本發(fā)明涉及一種貽貝活性肽的制備方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
貽貝是一種高蛋白、低脂肪的食物。據(jù)分析，每100g干貽貝肉含粗蛋白高達52g，碳水化合物13g，脂肪7g。此外，還含有多種維生素及人體必需的鈣、磷、鐵、錳、鋅、硒、碘等多種微量元素。具有抗疲勞、降血壓、抗炎、增強免疫力等功效，被譽為“海中雞蛋”。
貽貝國內(nèi)養(yǎng)殖產(chǎn)量巨大，新鮮貽貝肉水分含量高，不易保存。故常制成“淡菜”保存，即將貽貝煮熟、去殼后曬干，這種方法比較原始，而且在晾曬過程中貽貝肉易發(fā)生質(zhì)變，一般做普通食品被消費者食用。
將新鮮貽貝去殼洗凈后經(jīng)過冷凍干燥、粉碎制成貽貝凍干粉也是目前貽貝后加工的一個方向。因其使用的唯一原料是新鮮貽貝肉，在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中未添加其他物質(zhì)，保存了原有物質(zhì)和抗炎成分，是一種比較優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品，但是冷凍干燥對設(shè)備投入要求高，且干燥成本較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。另外，貽貝凍干粉為不溶解狀態(tài)，難以制成沖劑等。也就是說上述冷凍干燥實質(zhì)是一種原料的粗加工，雖然較直接晾曬干燥質(zhì)量可控，但是并不能有效改變服用時營養(yǎng)成分的吸收效果，實質(zhì)是大大增加了原料的附加成本。
此外，可采用植物萃取的方式進行貽貝成分的提取，制成貽貝提取物。將新鮮貽貝洗凈后，采用溶解提取水溶性成分或脂溶性物質(zhì)，然后輔以淀粉或糊精等包埋吸附制成產(chǎn)品。鑒于動植物活性成分存在的差異，該方法對營養(yǎng)活性成分提取率低，原料利用率較低。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種貽貝活性肽的制備方法，主要包括以下步驟：
(1)前處理：選取新鮮貽貝，去除泥沙、殼后洗凈瀝干，將貽貝肉加入到濃度為0.2mol/L的氫氧化鈉溶液中攪拌均勻并浸泡2～3h，撈出清水沖洗2～3遍后瀝干，再加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的維生素C水溶液中攪拌均勻并浸泡20～30min，撈出清水沖洗2～3遍后瀝干；貽貝肉與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1kg：(1～1.5)L，貽貝肉與維生素水溶液的質(zhì)量體積比為1kg：(1～2)L；
(2)勻漿：每kg貽貝肉加0.5L水后，用膠體磨將貽貝磨漿得到貽貝肉漿液；
(3)酶解：按質(zhì)量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理1～2h；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5～9，按質(zhì)量比1％加入堿性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到貽貝多肽粉。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述中性蛋白酶是20萬U/g的酶制劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述堿性蛋白酶是20萬U/g的酶制劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，還包括包裝、檢驗的步驟。
在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟(6)所得提取液還采用分子截留量為10kDa的超濾膜進行過濾。
本發(fā)明在前期對原料進行復(fù)合預(yù)處理，然后復(fù)合使用兩種蛋白酶生產(chǎn)貽貝多肽，制成貽貝多肽產(chǎn)品。所得到的產(chǎn)品中氨基氮含量為15g/100mL左右，便于人體吸收，大大提高了原料的吸收利用率；另外，所得貽貝多肽水解液的抗氧化性能和抗細胞增殖能力都很好，細胞增殖抑制指數(shù)IR為70％左右，對羥自由基清除率為38％左右，可見本發(fā)明方法極大化地保留了貽貝的活性成分。本發(fā)明制得的產(chǎn)品為全水溶性，可制成沖劑等直接服用。在生產(chǎn)過程中添加全為食品級試劑，安全、可靠。產(chǎn)品質(zhì)量便于把控，有利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
甲醛滴定法測定氨基酸含量(ANN)：取步驟(5)得到的20ml水解液置于燒杯中，加水60mL，開動磁力攪拌器，用0.05mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定至pH為8.2。加入10mL甲醛溶液混勻，再用0.05mol/L氫氧化鈉溶液繼續(xù)滴定至pH為9.2，記下消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)的毫升數(shù)，同時取水80mL做試劑空白試驗。按X＝(V1-V2)×C×0.014×100/(5×V)計算氨基氮(ANN)含量，氨基氮含量與水解度成正相關(guān)，其中，X為樣品中氨基氮的含量(g/100mL)；V1為測定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)(mL)；V2為試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；V為樣品液取用量(mL)；C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)液的濃度(mol/L)；0.014為氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmoL)。
抗細胞增殖能力的測定：采用MTT法進行檢測；配制pH值為7.2的PBS溶液和濃度為200μg/ml的步驟(5)得到的水解液；取對數(shù)生長期的前列腺癌細胞DU-145制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，于5％CO2，37℃貼壁4h，然后加入步驟(5)得到的水解液，設(shè)3個平行孔，同時設(shè)不加藥對照組，置5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育48h，培養(yǎng)結(jié)束加入180μLMTT和20μL PBS繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸取96孔板的液體，加入150μL的DMSO，充分混合，置酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm測吸光度，按IR＝[(對照組A值—藥物組A值)/對照組A值]×100％計算細胞增殖抑制指數(shù)IR。
清除羥自由基能力的測定：取0.75mmol/L鄰二氮菲1mL裝于試管中，依次加入PBS(0.02mol/LpH 7.4)2mL，蒸餾水1mL，完全混勻后，加入0.75mmol/L的硫酸亞鐵1mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12％的過氧化氫1mL，于37℃水浴反應(yīng)90min，于536nm處測其吸光度，為Ap；用1mL蒸餾水代替1mL過氧化氫，為Ab；用樣品取代1mL蒸餾水，為As。羥自由基清除率按樣品對羥自由基清除率＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100％計算。
實施例1
(1)前處理：選取新鮮貽貝，去除泥沙、殼后洗凈瀝干，將貽貝肉加入到濃度為0.2mol/L的氫氧化鈉溶液中攪拌均勻并浸泡2h，撈出清水沖洗3遍后瀝干，再加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的維生素C水溶液中攪拌均勻并浸泡30min，撈出清水沖洗3遍后瀝干；貽貝肉與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1kg：1L，貽貝肉與維生素水溶液的質(zhì)量體積比為1kg：2L；
(2)勻漿：每kg貽貝肉加0.5L水后，用膠體磨將貽貝磨漿得到貽貝肉漿液；
(3)酶解：按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理2h；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的堿性蛋白酶在48℃條件下酶解2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到貽貝多肽粉。
測得步驟(5)水解液中氨基氮的含量為15.52g/100mL，細胞增殖抑制指數(shù)IR為71％，對羥自由基清除率為38％。
實施例2
(1)前處理：選取新鮮貽貝，去除泥沙、殼后洗凈瀝干，將貽貝肉加入到濃度為0.2mol/L的氫氧化鈉溶液中攪拌均勻并浸泡3h，撈出清水沖洗3遍后瀝干，再加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的維生素C水溶液中攪拌均勻并浸泡20min，撈出清水沖洗3遍后瀝干；貽貝肉與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1kg：1L，貽貝肉與維生素水溶液的質(zhì)量體積比為1kg：1.5L；
(2)勻漿：每kg貽貝肉加0.5L水后，用膠體磨將貽貝磨漿得到貽貝肉漿液；
(3)酶解：按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在42℃條件下酶解處理2h；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9，按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的堿性蛋白酶在45℃條件下酶解2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到貽貝多肽粉。
測得步驟(5)水解液中氨基氮的含量為14.88g/100mL，細胞增殖抑制指數(shù)IR為70％，對羥自由基清除率為38.5％。
實施例3
(1)前處理：選取新鮮貽貝，去除泥沙、殼后洗凈瀝干；
(2)勻漿：每kg貽貝肉加0.5L水后，用膠體磨將貽貝磨漿得到貽貝肉漿液；
(3)酶解：按質(zhì)量比1％加入中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理1～2h；用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，按質(zhì)量比1％加入堿性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到貽貝多肽粉。
測得步驟(5)水解液中氨基氮的含量為7.61g/100mL，細胞增殖抑制指數(shù)IR為36％，對羥自由基清除率為31％。
實施例4
(1)前處理：選取新鮮貽貝，去除泥沙、殼后洗凈瀝干，將貽貝肉加入到濃度為0.2mol/L的氫氧化鈉溶液中攪拌均勻并浸泡2～3h，撈出清水沖洗2～3遍后瀝干，再加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的維生素C水溶液中攪拌均勻并浸泡20～30min，撈出清水沖洗2～3遍后瀝干；貽貝肉與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1kg：(1～1.5)L，貽貝肉與與維生素水溶液的質(zhì)量體積比為1kg：(1～2)L；
(2)勻漿：每kg貽貝肉加0.5L水后，用膠體磨將貽貝磨漿得到貽貝肉漿液；
(3)酶解：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10％的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，按質(zhì)量比1％加入堿性蛋白酶在45～50℃條件下酶解2～3h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到貽貝多肽粉。
測得步驟(5)水解液中氨基氮的含量為8.53g/100mL，細胞增殖抑制指數(shù)IR為47％，對羥自由基清除率為27％。
實施例5
(1)前處理：選取新鮮貽貝，去除泥沙、殼后洗凈瀝干，將貽貝肉加入到濃度為0.2mol/L的氫氧化鈉溶液中攪拌均勻并浸泡3h，撈出清水沖洗3遍后瀝干，再加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2％的維生素C水溶液中攪拌均勻并浸泡20min，撈出清水沖洗3遍后瀝干；貽貝肉與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1kg：1L，貽貝肉與與維生素水溶液的質(zhì)量體積比為1kg：1.5L；
(2)勻漿：每kg貽貝肉加0.5L水后，用膠體磨將貽貝磨漿得到貽貝肉漿液；
(3)酶解：按質(zhì)量比1％加入20萬U/g的中性蛋白酶在42～45℃條件下酶解處理2h；
(4)滅酶：酶解結(jié)束后，升溫滅酶；
(5)過濾：加入珍珠巖、硅藻土等助濾劑，板框過濾得到水解液；
(6)濃縮：將水解液采用刮板濃縮器濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％的提取液；
(7)干燥：將所得提取液噴霧干燥得到貽貝多肽粉。
測得步驟(5)水解液中氨基氮的含量為10.39g/100mL，細胞增殖抑制指數(shù)IR為42％，對羥自由基清除率為31％。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。