說明的情況的一者或兩者均可能發(fā)生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；

另外，本文中由端點(diǎn)表述的范圍包括該范圍內(nèi)所包含的所有數(shù)值(例如，1至10包括1.4、1.9、2.33、5.75、9.98等)。

另外，本文中“至少一個(gè)”的表述包括一個(gè)及以上的所有數(shù)目(例如，至少2個(gè)、至少4個(gè)、至少6個(gè)、至少8個(gè)、至少10個(gè)、至少25個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)等)。

本發(fā)明的牦牛膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：

(1)將牦牛組織粉碎；

(2)將經(jīng)步驟(1)的牦牛組織進(jìn)行酶解，得到組織液；

(3)從所述組織液中分離中膠原蛋白液；

(4)將所述膠原蛋白液純化，得到膠原蛋白固體

上述牦牛組織可以為結(jié)締組織，例如可取自牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮和牦牛骨中的一種或其任意組合。

為獲得較高的膠原蛋白的純度，在步驟(1)所述粉碎之前還可以對牦牛組織進(jìn)行脫脂處理。此處，脫脂處理的作用是為了除去牦牛組織中的脂肪。脫脂的方式可以采用堿液，這里堿液有氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、碳酸氫鈉溶液或其任意混合液。采用堿液脫脂可采用浸漬的方式，堿液的用量為牦牛組織質(zhì)量的2～3倍，例如2倍、2.2倍、2.5倍、2.8倍、2.9倍或3倍。堿液的質(zhì)量濃度為0.5～10wt％，例如0.5wt％、0.55wt％、0.6wt％、1wt％、2wt％、5wt％、5.5wt％、6wt％、8wt％、9wt％、9.5wt％、9.8wt％或10wt％等。浸漬的溫度可在室溫左右，較好地為25～35℃，例如25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、33℃、34℃或35℃等。浸漬的時(shí)間可為12～60h，例如12h、13h、15h、20h、24h、30h、36h、48h、54h、58h或60h等。

脫脂處理，除了可采用堿液浸漬的方式，還可采用采用磷脂酶和脂肪酶進(jìn)行酶解。酶解的轉(zhuǎn)化率較高。本發(fā)明不對脂肪酶和磷脂酶的具體種類做特別限定，例如可采用天津諾奧酶制劑有限公司所生產(chǎn)的。

磷脂酶和脂肪酶的用量不做特別嚴(yán)苛的規(guī)定，但較好地，磷脂酶可為占待脫脂的油牡丹粕質(zhì)量的0.3～3‰，例如0.3‰、0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰、2.8‰或3‰。脂肪酶可占待脫脂的油牡丹粕質(zhì)量的0.2～2‰，例如0.2‰、0.5‰、1‰、1.5‰、1.8‰、1.9‰或0.2‰。該兩種酶過多，不會帶來轉(zhuǎn)化率的顯著提高；過少則會影響脂類的轉(zhuǎn)化率。

脫脂的酶解的較好的溫度為30～40℃，例如30℃、32℃、35℃、38℃、39℃或40℃。于上述酶用量及酶解的溫度前提下，酶解的時(shí)間為較佳為0.5～5h，例如0.5h、0.75h、1h、2h、3h、4h、4.5h、5h或5h等。

上述粉碎的方式可采用組織粉碎機(jī)。組織粉碎機(jī)的具體機(jī)型可使用公知的型號，于此不詳述。組織粉碎機(jī)的轉(zhuǎn)速以3000～5000rpm為佳，例如3000rpm、3100rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、4800rpm、4900rpm或5000rpm等，優(yōu)選為3800rpm。

粉碎的溫度較好地為-10～0℃，例如-10℃、-9℃、-8℃、-5℃、、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃等。于此溫度下，粉碎的時(shí)間較好地為5～15min，例如5min、6min、8min、10min、11min、13min、14min、15min等，優(yōu)選為10min等。

上述酶解在加入蛋白酶的情況下進(jìn)行。此處，蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈的一類酶的總稱。酶解蛋白可列舉出胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶以及其任意組合。酶解的pH可根據(jù)這些酶的具體種類來選擇，例如對于胃蛋白酶，酶解的pH可為1～2；對于胰蛋白酶，酶解的pH可為7.5～8.5；對于木瓜蛋白酶，酶解的pH可為6～7；對于中性蛋白酶，酶解的pH可為6.8～7.0。

酶解的溫度較佳地為-10～0℃，例如-10℃、-9℃、-8℃、-5℃、、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃等，至于酶解的時(shí)間可采用本領(lǐng)域通用的時(shí)間，或者根據(jù)結(jié)合實(shí)際作調(diào)整。

從所述組織液中分離中膠原蛋白液的方式可列舉出離心、膜分離、透析方法，優(yōu)選為離心。這里，離心即離心沉析或離心分離，是指借助離心機(jī)等設(shè)備可產(chǎn)生相當(dāng)高的角速度，使離心力遠(yuǎn)大于重力，于是溶液中的懸浮物便易于沉淀析出：又由于比重不同的物質(zhì)所受到的離心力不同，從而沉降速度不同，能使比重不同的物質(zhì)達(dá)到分離。膜分離是指利用膜對大分子的截留作用達(dá)到分離。膜分離可采用超濾膜(UF)和反滲透膜(RO)。超濾膜是一種孔徑規(guī)格一致，額定孔徑范圍為0.01微米以下的微孔過濾膜。在膜的一側(cè)施以適當(dāng)壓力，就能篩出小于孔徑的溶質(zhì)分子，以分離分子量大于500道爾頓(原子質(zhì)量單位)、粒徑大于10納米的顆粒。其工作原理為：以膜兩側(cè)的壓力差為驅(qū)動(dòng)力，以超濾膜為過濾介質(zhì)，在一定的壓力下，當(dāng)原液流過膜表面時(shí)，超濾膜表面密布的許多細(xì)小的微孔只允許水及小分子物質(zhì)通過而成為透過液，而原液中體積大于膜表面微孔徑的物質(zhì)則被截留在膜的進(jìn)液側(cè)，成為濃縮液，因而實(shí)現(xiàn)對原液的凈化、分離和濃縮的目的。每米長的超濾膜絲管壁上約有60億個(gè)0.01微米的微孔，其孔徑只允許水分子、水中的有益礦物質(zhì)和微量元素通過，而最小細(xì)菌的體積都在0.02微米以上，因此細(xì)菌以及比細(xì)菌體積大得多的膠體、鐵銹、懸浮物、泥沙、大分子有機(jī)物等都能被超濾膜截留下來，從而實(shí)現(xiàn)了凈化過程。超濾膜既可以采用無機(jī)膜，也可以采用有機(jī)膜，無機(jī)膜可列舉出陶瓷膜和金屬膜；有機(jī)膜可列舉出醋酸纖維素、芳香族聚酰胺、聚醚砜、聚偏氟乙烯等的具體實(shí)例。

反滲透膜又稱逆滲透，一種以壓力差為推動(dòng)力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作。對膜一側(cè)的料液施加壓力，當(dāng)壓力超過它的滲透壓時(shí)，溶劑會逆著自然滲透的方向作反向滲透。從而在膜的低壓側(cè)得到透過的溶劑，即滲透液；高壓側(cè)得到濃縮的溶液，即濃縮液。反滲透膜可以為醋酸纖維素，醋酸纖維素又稱乙酰纖維素或纖維素醋酸酯，常以含纖維素的棉花、木材等為原料，經(jīng)過酯化和水解反應(yīng)制成醋酸纖維素，再加工成反滲透膜，或者可為聚酰胺包括脂肪族聚酰胺和芳香族聚酰胺，如尼龍—4、尼龍—6、尼龍—66膜、芳香族聚酰胺膜。膜材料為芳香族聚酰胺、芳香族聚酰胺—酰肼以及一些含氮芳香聚合物，芳香族聚酰胺膜適應(yīng)的pH范圍可以寬到2～11，但對水中的游離氯很敏感。或者可為復(fù)合膜，其是指以上兩種材料制成，它是以很薄的致密層和多孔支撐層復(fù)合而成。多孔支撐層又稱基膜，起增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度的作用；致密層也稱表皮層，起脫鹽作用，故又稱脫鹽層。脫鹽層厚度可為為30～50nm。此處，透析是指通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水(或緩沖液)的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離方式。透析可采用透析袋實(shí)施。

上述離心的轉(zhuǎn)速可以為11000～13000rpm，例如11000rpm、11100rpm、11500rpm、12000rpm、12500rpm、12800rpm、13000rpm，優(yōu)選為12000rpm。于此轉(zhuǎn)速下，離心的時(shí)間可為1～10min，例如1min、1.5min、2min、3min、5min、6min、8min、9min、9.5min或10min等，優(yōu)選為5min。

上述純化的方式為層析。此處，蛋白質(zhì)層析是指利用蛋白質(zhì)物理性質(zhì)的不同，將多組分混合物進(jìn)行分離。層析可采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。層析可采用蛋白層析儀。蛋白層析儀可采用常用的型號。

層析的壓力以0.08～0.12MPa為宜，例如0.08MPa、0.085MPa、0.09MPa、0.10MPa、0.11MPa、0.115MPa、0.118MPa、0.119MPa或0.12MPa等，優(yōu)選為0.10MPa。于此沉析的壓力下，層析的溫度為-10～0℃，例如-10℃、-9℃、-8℃、-5℃、、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃或0℃等。

層析之后還包括干燥。干燥的方式可采用冷凍干燥。此處，冷凍干燥又稱升華干燥，是指將含水物料冷凍到冰點(diǎn)以下，使水轉(zhuǎn)變?yōu)楸?，然后在較高真空下將冰轉(zhuǎn)變?yōu)檎魵舛ァ１景l(fā)明中冷凍干燥可采用真空冷凍干燥。真空冷凍干燥將濕物料或溶液在較低的溫度(-10℃～-50℃)下凍結(jié)成固態(tài)，然后在真空(1.3～13Pa)下使其中的水分不經(jīng)液態(tài)直接升華成氣態(tài)，最終使物料脫水。當(dāng)然，干燥還可采用其它公知的方式，如噴霧干燥等，于此略述。

上述冷凍干燥的溫度可為-70～-60℃，例如-70℃、-69℃、-68℃、-65℃、、-64℃、-63℃、-62℃、-61℃或-60℃等。

實(shí)施例1

步驟一、將牦牛組織(例如牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮、牦牛骨等)洗凈后，放入組織粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速3000rpm rpm，溫度-10℃)中進(jìn)行組織粉碎，粉碎15min，得組織碎末。

步驟二、將組織碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，得組織液(溫度控制在-10℃)；

步驟三、將組織液置于低溫高速離心機(jī)(轉(zhuǎn)速11000rpm，溫度-10℃)中離心，離心10min，得上清液，濾渣另用。

步驟四、將上清液置于蛋白層析儀中(壓力0.08MPa，溫度-10℃)，得層析液。

步驟五、將層析液置于凍干機(jī)中進(jìn)行干燥(溫度-70℃)，得凍干晶體。

步驟六、將晶體稱重，分別裝于包裝容器中，即得牦牛膠原蛋白成品。

實(shí)施例2

步驟一、將牦牛組織(例如牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮、牦牛骨等)洗凈后，放入組織粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速5000rpm rpm，溫度0℃)中進(jìn)行組織粉碎，粉碎5min，得組織碎末。

步驟二、將組織碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，得組織液(溫度控制在0℃)；

步驟三、將組織液置于低溫高速離心機(jī)(轉(zhuǎn)速13000rpm，溫度-10℃)中離心，離心1min，得上清液，濾渣另用。

步驟四、將上清液置于蛋白層析儀中(壓力0.08MPa，溫度-10℃)，得層析液。

步驟五、將層析液置于凍干機(jī)中進(jìn)行干燥(溫度-70℃)，得凍干晶體。

步驟六、將晶體稱重，分別裝于包裝容器中，即得牦牛膠原蛋白成品。

實(shí)施例3

步驟一、將牦牛組織(例如牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮、牦牛骨等)洗凈后，放入組織粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速5000rpm rpm，溫度-10℃)中進(jìn)行組織粉碎，粉碎5min，得組織碎末。

步驟二、將組織碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，得組織液(溫度控制在0℃)；

步驟三、將組織液置于低溫高速離心機(jī)(轉(zhuǎn)速113000rpm，溫度0℃)中離心，離心1min，得上清液，濾渣另用。

步驟四、將上清液置于蛋白層析儀中(壓力0.12MPa，溫度0℃)，得層析液。

步驟五、將層析液置于凍干機(jī)中進(jìn)行干燥(溫度-60℃)，得凍干晶體。

步驟六、將晶體稱重，分別裝于包裝容器中，即得牦牛膠原蛋白成品。

實(shí)施例4

步驟一、將牦牛組織(例如牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮、牦牛骨等)洗凈后，放入組織粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速4000rpm，溫度-5℃)中進(jìn)行組織粉碎，粉碎5min，得組織碎末。

步驟二、將組織碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，得組織液(溫度控制在0℃)；

步驟三、將組織液置于低溫高速離心機(jī)(轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度-5℃)中離心，離心5min，得上清液，濾渣另用。

步驟四、將上清液置于蛋白層析儀中(壓力0.010MPa，溫度0℃)，得層析液。

步驟五、將層析液置于凍干機(jī)中進(jìn)行干燥(溫度-70℃)，得凍干晶體。

步驟六、將晶體稱重，分別裝于包裝容器中，即得牦牛膠原蛋白成品。

實(shí)施例5

步驟一、將牦牛組織(例如牦牛邊皮、牦牛蹄、牦牛頭皮、牦牛骨等)洗凈后，放入組織粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速4000rpm rpm，溫度-5℃)中進(jìn)行組織粉碎，粉碎10min，得組織碎末。

步驟二、將組織碎末置于酶解罐中，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，得組織液(溫度控制在-5℃)；

步驟三、將組織液置于低溫高速離心機(jī)(轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度-5℃)中離心，離心5min，得上清液，濾渣另用。

步驟四、將上清液置于蛋白層析儀中(壓力0.10MPa，溫度-5℃)，得層析液。

步驟五、將層析液置于凍干機(jī)中進(jìn)行干燥(溫度-65℃)，得凍干晶體。

步驟六、將晶體稱重，分別裝于包裝容器中，即得牦牛膠原蛋白成品。

由于本發(fā)明中所涉及的各工藝參數(shù)的數(shù)值范圍在上述實(shí)施例中不可能全部體現(xiàn)，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以想象到只要落入上述該數(shù)值范圍內(nèi)的任何數(shù)值均可實(shí)施本發(fā)明，當(dāng)然也包括若干項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)具體值的任意組合。此處，出于篇幅的考慮，省略了給出某一項(xiàng)或多項(xiàng)數(shù)值范圍內(nèi)具體值的實(shí)施例，此不應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的技術(shù)方案的公開不充分。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式選擇等，落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。